李桂蓮，王彥華，張曉霞，張國(guó)啟，牛 巖，朱偉然，鄭愛榮

(河南省飼草飼料站，河南 鄭州 450008)

在體外采用人工的方法培養(yǎng)動(dòng)物的卵母細(xì)胞或胚胎，可以獲得較多的胚胎量及更為優(yōu)質(zhì)的家畜品種。近年來，體外胚胎工程也帶來了較為可觀的經(jīng)濟(jì)效益，這項(xiàng)體外胚胎生產(chǎn)技術(shù)對(duì)家畜的繁殖以及養(yǎng)牛業(yè)的發(fā)展也頗為重要。

1 材料與方法

1.1 收集卵母細(xì)胞

在發(fā)情季節(jié)，選取宰殺后肉牛的卵巢，用30℃～35℃含有1%青霉素、鏈霉素的生理鹽水沖洗三遍，然后將其置于裝有青霉素、鏈霉素生理鹽水的保溫壺中，在1h～3h內(nèi)運(yùn)回到實(shí)驗(yàn)室。處于發(fā)情期的卵巢會(huì)有3 mm～6 mm直徑的明亮卵泡，采用卵泡穿刺法將卵泡中的卵母細(xì)胞抽吸出來，將其置于倒置顯微鏡下，挑選形態(tài)正常，胞質(zhì)均勻，帶有3層以上卵丘細(xì)胞的卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體(cumulus-oocyte complexes，COCs)，用含5% FBS的 TCM-199(Hank’S)清洗三遍。

1.2 卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)

將IVMD101成熟培養(yǎng)液(TCM-199，5% FBS，1μg/mL雌二醇，0.01 IU/mL 促卵泡素，5 μg/mL黃體生成素，200 mM丙酮酸鈉和50 mg/mL 慶大霉素)[1]平衡2h ，將清洗好的COCs以每500μL IVMD101培養(yǎng)液50枚COCs的密度置于38℃，5% CO2培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24 h。取出一部分卵母細(xì)胞用0.2%透明質(zhì)酸酶進(jìn)行處理，此步是為了更好的去除卵丘細(xì)胞，較好的觀察牛卵泡破裂和第一極體的排出情況，計(jì)算卵母細(xì)胞的成熟率。

1.3 體外受精

上浮法[2]處理冷凍精液：從液氮中取出凍存的牛精液，置于35℃水浴鍋中復(fù)蘇，將精液移入約1mL獲能液(Tyrode's albumin lactate pyruvate medium, TALP)[3]中，38℃，5% CO2，95% Air 及最大濕度培養(yǎng)箱孵育1h，10000 r/min離心10 min，棄上清，留出約0.2mL 液體，重復(fù)兩遍，預(yù)留的0.2mL 液體中加入0.5mL受精液(TALP、30 mg/mL肝素鈉、50 mg/mL慶大霉素和100 IU/mL 青霉素)[4]，將其置于38℃，5% CO2，95% Air 及最大濕度培養(yǎng)箱中懸浮1h ，取上層活力較高的精子，將其密度調(diào)整為3×106個(gè)/mL準(zhǔn)備受精，500 uL受精液50個(gè)COCs進(jìn)行受精，38℃，5% CO2，95% Air 及最大濕度培養(yǎng)箱中受精24h。

1.4 胚胎體外培養(yǎng)

將假定受精后的卵母細(xì)胞(卵母細(xì)胞周圍沒有顆粒細(xì)胞包圍)轉(zhuǎn)移至平衡好的mSOF[5](modified Synthetic Oviduct Fluid, m SOF)培養(yǎng)液(pH 7.2～7.3，107.70 mM氯化鈉、7.16 mM氯化鉀、1.19 mM磷酸二氫鉀、1.71 mM 氯化鈣、0.49 mM 氯化鎂、25.07 mM 碳酸氫鈉、3.30 mM 乳酸鈉、0.40 mM 丙酮酸鈉、1.46 mg/mL 谷氨酰胺、16 mg/mL 牛血清白蛋白、10μL/mL必需氨基酸、20μL/mL非必需氨基酸、1.3μg/mL酚紅、100μg/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素)中[1,5]，洗三遍，并將其置于38℃，5% CO2，95% Air 及最大濕度培養(yǎng)箱中，每48h 更換一半的SOF培養(yǎng)液。每隔24h觀察胚胎發(fā)育情況，計(jì)算各個(gè)時(shí)期的發(fā)育率。選擇形態(tài)正常，細(xì)胞團(tuán)致密的早期囊胚進(jìn)行胚胎移植。

