劉偉杰， 尤琰婷， 趙若菲， 劉 聰， 孫 地， 朱靜榕

(江蘇師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/江蘇省藥用植物生物技術(shù)重點實驗室，江蘇徐州 221116)

生物表面活性劑是指由微生物代謝產(chǎn)生的一種可有效降低兩相界面張力的天然物質(zhì)，具有特殊的“兩親性”結(jié)構(gòu)。相對于化學(xué)表面活性劑，生物表面活性劑結(jié)構(gòu)復(fù)雜、分子量大、臨界膠束濃度一般更低，具有表面活性和穩(wěn)定性較高[1-2]、低毒或無毒、可生物降解等優(yōu)點[3]。因此它被廣泛用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、食品、環(huán)境修復(fù)、日用化學(xué)品、石油開采等多個領(lǐng)域。據(jù)預(yù)測，到2018年表面活性劑的需求量全球?qū)⑦_到410億美元，因此生物表面活性劑具有巨大的發(fā)展前景。本文綜述了生物表面活性劑產(chǎn)生菌的篩選、產(chǎn)物活性的檢測、降低生產(chǎn)成本的策略及其在農(nóng)業(yè)和工業(yè)領(lǐng)域應(yīng)用的研究進展，并對其未來的研究方向進行了展望。

1 生物表面活性劑種類及產(chǎn)生菌

根據(jù)結(jié)構(gòu)特征可以把生物表面活性劑分為脂肽類和脂蛋白類、糖脂類、磷脂類和脂肪酸類、中性脂類、顆粒生物表面活性劑以及多聚物生物表面活性劑[4-5]。目前已經(jīng)報道的生物表面活性劑產(chǎn)生菌主要有假單胞菌(Pseudomonassp.)[3]、地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)[6-7]、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)[8]、鏈霉菌(Streptomycessp.)[1]、不動桿菌(Acinetobactersp.)[9-10]、屎腸球菌(Enterococcusfaecium)[11]、Brevibacteriumaureum[12]等，其中Bacilluslicheniformis和Pseudomonassp.生產(chǎn)生物表面活性劑的研究較多，已經(jīng)被商業(yè)化應(yīng)用在多個領(lǐng)域。

1.1 生物表面活性劑產(chǎn)生菌的篩選

高效的篩選模型可以減少生物表面活性劑產(chǎn)生菌篩選的工作量。目前較為成熟的篩選模型主要有血平板法、十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)藍平板法和油平板法。

1.1.1 血平板篩選法 血平板篩選法的原理基于生物表面活性劑能使紅細胞發(fā)生溶血現(xiàn)象。如圖1-A所示，形成溶血圈的菌落可以作為待選菌株進一步研究其產(chǎn)生生物表面活性劑的能力[13]。血平板篩選法直觀，菌株生長周期短，但該方法不易滅菌，易引入雜菌，且容易產(chǎn)生假陽性。

1.1.2 CTAB藍平板篩選法 CTAB藍平板法是目前篩選生物表面活性劑產(chǎn)生菌較為常用的篩選模型，其原理是陰離子表面活性劑與CTAB能形成不溶性復(fù)合物，該復(fù)合物能與亞甲基藍產(chǎn)生顯色反應(yīng)。如圖1-B所示，形成藍色暈圈的菌落可以作為待選菌株進一步研究其產(chǎn)生生物表面活性劑的能力，且可以通過藍色暈圈的大小初步判斷菌株產(chǎn)生生物表面活性劑的能力[14]。該方法不易染菌，篩選效率高，但微生物生長周期長，且限于篩選陰離子表面活性劑產(chǎn)生菌。

1.1.3 油平板篩選法 油平板是將食用油或原油涂布在固體培養(yǎng)基上制成的平板，如圖1-C所示，形成明顯的噬油斑的菌株說明其能產(chǎn)生物表面活性劑、乳化碳氫化合物[15]，從而可以篩選出產(chǎn)生物表面活性劑的降烴菌，該方法操作簡單、高效、直觀。

2 生物表面活性劑性能評價指標(biāo)

生物表面活性劑的特性可以從排油活性、表面張力、乳化性、穩(wěn)定性、接觸角、產(chǎn)量等幾個方面進行分析。

2.1 擴油圈活性檢測

在培養(yǎng)皿中加入一定量的去離子水，然后加入適量的油在水表面形成穩(wěn)定的油膜，在油膜中心滴加待選菌株的發(fā)酵液上清[17]，通過測定擴油圈直徑的大小判斷生物表面活性劑的產(chǎn)量[18]，也可以通過在油膜相添加不溶于水的紅色蘇丹紅Ⅲ使擴油圈更加明顯[19]。

