圖雷特綜合征(Tourette Syndrome, TS)是一種以多種運(yùn)動(dòng)抽動(dòng)和一種或多種發(fā)聲抽動(dòng)為特征的神經(jīng)發(fā)育性障礙，抽動(dòng)癥狀可能同時(shí)出現(xiàn)也可能在疾病的不同時(shí)段先后出現(xiàn)，具有突發(fā)、快速、無(wú)目的、不可自控的特點(diǎn)且復(fù)雜多變[1]。TS病因和發(fā)病機(jī)制迄今不明，目前認(rèn)為TS是遺傳因素與環(huán)境因素相互作用的結(jié)果，遺傳因素在TS的病因中起著重要作用，且TS為多基因作用的復(fù)雜疾病。神經(jīng)影像學(xué)、藥理學(xué)及分子遺傳學(xué)等的證據(jù)表明TS與多巴胺系統(tǒng)缺陷相關(guān)[2]。國(guó)內(nèi)外學(xué)者進(jìn)行了大量的探討，但研究結(jié)果可重復(fù)性較差[3]。DRD3主要分布在與認(rèn)知和情感等功能相關(guān)的腦區(qū)，DRD3受體在中腦邊緣多巴胺系統(tǒng)高表達(dá)，包括由紋狀核、中央杏仁核和NAc殼部組成的“擴(kuò)展的杏仁核系統(tǒng)(extended amygdala) ”。DRD3基因Ser9Gly(rs6280)多態(tài)性影響D3受體的親和力，導(dǎo)致受體蛋白中甘氨酸替代絲氨酸。DRD3基因rs6280位點(diǎn)多態(tài)性已廣泛應(yīng)用于神經(jīng)精神疾病的遺傳病因?qū)W研究，迄今已有大量研究對(duì)其不同易感位點(diǎn)與精神疾病的相關(guān)性進(jìn)行了探討[4]。本研究主要探討DRD3基因rs6280位點(diǎn)多態(tài)性與TS表型的相關(guān)性。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象 受試者為2009年12月～2015年12月就診于首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京安定醫(yī)院兒科門診及住院的TS患者以及招募的正常兒童青少年，使用自制的臨床信息調(diào)查表進(jìn)行基本資料的收集。由1位兒童精神科副主任或以上醫(yī)師按照美國(guó)精神障礙診斷與統(tǒng)計(jì)手冊(cè)第4版(DSM-IV)診斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行診斷和臨床分型。

1.1.1 TS患者共同入組標(biāo)準(zhǔn) (1)符合DSM-IV中TS診斷標(biāo)準(zhǔn)；(2)年齡6～18歲；(3)無(wú)其他中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病及嚴(yán)重軀體疾??；(4)漢族；(5)性別不限；(6)家族史陰性；(7)能完成所有測(cè)查；(8)患者及監(jiān)護(hù)人知情同意。入組全部TS患者160例，其中男128例，女32例，男∶女為4∶1；平均年齡(11.62±3.32)歲，根據(jù)是否有共患病及共患病情況進(jìn)行臨床分型，結(jié)果如下：(1)單純TS患者組：共入組43例，符合TS患者共同入組標(biāo)準(zhǔn)，排除注意缺陷多動(dòng)障礙(Attention Deficit Hyperactivity Disorder，ADHD)、強(qiáng)迫性障礙(Obsessive Compulsive Disorder，OCD)等共患病情況，無(wú)其他共患病情況；(2)TS+ADHD患者組：共入組47例，符合TS患者共同入組標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)符合DSM-IV中ADHD診斷標(biāo)準(zhǔn)，不符合DSM-IV中OCD診斷標(biāo)準(zhǔn)，無(wú)其他共患病情況；(3)TS+OCD患者組：共入組37例，符合TS患者共同入組標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)符合DSM-IV中OCD診斷標(biāo)準(zhǔn)，不符合DSM-IV中ADHD診斷標(biāo)準(zhǔn)，無(wú)其他共患病情況；(4)TS+ADHD+OCD患者組：共入組33例，符合TS患者共同入組標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)符合DSM-IV中ADHD及OCD診斷標(biāo)準(zhǔn)，無(wú)其他共患病情況。