1.5 受體母牛的選擇與胚胎移植

1.5.1 受體母牛的選擇

受體母牛選擇標(biāo)準(zhǔn)：身體健康、繁殖性能正常、泌乳性能良好、能自然發(fā)情。發(fā)情母牛的選擇尤為重要，可通過觀察公牛爬跨即母牛接受爬跨的程度確認(rèn)發(fā)情，次日再對(duì)發(fā)情母牛進(jìn)行直腸檢查，確認(rèn)母牛已排卵，即可作為胚胎移植的受體牛。發(fā)情后第7d可將體外培養(yǎng)的胚胎進(jìn)行移植，移植器插入受體牛陰道，到達(dá)子宮頸口時(shí)，用移植槍捅破外套填片，插入子宮頸，左手在直腸內(nèi)誘導(dǎo)使槍頭輕輕穩(wěn)妥地插入黃體側(cè)子宮角至大彎處，持移植器的右手推出胚胎。移植后大約2個(gè)月對(duì)母牛進(jìn)行直腸檢查，檢查移植母牛是否處于妊娠狀態(tài)，并計(jì)算妊娠率。

2 需要關(guān)注的問題

2.1 精子獲能

2.1.1 精子獲能定義

有學(xué)者發(fā)現(xiàn)“精子獲能”現(xiàn)象是在1951年提出。精子射入雌性動(dòng)物陰道內(nèi)時(shí)，精子并沒有獲得使卵子受精的能力，必須在雌性動(dòng)物生殖道內(nèi)發(fā)生一系列的生理變化，此時(shí)的精子才能獲得進(jìn)入到卵子的能力，這一過程稱為精子獲能。

2.1.2 精子獲能原理及生理變化

附睪形成的精子本身已經(jīng)具備受精的能力，但是由于附睪會(huì)分泌一種糖蛋白附著在精子表面，因此掩蓋了其受精能力。這種糖蛋白即含有唾液酸的糖蛋白，唾液酸糖蛋白一方面會(huì)使精子表面的特異性抗原不被激活，從而逃脫免疫機(jī)制的追捕，不發(fā)生自免疫反應(yīng)；一方面還會(huì)起到穩(wěn)定頂體前區(qū)的細(xì)胞膜作用，抑制精子的頂體反應(yīng)及受精能力。

精子進(jìn)入雌性動(dòng)物生殖道內(nèi)后，精子頂體表面的去能因子會(huì)在生殖道內(nèi)發(fā)生一系列的變化，生殖道分泌物譬如α、β淀粉酶、唾液酸酶等可以分解去能因子，使頂體膜中膽固醇和卵磷脂比率以及膜電位發(fā)生變化，頂體膜穩(wěn)定性降低，從而精子獲得受精能力，發(fā)生頂體反應(yīng)，釋放頂體酶，在頂體酶的作用下，精子能夠穿越放射冠和透明帶，進(jìn)入卵子內(nèi)部，從而完成受精。

2.1.3 精子獲能

精子剛進(jìn)入陰道時(shí)，不會(huì)發(fā)生獲能，穿過子宮頸時(shí)，去能因子降解，到達(dá)子宮內(nèi)膜時(shí)，產(chǎn)生獲能因子，在輸卵管完成獲能。

2.2 卵子受精

在受精時(shí)，卵子進(jìn)行減數(shù)第一次分裂產(chǎn)生一個(gè)初級(jí)卵母細(xì)胞和一個(gè)第一極體，初級(jí)卵母細(xì)胞進(jìn)行減數(shù)第二次分裂產(chǎn)生一個(gè)次級(jí)卵母細(xì)胞和一個(gè)第二極體，第一極體分裂產(chǎn)生兩個(gè)第二極體，但大多數(shù)哺乳動(dòng)物的第一極體不會(huì)進(jìn)行減數(shù)第二次分裂。因此，在卵黃膜和透明帶的間隙觀察到兩個(gè)極體時(shí)，即可判定卵子已經(jīng)完成了受精，此時(shí)的兩個(gè)極體即是第一極體和初級(jí)卵母細(xì)胞分裂產(chǎn)生的第二極體。