2.2 表面張力測定

測定待測菌株發(fā)酵液的表面張力可以更加準(zhǔn)確地分析生物表面活性劑的性能和濃度。其測定方法主要有威廉米吊片法、毛細上升法、環(huán)法、液滴分散法、泡壓法和懸滴法等[20]，近年來，表面張力測定儀被普遍使用，主要包括吊環(huán)法和鉑金板法。

2.3 臨界膠束濃度

臨界膠束濃度(critical micelle concentration，CMC)指表面活性劑分子形成膠束的最低濃度，是分析生物表面活性劑特性的重要參數(shù)。CMC值越小，表示其增溶、乳化、濕潤、去污等能力越強。當(dāng)溶液達到其臨界膠束濃度時，溶液的表面張力降到了最低。表面活性劑的種類、結(jié)構(gòu)特征、溫度、pH值等因素都會直接影響生物表面活性劑的臨界膠束濃度。

CMC的測定方法：利用表面張力儀分別測定不同濃度生物表面活性劑溶液的表面張力，隨著生物表面活性劑濃度的增加，溶液的表面張力逐漸下降，表面張力下降曲線的轉(zhuǎn)折點對應(yīng)的生物表面活性劑的濃度即為其臨界膠束濃度[21]。

2.4 乳化性能檢測

乳化性也是分析生物表面活性劑特性的重要參數(shù)，具體檢測方法：將待測菌株發(fā)酵液上清與油等混合后充分振蕩，靜置后測量乳化層高度，并計算相應(yīng)的乳化指數(shù)(乳化指數(shù)=乳化層高度/混合物高度)，據(jù)此評價生物表面活性劑的乳化性能[2]。

2.5 穩(wěn)定性分析

穩(wěn)定性檢測的方法：取純化的生物表面活性劑樣品配制成其臨界膠束濃度溶液，然后分別改變生物表面活性劑溶液的pH值、溫度、鹽濃度等理化因素，最后通過比較試驗組和對照組在擴油活性、表面張力值、乳化性等方面的變化，從而分析生物表面活性劑的穩(wěn)定性[1]。

2.6 接觸角測量

利用接觸角測定儀測接觸角也是評價生物表面活性劑特性的重要指標(biāo)。接觸角是指在氣、液、固三相交點處氣-液界面切線與固-液界面線的夾角，可用來表征液體的表面張力。Al-Wahaibi等利用該方法分析菌株BacillussubtilisB30產(chǎn)生的生物表面活性劑對培養(yǎng)基表面張力的影響[2]，如圖2所示，菌株B30產(chǎn)生的生物表面活性劑可以有效減少接觸角。

3 提高生物表面活性劑產(chǎn)量、降低生產(chǎn)成本的策略

雖然生物表面活性劑具有許多化學(xué)表面活性劑無法比擬的優(yōu)點，但生物表面活性劑產(chǎn)量低、生產(chǎn)成本相對較高限制了其大規(guī)模工業(yè)化應(yīng)用，市場份額小。因此提高生物表面活性劑的產(chǎn)量和活性、降低生產(chǎn)成本仍然是目前研究的熱點。

3.1 優(yōu)化培養(yǎng)條件

優(yōu)化目標(biāo)菌株的培養(yǎng)條件可以有效提高生物表面活性劑的產(chǎn)量，優(yōu)化范圍主要包括營養(yǎng)源(碳源、氮源、碳氮比、鹽離子濃度、微量元素種類和濃度等)和發(fā)酵條件(培養(yǎng)溫度、pH值、搖床轉(zhuǎn)速、接種量等)。

3.1.1 碳源優(yōu)化 碳源的種類顯著影響菌株所產(chǎn)生物表面活性劑的結(jié)構(gòu)和產(chǎn)量，且顯著影響其生產(chǎn)成本[22]，因此選擇高效廉價的碳源顯得尤為重要。大多數(shù)生物表面活性劑產(chǎn)生菌能利用常見的有機碳源如糖類、甘油、烷烴類、豆油等，部分Pseudomonas和Bacillus還能降解原油烴代謝產(chǎn)生生物表面活性劑。Xia等研究發(fā)現(xiàn)，假單胞菌生產(chǎn)鼠李糖脂的最佳碳源為豆油[23]，其他各類精化油如葵花籽油、紅花籽油、橄欖油有著相似的發(fā)酵效果[24]。以糖類和油脂類作為復(fù)合碳源的研究也屢見不鮮[25]。除了作為碳源，豆油等油脂類物質(zhì)在發(fā)酵過程中還能作為消泡劑和抑泡劑，避免所產(chǎn)泡沫對發(fā)酵的影響，提高生物表面活性劑的產(chǎn)量，但豆油的加入會影響后續(xù)表面活性劑的提純。