1.1.2 正常對(duì)照受試者入組標(biāo)準(zhǔn) (1)健康兒童；(2)年齡6～18歲；(3)無(wú)中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病、嚴(yán)重軀體疾病及物質(zhì)濫用依賴等；(4)無(wú)精神疾病且家族中無(wú)精神疾病及自殺者；(5)漢族，無(wú)血緣關(guān)系，且與TS患者亦無(wú)血緣關(guān)系；(6)性別比例與全部TS組接近；(7)能完成所有測(cè)查；(8)受試者及監(jiān)護(hù)人知情同意。共納入90名受試者進(jìn)入對(duì)照組，其中男73名，女17名，男∶女為4.3∶1；平均年齡(11.42±2.37)歲。

本研究報(bào)首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京安定醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批，在取得正式批準(zhǔn)并獲得患者及家屬簽署知情同意后開展。所有受試者均對(duì)本次研究知情，受試者<7歲由監(jiān)護(hù)人簽署知情同意書，受試者≥7歲由患者及監(jiān)護(hù)人共同簽署知情同意書。全部TS患者性別(χ2=0.263，P=1.012)、年齡(F=1.836，P=0.231)與對(duì)照組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 收集晨空腹外周血5 ml，乙二胺四乙酸抗凝。采用全血基因組DNA提取試劑盒(PROMEGA,美國(guó))的離心柱法提取基因組DNA。全部DNA樣本均經(jīng)濃度以及純度檢測(cè)。

1.2.2 單核苷酸多態(tài)性(SNP)的挑選 通過(guò)美國(guó)國(guó)立生物信息情報(bào)中心檢索dbSNP (Datebase of Single Nuleotide Polymorphisms, dbSNP)數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/)，國(guó)際人類基因組單體型圖(HapMap)計(jì)劃(http://www.hapmap.org/)提供的漢族人群遺傳學(xué)數(shù)據(jù)及以往文獻(xiàn)報(bào)道[5,6]為依據(jù)，選取DRD3的SNP位點(diǎn)rs6280進(jìn)行基因多態(tài)性分析。

1.2.3 基因分型 采用TaqMan探針SNP基因分型技術(shù)進(jìn)行DRD3 SNP位點(diǎn)rs6280的分型,引物和探針由美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(Applied Biosystems Inc, ABI)定制,PCR反應(yīng)試劑TaqMan Universal PCR MasterMix 亦由ABI公司提供。PCR反應(yīng)體系為5μL,包括模板10 ng,2×TaqMan PCRMasterMix 2.5 μL,20×SNPAssay(包括引物和FAM /VIC探針)0.25 μL。反應(yīng)條件為95℃10 min；(92℃15 s, 60℃1 min)×40個(gè)循環(huán)。PCR反應(yīng)和熒光信號(hào)讀取均在ABI7900HT SequenceDetector(384孔板)上完成,以SDS2.4圖像分析軟件Allelic Discrimination程序進(jìn)行終點(diǎn)分析,通過(guò)檢測(cè)不同等位基因所標(biāo)的FAM和VIC熒光強(qiáng)度,判斷各待測(cè)樣本基因型為野生純合子、突變純合子還是雜合子。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS17.0軟件包進(jìn)行資料的數(shù)據(jù)分析，基因型頻率和等位基因頻率使用百分率[n(%)]表示，使用Hardy-Weinberg平衡法則進(jìn)行基因型及等位基因吻合度檢驗(yàn)，應(yīng)用χ2檢驗(yàn)，比較各病例組及對(duì)照組基因多態(tài)性差異是否有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05。多組之間兩兩比較的χ2檢驗(yàn)中，若與對(duì)照組比較，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05/(n-1)；所有組間兩兩比較，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05×2/n(n-1)。

2 結(jié)果

2.1 Hardy-Weinberg平衡的吻合度檢驗(yàn)結(jié)果 DRD3基因SNP位點(diǎn)rs6280基因型頻率在對(duì)照組(χ2=3.195，P=0.074)和全部TS組(χ2=0.302，P=0.582)，均達(dá)到Hardy-Weinberg平衡，均符合Hardy-Weinberg平衡，研究樣本具有群體代表性。

