王 濤 藺海燕 劉 芳 張傳森

(第二軍醫(yī)大學(xué), 1 學(xué)員旅8隊(duì), 2 人體解剖學(xué)教研室， 上海 200433)

運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病(motor neuron disease, MND)是一種由運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元慢性進(jìn)行性變性導(dǎo)致的神經(jīng)系統(tǒng)疾病,是臨床常見(jiàn)病,主要影響運(yùn)動(dòng)功能,通常在3年內(nèi)導(dǎo)致重大殘疾或者死亡[1]。發(fā)病率較高的MND主要有肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥(amyotrophic lateral sclerosis, ALS)、進(jìn)行性脊髓性肌萎縮(progressive spinal muscular atrophy, pSMA)和進(jìn)行性延髓性麻痹(progressive bulbar palsy, PBP)。

PBP及原發(fā)性側(cè)索硬化(primary lateral sclerosis, PLS)等[2,3],目前臨床尚缺乏有效的治療方法。對(duì)MND臨床、病理生理和遺傳異質(zhì)性的不斷探索促進(jìn)了臨床治療方案的發(fā)展[4],干細(xì)胞移植替代變性的神經(jīng)元是一種極具吸引力的治療方案,是當(dāng)前的研究熱點(diǎn)[5]。

研究發(fā)現(xiàn),移植的干細(xì)胞或神經(jīng)前體細(xì)胞容易受到神經(jīng)微環(huán)境的影響,在中樞神經(jīng)系統(tǒng)非神經(jīng)發(fā)生區(qū)及損傷區(qū)域主要分化為膠質(zhì)細(xì)胞[8],同時(shí)神經(jīng)前體細(xì)胞在損傷處的發(fā)育成熟也會(huì)受到阻礙[9]。因此目前通常將干細(xì)胞或神經(jīng)前體細(xì)胞誘導(dǎo)分化為運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元后進(jìn)行移植,但誘導(dǎo)方法存在耗時(shí)長(zhǎng)、分化率低、獲得的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元不夠成熟等問(wèn)題。本文對(duì)目前成體干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的方法進(jìn)行綜述,為自干細(xì)胞獲取分化率高且成熟的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元、耗時(shí)短的誘導(dǎo)分化辦法提供參考。

1 羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞

人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞由一組具有不同表型的細(xì)胞亞群組成,其中包含神經(jīng)祖細(xì)胞亞群。胡煒等[10]將第3代人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞用堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子預(yù)誘導(dǎo),然后以B27替代血清培養(yǎng)2d;當(dāng)細(xì)胞在膜上接近40%融合時(shí),撤去堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子,加入維甲酸、神經(jīng)生長(zhǎng)因子,在膜樣基質(zhì)上進(jìn)一步培養(yǎng)24h;撤去維甲酸,加入堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子繼續(xù)培養(yǎng)3d。檢測(cè)發(fā)現(xiàn),細(xì)胞不表達(dá)Nanog、 OCT4、 SOX2,較低表達(dá)巢蛋白,明顯表達(dá)突觸蛋白Ⅰ、Ⅲ、 ISL-1、 Hb9等蛋白,弱表達(dá)Olig2。表明在天然膜樣細(xì)胞外基質(zhì)加多種細(xì)胞因子誘導(dǎo)作用下,可以將羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞向運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元前體細(xì)胞分化。

2 毛囊神經(jīng)嵴干細(xì)胞

毛囊神經(jīng)嵴干細(xì)胞(hair follicle neural crest stem cells, hfNCSCs)是神經(jīng)嵴干細(xì)胞的一種,主要存在于毛囊隆突內(nèi),具有多向分化潛能,可自然分化為神經(jīng)元細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、施萬(wàn)細(xì)胞及黑素細(xì)胞等[11]。

2005年Amoh等[12]的研究顯示毛囊隆突部的干細(xì)胞呈nestin陽(yáng)性,經(jīng)10%胎牛血清誘導(dǎo)分化后,有48%的細(xì)胞可分化為神經(jīng)元。

課題組早期實(shí)驗(yàn)表明[13-14]SD大鼠hfNCSCs然后以2uM的RA和500ng/ml的Shh誘導(dǎo)7d,誘導(dǎo)后的細(xì)胞表達(dá)Tuj-1(50.35%)、NF(37.89%)、synapsin(26.28%),且對(duì)坐骨神經(jīng)損傷修復(fù)有重要作用。

武士興等[15]應(yīng)用RA、Shh聯(lián)合小分子化合物如8-Br-cAMP、Rp、TSA、RG108等對(duì)hfNCSCs向運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元誘導(dǎo)分化,基因和蛋白水平檢測(cè)表明,誘導(dǎo)14d后的細(xì)胞表達(dá)Tuj-1、MAP2、ChAT、HB9、OliG2及Islet-l等,約有50%的大鼠hfNCSCs被誘導(dǎo)分化為運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元樣細(xì)胞,且hfNCSCs源性運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元可以在坐骨神經(jīng)內(nèi)存活、增殖,并維持運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的功能與特性。