3.1.2 氮源優(yōu)化 在氮源優(yōu)化方面研究最為深入的是糖脂類生物表面活性劑。硝酸鹽和銨鹽是2種常見的無機氮源，研究表明，硝酸鹽更有利于鼠李糖脂的合成[26]，銨鹽作為氮源時，微生物會代謝產(chǎn)生大量的H+，降低發(fā)酵液pH值，影響鼠李糖脂的積累[27]。除了無機氮源外，以酵母粉、牛肉膏、蛋白胨等作為有機氮源的研究也較為常見。此外有研究表明，鼠李糖脂作為次級代謝產(chǎn)物其合成起始于氮源被消耗完后[26]，所以應(yīng)控制好培養(yǎng)基中的氮源量，使其既有利于菌株生長又有利于鼠李糖脂的合成。

3.1.3 其他條件優(yōu)化 鹽離子能維持細胞滲透壓平衡并能刺激細胞合成生物表面活性劑，但鹽離子濃度過高時會影響細胞膜通透性，抑制細胞的代謝和分泌，所以發(fā)酵生產(chǎn)生物表面活性劑過程中鹽離子濃度也是一個重要的控制參數(shù)。此外轉(zhuǎn)速和裝液量會影響溶氧量，溫度和pH值會影響菌體內(nèi)酶活和代謝物結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，這些都是發(fā)酵條件優(yōu)化過程中的重要參數(shù)。

3.2 添加促產(chǎn)因子

促產(chǎn)因子也能有效提高生物表面活性劑的產(chǎn)量。如氨基酸、金屬離子、酵母提取物和有機酸是常見的4類促產(chǎn)因子。金屬離子[28]和氨基酸[29]主要用來促產(chǎn)脂肽類生物表面活性劑，而酵母提取物[30]和有機酸[31]常用來促糖脂類生物表面活性劑的產(chǎn)生。Khan等研究發(fā)現(xiàn)，營養(yǎng)素能將生物表面活性劑的產(chǎn)量提高15%～25%[32]。

3.3 誘變育種獲得高產(chǎn)突變株

紫外誘變、化學(xué)試劑誘變、He-Ne激光誘變等技術(shù)是進一步提高目標(biāo)菌株生物表面活性劑產(chǎn)量和活性的有效途徑。如Lin等利用突變劑N-甲基-N-硝基-N-亞硝基胍(MNNG)對菌株BacilluslicheniformisJF-2進行誘變育種，通過篩選最后得到1株能將生物表面活性劑產(chǎn)量提高12倍的突變株BacilluslicheniformisKGL11[33]。轉(zhuǎn)座突變既可以獲得生物表面活性劑高產(chǎn)突變，還能鑒定到與生物表面活性劑合成相關(guān)的功能基因。侯巨梅等利用含轉(zhuǎn)座子Tn917構(gòu)建了假單胞桿菌BS1的突變體文庫，并篩選到1株突變體，其所產(chǎn)生的生物表面活性劑的乳化值明顯高于野生菌株[34]。

3.4 利用廢棄物生產(chǎn)生物表面活性劑

利用廉價的廢棄物代替昂貴的營養(yǎng)物質(zhì)可有效降低生物表面活性劑的生產(chǎn)成本并實現(xiàn)廢棄物的資源化利用，比如烹飪廢油、乳制品、糖加工廢棄物、農(nóng)業(yè)廢棄物、果蔬廢棄物、魚類廢棄物的水解物等[35]。Mercadé等首次利用橄欖油生產(chǎn)廢水，作為Pseudomonasaeruginosa的碳源發(fā)酵生產(chǎn)鼠李糖脂[36]；Fox等利用土豆加工廠的廢渣作為Bacillussubtilis的碳源發(fā)酵生產(chǎn)生物表面活性劑[37]；Reddy等從芒果核中提取了油脂用來發(fā)酵生產(chǎn)鼠李糖脂[38]；Gudia等利用玉米漿作為Pseudomonasaeruginosa的培養(yǎng)基發(fā)酵生產(chǎn)生物表面活性劑[8]。利用這些廢棄物既降低生物表面活性劑的生產(chǎn)成本又實現(xiàn)了廢棄物的資源化利用。

4 生物表面活性劑的應(yīng)用

4.1 原油開采領(lǐng)域

我國各油田大都已進入二次采油后期甚至三次采油階段，但是仍有大量的石油留在巖層無法驅(qū)出，利用生物表面活性劑提高驅(qū)油效率是目前的研究熱點[2，39-40]。二次采油指向油層注水補充地層壓力以將石油驅(qū)出，或在三次采油階段添加生物表面活性劑可以進一步提高石油的驅(qū)出率，外源添加生物表面活性劑產(chǎn)生菌，其能產(chǎn)生孔隙增溶、孔隙乳化現(xiàn)象，降低原油黏度和兩相間界面張力，改善巖石的疏水性質(zhì)，提高原油的流動性，從而提高采油量。