2.2 各組基因型和等位基因頻率比較 對(duì)各組基因型頻率及等位基因頻率進(jìn)行比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組基因型和等位基因頻率比較[n(%)]

3 討論

TS是一類臨床癥狀復(fù)雜的神經(jīng)精神發(fā)育性障礙，主要表現(xiàn)為運(yùn)動(dòng)和發(fā)聲抽動(dòng)，同時(shí)可伴有其他兒童情緒行為障礙，如ADHD、OCD、焦慮、抑郁、學(xué)習(xí)障礙、自傷及傷人，甚至出現(xiàn)類精神分裂癥樣癥狀。目前關(guān)于TS共患病及癥狀研究分歧明顯，有觀點(diǎn)認(rèn)為這些癥狀為TS疾病癥狀譜的一部分，另外一些觀點(diǎn)認(rèn)為是兩種或多種疾病共患[7]。已有研究顯示，TS病因復(fù)雜，確切病因不詳。已有的影像學(xué)和解剖學(xué)研究認(rèn)為基底節(jié)相關(guān)環(huán)路異常與多巴胺系統(tǒng)功能異常參與了疾病的發(fā)生發(fā)展，因此根據(jù)其臨床特征進(jìn)行細(xì)致的臨床分型，對(duì)于不同病因?qū)W的尋找可能是有利的。

Comings DE等[5]研究顯示TS與DRD3受體基因存在關(guān)聯(lián)；而隨后Brett P等[8]及Hebebrand J等[9]的研究沒(méi)有發(fā)現(xiàn)TS與DRD3受體基因存在關(guān)聯(lián)。Devor EJ等[10]對(duì)16個(gè)TS家系進(jìn)行研究，結(jié)果顯示DRD3受體基因多態(tài)性位點(diǎn)Bal I與 Msp I存在連鎖不平衡，但與TS不存在關(guān)聯(lián)。Diaz-Anzaldua A等[11]對(duì)110個(gè)核心家系進(jìn)行TDT分析研究發(fā)現(xiàn)TS與DRD3不存在關(guān)聯(lián)。Kowalska A等[12]對(duì)TS遺傳易感進(jìn)行綜述，發(fā)現(xiàn)DRD3基因關(guān)聯(lián)研究未得到較好的重復(fù)。

本研究團(tuán)隊(duì)2015年曾進(jìn)行病例對(duì)照研究顯示DRD3基因SNP位點(diǎn)rs6280基因型及等位基因頻率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；家系研究TDT結(jié)果顯示DRD3基因SNP位點(diǎn)rs6280等位基因無(wú)傳遞不平衡現(xiàn)象[14]。導(dǎo)致研究結(jié)果不一致的原因可能與TS本身異質(zhì)性較大有關(guān)，故在既往研究的基礎(chǔ)上，本研究根據(jù)TS共患病情況，對(duì)TS進(jìn)行深入的臨床分型，尋找不同亞型可能的遺傳學(xué)病因。通過(guò)本次臨床分型后的進(jìn)一步分析顯示，DRD3基因SNP位點(diǎn)rs6280在TS不同亞型患者及正常對(duì)照人群中頻率差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這提示DRD3基因SNP位點(diǎn)rs6280與TS及其亞型可能不存在關(guān)聯(lián)。

本研究存在的主要問(wèn)題是經(jīng)過(guò)具體的臨床分型，各型的樣本量較小，可能導(dǎo)致研究結(jié)果出現(xiàn)偏移。另外，主要根據(jù)主要的兩個(gè)共患病ADHD、OCD進(jìn)行臨床分型，出于樣本量的考慮，沒(méi)有納入如情緒障礙、學(xué)習(xí)障礙等其他共患病進(jìn)行探討；本研究?jī)H對(duì)DRD3基因的1個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)行了研究，在多基因遺傳病中，單個(gè)基因的致病作用可能是與其他多個(gè)致病基因以及環(huán)境之間交互作用的結(jié)果。因此，未來(lái)研究應(yīng)繼續(xù)擴(kuò)大樣本量，探討更符合疾病特征的臨床分型，進(jìn)行多個(gè)微效基因與環(huán)境相互作用的研究，以深入探討不同臨床分型的TS的遺傳機(jī)制。