3 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)是骨髓中存在的一類(lèi)非造血組織干細(xì)胞,有高度增殖和自我更新能力,并具有多向分化潛能,且具有易獲得、易培養(yǎng)、低免疫原性、能在宿主體內(nèi)長(zhǎng)期存活等優(yōu)點(diǎn)。

Abdullah等[16]通過(guò)一個(gè)β個(gè)巰基乙醇(BME)的預(yù)誘導(dǎo)階段,然后使用1mm維甲酸和0.1ng∕ml音猬因子誘導(dǎo)4d,免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色表明,誘導(dǎo)后的細(xì)胞表達(dá)Map-2(90%)、ChAT(85%),有效地將小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元樣細(xì)胞。

孔衛(wèi)國(guó)等[17]在體外模擬運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的生長(zhǎng)發(fā)育環(huán)境,通過(guò)細(xì)胞傳代純化的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(hMSCs),在完全培養(yǎng)基中加入終濃度為10μg/ml堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)預(yù)處理24h后,用0.5μg/ml維甲酸(RA)和200ng/ml音猬因子(Shh)聯(lián)合誘導(dǎo)10d,可將 hMSCs誘導(dǎo)分化為具有典型神經(jīng)元形態(tài)的細(xì)胞,HB9、nestin和NSE的表達(dá)率分別為50.04%、25．00%和51.52%。表明用bFGF、RA、Shh聯(lián)合誘導(dǎo)可將hMSCs誘導(dǎo)分化為運(yùn)動(dòng)神經(jīng)樣細(xì)胞。

4 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞

人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells, hUCMSCs)是一類(lèi)具有自我更新、增殖和多向分化潛能的干細(xì)胞,在體外能向內(nèi)、中、外胚層的細(xì)胞分化[18-20]。

劉學(xué)元等[21]取第3代的hUCMSCs,調(diào)整細(xì)胞密度到1×106/ml,接種于6孔培養(yǎng)板中,以5μg/ml RA聯(lián)合300ng/ml Shh誘導(dǎo)25d。結(jié)果顯示,nestin和MAP-2陽(yáng)性率分別為21.71%和62．35%,Hb9陽(yáng)性表達(dá)33．62%。表明RA聯(lián)合Shh能促進(jìn)hUCMSCs向運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元樣細(xì)胞分化。

Bagher等[22]取人臍帶沃頓膠間充質(zhì)干細(xì)胞(Wharton’s Jelly-derived mesenchymal stem cells),10ng/ml FGF2、250μmol/L異丁基甲基黃嘌呤(isobutylmethylxanthine)和100umol/L巰基乙醇(2-mercaptoethanol)預(yù)培養(yǎng)24h, 然后100μg/ml Shh聯(lián)合 0.01μg/ml RA誘導(dǎo)1周,之后以100ng/ml GDNF和200ng/ml BDNF誘導(dǎo)7d。細(xì)胞學(xué)免疫熒光技術(shù)和qRT-PCR顯示細(xì)胞表達(dá)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元特異性標(biāo)記物。

5 脂肪干細(xì)胞

脂肪干細(xì)胞是存在于脂肪中的多能干細(xì)胞,具備自我更新能力與多向分化潛能,遺傳背景相當(dāng)穩(wěn)定,體內(nèi)植入后免疫排斥少,是一種比較理想的種子細(xì)胞。

Yang Liqing等[23]將人的脂肪干細(xì)胞(hADSCs)以1×104/cm2接種到培養(yǎng)板中,培養(yǎng)2天。在誘導(dǎo)前培養(yǎng)基(DF12, 20%胎牛血清,2%B27,10ng/ml FGF2, 250mmol/L isobutylmethylxanthine和100mmol/L 2-mercaptoethanol)中孵育6h,然后更換為誘導(dǎo)培養(yǎng)基1(DF12, 0.2% B27, 0.01mmol/L all-trans RA， 100ng/ml Shh)培養(yǎng)7d后,更換為誘導(dǎo)培養(yǎng)基2(DF12, 0.2% B27, 200ng/ml vitamin C, 100ng/ml brain-derived neurotrophic factor, and 100ng/ml glial cell-derived neurotrophic factor)。誘導(dǎo)5d后,胞質(zhì)向胞核收縮,形成細(xì)胞質(zhì)擴(kuò)展的收縮胞體。細(xì)胞體逐漸呈球形,表現(xiàn)出多極神經(jīng)元細(xì)胞樣的形狀。10%～20%的細(xì)胞為T(mén)uj-1+/nestin-。繼續(xù)培養(yǎng)至第14天,細(xì)胞的軸突變得更長(zhǎng),形成細(xì)胞網(wǎng),此時(shí)細(xì)胞開(kāi)始表達(dá)ChAT和NSE,且Tuj-1持續(xù)表達(dá)。表明人脂肪源性干細(xì)胞在RA和Shh的誘導(dǎo)下可分化為較為成熟的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元樣細(xì)胞。