4.2 環(huán)境修復(fù)

在環(huán)境污染修復(fù)領(lǐng)域，生物表面活性劑主要用于土壤中重金屬的去除[41]、多環(huán)芳烴[42]和農(nóng)藥[43-45]等有機污染物的去除、海水或土壤環(huán)境中石油污染的去除[46]、疏通人工濕地[47]等。

4.3 醫(yī)藥領(lǐng)域和日用化妝品領(lǐng)域

生物表面活性劑，尤其是糖脂和脂肽，具有很高的藥用價值，可用于抗菌、抗病毒、抗炎和抗腫瘤等。研究發(fā)現(xiàn)，鼠李糖脂、槐糖脂等生物表面活性劑能抑制某些真菌和細菌的生長[48-50]，而生物表面活性劑的抗菌機制可能與其能破壞細菌的細胞質(zhì)膜有關(guān)。Duarte等研究發(fā)現(xiàn)，表面活性劑可有效抑制人胸腺癌細胞的生長和擴散[51]；Pradhan等研究發(fā)現(xiàn)，2種糖脂類生物表面活性劑對人類胚胎腎癌細胞HEK-293具有毒性作用[52]；Abdulsattar等研究發(fā)現(xiàn)，生物表面活性劑能有效抑制腫瘤細胞的活性[53]。此外生物表面活性劑還可以抑制或破壞多種病原菌生物被膜的形成[54-55]。生物表面活性劑憑借其良好的增溶、乳化、起泡、消泡、去污、濕潤等特性可用于護理用品和家居洗滌用品，如添加到沐浴露、洗滌劑、乳液中。化妝品需要長時間與人體皮膚接觸，所以對其安全性要求更高。

4.4 農(nóng)業(yè)和食品領(lǐng)域

生物表面活性劑在農(nóng)業(yè)中的應(yīng)用體現(xiàn)在其增強動植物對細菌的防御[49]和增強植物對肥料的吸收和利用上。植物葉片表面往往覆有一層表面張力較高的蠟質(zhì)，導(dǎo)致水溶性肥料很難濕潤葉片，影響肥料的利用效率，在水溶性肥料中添加一定量的生物表面活性劑可有效解決這個問題。王亮亮等研究了2種生物表面活性劑對不同水溶肥料潤濕性能的影響，結(jié)果表明，將生物表面活性劑控制在一定范圍內(nèi)即能對各種水溶性肥料起到良好的增濕效果[56]。Anjum等在食品工業(yè)探索了生物表面活性劑的應(yīng)用，研究發(fā)現(xiàn)，Bacillussp. MTCC 5877所產(chǎn)的生物表面活性劑能有效去除蔬菜表面重金屬殘留，并能減少生物被膜的形成從而有效洗脫蔬菜表面黏附的有害微生物，防止生物被膜的形成[25]。

4.5 提高酶活性

已有研究表明，生物表面活性劑能促進酶解作用。Zeng等研究發(fā)現(xiàn)，鼠李糖脂可以將纖維素酶活性和木聚糖酶活性分別提高5.0%、5.5%[57]；Callow等研究發(fā)現(xiàn)，鼠李糖脂可以將TrichodermareeseiRut C30產(chǎn)生的纖維素酶的最高酶活性提高68%[58]。

5 展望

生物表面活性劑目前已經(jīng)進入商業(yè)化生產(chǎn)階段，在多個領(lǐng)域表現(xiàn)出其獨特的優(yōu)勢[59]，但相對于化學(xué)表面活性劑，其生產(chǎn)成本相對較高，在以后的工作中以下幾個方面將成為研究重點：(1)構(gòu)建高產(chǎn)生物表面活性劑的基因工程菌，拓寬菌株的原料譜，減少副產(chǎn)物，減少其代謝旁路等；(2)開發(fā)廉價底物用來發(fā)酵生產(chǎn)生物表面活性劑，真正做到變廢為寶，同時解決廢棄物的堆積問題和發(fā)酵成本昂貴的問題；(3) 探索高效的生物表面活性劑提取和純化工藝，降低生產(chǎn)成本；(4)拓寬生物表面活性劑的應(yīng)用范圍。比如研究生物表面活性劑在發(fā)酵過程中對微生物利用營養(yǎng)物質(zhì)的影響，對細菌脫色不溶性染料的影響，以及對細菌產(chǎn)生物被膜能力的影響等；(5)挖掘新型生物表面活性劑產(chǎn)生菌。目前直接用于原油開采和環(huán)境工程的菌種并不多，其原因之一是這些菌株大都只具有分泌表面活性劑的能力而無其他特性(如耐熱性、耐鹽性、耐酸性等)，所以新型多功能生物表面活性劑產(chǎn)生菌的篩選仍然是未來的重點研究工作。