2.3 同期發(fā)情及激素選擇

2.3.1 發(fā)情周期定義及劃分

母牛性成熟后，在神經(jīng)和激素的作用下，卵巢出現(xiàn)周期性卵泡成熟和排卵。根據(jù)發(fā)情階段及生殖道的生理變化可以將母牛的發(fā)情周期分為四個(gè)階段：發(fā)情前期、發(fā)情期、發(fā)情后期、發(fā)情間期。根據(jù)卵巢的機(jī)能、形態(tài)變化及有無卵泡發(fā)育和黃體存在為依據(jù)可以將母牛的發(fā)情周期分為兩個(gè)階段：卵泡期和黃體期。

2.3.2 同期發(fā)情的原理

要達(dá)到同期發(fā)情，通常以兩分法為基準(zhǔn)。卵泡期即相當(dāng)于四分法的發(fā)情前期和發(fā)情期，周期性孕激素水平顯著下降，黃體退化，雌激素水平升高，卵泡開始發(fā)育，卵泡發(fā)育成熟后破裂并進(jìn)行排卵。黃體期即四分法的發(fā)情間期和發(fā)情后期，卵泡破裂后形成黃體，黃體分泌的孕激素水平顯著升高，抑制了卵泡的發(fā)育及成熟，母畜此時(shí)未表現(xiàn)發(fā)情，從黃體出現(xiàn)至退化，大約維持15d～17d，退化后進(jìn)入下一個(gè)卵泡期。因此要想達(dá)到同期發(fā)情，就需要控制黃體期的維持時(shí)間，使母畜的黃體同時(shí)退化，同時(shí)進(jìn)入下一個(gè)卵泡期。

2.3.3 同期發(fā)情激素選擇

2.3.3.1 孕激素

孕激素主要用來延長(zhǎng)黃體期。給母牛同時(shí)施用一定量的孕激素，抑制卵泡發(fā)育，使母牛處于不發(fā)情狀態(tài)，調(diào)整母牛黃體期，將母牛調(diào)整到同一階段時(shí)，停用孕激素，使母牛達(dá)到同期發(fā)情。

2.3.3.2 前列腺素及類似物

前列腺素及類似物主要用于縮短黃體期。給母牛施用前列腺素等類似物時(shí)，可達(dá)到溶解黃體的作用，此時(shí)黃體期被中斷，時(shí)間大大縮短，孕激素水平明顯下降，使母牛的卵泡期提前到來，從而調(diào)整母牛使其達(dá)到同期發(fā)情。

2.4 超數(shù)排卵及激素的選擇

2.4.1 超數(shù)排卵及原理

超數(shù)排卵是利用外源促排卵激素來誘發(fā)卵巢多卵泡發(fā)育，并能排出多個(gè)具有受精能力的卵母細(xì)胞。一般情況下，隨著母牛卵泡的發(fā)育，99%的有腔卵泡會(huì)發(fā)生閉鎖從而慢慢退化，大約只有1%能發(fā)育成熟并排出具有受精能力的卵母細(xì)胞，而超數(shù)排卵的原理就是在99%的有腔卵泡發(fā)生閉鎖之前，注射促排卵激素使卵泡不能閉鎖從而可以發(fā)育成熟，增加具有受精能力的卵母細(xì)胞的排出數(shù)目，從而使動(dòng)物能夠產(chǎn)多胎，提高優(yōu)良母畜的繁殖率，加速遺傳育種，促進(jìn)養(yǎng)牛業(yè)發(fā)展。

2.4.2 激素選擇

超數(shù)排卵主要選用促性腺激素而不是性激素，因?yàn)樾约に刂苯幼饔糜谛韵?，使用過多會(huì)造成性腺萎縮，而垂體釋放的促性腺激素作用于性腺，可以達(dá)到與性激素相同的效果但不會(huì)使性腺萎縮。促性腺激素譬如促卵泡素(FSH)，絨毛膜促性腺激素(HCG)、孕馬血清促性腺激素(PMSG)等[6]。可根據(jù)母牛的體重及超排次數(shù)確定使用劑量，一般外源劑量都要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于內(nèi)源劑量。