Darvishi等[24]將取自SD大鼠腎周脂肪組織的脂肪干細(xì)胞通過(guò)2%的B27、20ng/ml的EGF和20ng/ml的bFGF轉(zhuǎn)分化為神經(jīng)干細(xì)胞,然后以1μg/ml的Shh和0.1mol/L的RA誘導(dǎo)5d,再加入GDNF、 CNTF、 BDNF、和NT-3等小分子誘導(dǎo)7d,蛋白和基因水平檢測(cè)顯示,誘導(dǎo)后的細(xì)胞表達(dá)ChAT(45%)、Map-2(58.2%)、Olig-2(97%)、Hb9(97%)等,上述結(jié)果表明,ADSCs分化為運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元樣細(xì)胞。

6 大鼠脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞源性的神經(jīng)干細(xì)胞

星形膠質(zhì)細(xì)胞(astrocyte)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)膠質(zhì)細(xì)胞的主要組成部分。邵志成等[25]在體外培養(yǎng)條件下,將星形膠質(zhì)細(xì)胞去分化成神經(jīng)干細(xì)胞;取2～6代的神經(jīng)球吹打成單細(xì)胞接種到含有RA和Shh誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)5d,然后加入濃度均為10ng/ml 的： BDNF、CNTF、GDNF、NT-3和2%FBS以及50ng/ml Shh再培養(yǎng)14d。結(jié)果顯示多數(shù)細(xì)胞共表達(dá)Tuj-1和ChAT,且93.3%的細(xì)胞表達(dá)Tuj-1,87.2%的細(xì)胞表達(dá)ChAT;27.6%的細(xì)胞表達(dá)MAP-2,24.4%的細(xì)胞表達(dá)HB9轉(zhuǎn)錄因子。證明了大鼠脊髓成熟的星形膠質(zhì)細(xì)胞在體外選擇培養(yǎng)基條件下培養(yǎng)去分化表達(dá)nestin。在EGF和bFGF存在的條件下可以長(zhǎng)出神經(jīng)球。神經(jīng)球不僅可以自我更新,大量擴(kuò)增,還可以分化成神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞,并證明了其為典形神經(jīng)干細(xì)胞,并且RA和Shh可以顯著地誘導(dǎo)其分化成為運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元。

7 神經(jīng)干細(xì)胞

神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells, NSCs)是指具有分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞的能力,能自我更新并提供足量神經(jīng)組織細(xì)胞。

杜紅梅等[26]從大鼠胚胎脊髓成功分離了神經(jīng)干細(xì)胞,應(yīng)用無(wú)血清培養(yǎng)技術(shù)分離培養(yǎng)脊髓神經(jīng)干細(xì)胞, 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的第3代神經(jīng)球,調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104/ml,添加誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基(DMEM/F12(1∶1, Hyclone),2%B27(Gibco),100U/ml青霉素,100μg/ml鏈霉素,Shh 300nmol/l+RA 2000nmol/l),6d 后換成分化培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng),每2d換液1次,培養(yǎng)14d。細(xì)胞大部分突起細(xì)長(zhǎng),相互連接形成致密網(wǎng)絡(luò)。ChAT陽(yáng)性細(xì)胞百分率為66.84%。研究顯示Shh、RA可不同程度地誘導(dǎo)脊髓神經(jīng)干細(xì)胞分化為運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元樣細(xì)胞。

Lee等[27]取胎兒腦組織中的神經(jīng)干細(xì)胞,然后以含100ng/ml的Shh、10%FBS的DMEM培養(yǎng)基誘導(dǎo)5～7d,誘導(dǎo)后的細(xì)胞表達(dá)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元特異性標(biāo)記物ChAT、Hb9 和Isl-1。

對(duì)比上述成體干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的方法,不難發(fā)現(xiàn)： RA和Shh在成體干細(xì)胞分化為運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的過(guò)程中起到關(guān)鍵作用,對(duì)不同成體干細(xì)胞,在將其誘導(dǎo)為運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元時(shí),RA和Shh的最佳工作濃度也不盡相同;RA和Shh聯(lián)合神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子明顯縮短了誘導(dǎo)時(shí)間、提高了運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元陽(yáng)性率;獲得的干細(xì)胞源性運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的成熟度也得到提高。

由此得出結(jié)論,在不改變基因序列的前提下,在成體干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元樣細(xì)胞的過(guò)程中, RA和Shh是不可或缺的誘導(dǎo)劑,BDNF、CTNF、GDNF等神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子能促進(jìn)成體干細(xì)胞源性運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的成熟,但耗時(shí)短、分化率高的誘導(dǎo)方法仍需進(jìn)一步探討,如血清替代物的使用,以期獲得理想的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元誘導(dǎo)方法,為運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病的治療提供一種有效的方法。