張 偉

（安慶醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校臨床醫(yī)學(xué)系，安徽安慶246052）

復(fù)合微生物制劑是指由兩種或兩種以上互不拮抗的微生物菌種經(jīng)科學(xué)配方合成的制劑，具有配伍合理、優(yōu)良性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。目前，關(guān)于復(fù)合微生物制劑功能的研究大多集中于改善土壤環(huán)境、提升水產(chǎn)動(dòng)物生長性能，改善水體環(huán)境等方面［1-3］。劉軍輝研究表明，施用復(fù)合微生物制劑后，鹽堿地土壤PH、EC值顯著下降，土壤微生物數(shù)量及肥力逐年提升，土壤改良效果明顯［4］。楊桂芳等研究表明，利用復(fù)合微生物制劑處理制藥廠廢水效果顯著優(yōu)于單一微生物處理，凈化制藥廢水效果顯著［5］。呂遠(yuǎn)蓉等研究表明，飼喂復(fù)合微生態(tài)制劑可顯著提升肉雞生長性能，同時(shí)腸道微生物菌群顯著改善，屠宰性能提高［6］。符冬巖等研究表明，在基礎(chǔ)飼料中添加復(fù)合微生物制劑可顯著提升鯉魚生產(chǎn)性能，同時(shí)浮游動(dòng)植物數(shù)量明顯下降，水質(zhì)顯著改善［7］。王雄等研究表明，在基礎(chǔ)飼料中添加復(fù)合微生物制劑可顯著提升銀鯽的血清溶菌酶活性［8］。而關(guān)于復(fù)合微生物制劑對動(dòng)物機(jī)體免疫功能的影響方面的研究報(bào)道尚不多見。因此，本文研究了自行研制的復(fù)合微生物制劑對小鼠生長性能及免疫功能的影響，以期為將來開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料及方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及儀器

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)用小鼠為6周齡昆明種雄性SPF級(jí)小鼠及基礎(chǔ)日糧購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。復(fù)合微生物制劑主要由光合細(xì)菌、乳酸菌、酵母菌及芽孢桿菌組成，自行研制。刀豆蛋白（ConA）、四甲基偶氮唑藍(lán)（NTT）購自美國sigma公司，新生牛血清購自美國gibco公司，綿羊紅細(xì)胞（SRBC）、淋巴細(xì)胞裂解液購自上海生工生物工程有限公司，二甲基亞砜（DMSO）購自天津瑞金特化學(xué)品公司。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

BS224S型電子天平，Thermo 3032型CO2培養(yǎng)箱，200XUSB型電子顯微鏡，D-35720型離心機(jī)，DG5033型酶標(biāo)儀，鍍鉻游標(biāo)卡尺，L5型紫外可見分光光度計(jì)，DK-S22恒溫水浴鍋，SW-CJ-2G超凈工作臺(tái)等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與飼養(yǎng)

選取200只6周齡的昆明種SPF級(jí)雄性小鼠，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，按體重隨機(jī)分為4組，每組50只，稱量其體重并記作為初始體重。分組飼養(yǎng)階段，將復(fù)合微生物制劑分別按照日糧的3%（低劑量組）、6%（中劑量組）和9%（高劑量組）加入到飼料中，攪拌均勻，直接飼喂。實(shí)驗(yàn)組小鼠采取同室分籠飼養(yǎng)，保持室內(nèi)清潔衛(wèi)生，控制晝夜交替12 h，溫度23℃，濕度50-60%，采食飲水自由，飼養(yǎng)6周后，饑餓過夜12 h，稱重、解剖采樣，進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)測定。

1.2.2 小鼠免疫器官指數(shù)測定

飼喂實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，每組取10只小鼠的脾臟和胸腺進(jìn)行稱重，并按照如下公式計(jì)算免疫器官指數(shù)：胸腺指數(shù)=胸腺質(zhì)量（mg）/小鼠體重（g）；脾臟指數(shù)=脾臟質(zhì)量（mg）/小鼠體重（g）。

1.2.3 小鼠血清半數(shù)溶血值HC50測定

飼喂實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，每組取10只小鼠，分別注射0.2 mL的2%綿羊紅細(xì)胞懸浮液進(jìn)行免疫，4 d后摘除眼球并分離血清，采用曹發(fā)昊的方法［9］進(jìn)行血清半數(shù)溶血值HC50測定。

1.2.4 小鼠溶血空斑數(shù)測定

飼喂實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，每組取10只小鼠，分別注射0.2 mL的2%綿羊紅細(xì)胞懸浮液進(jìn)行免疫，4d后摘除脾臟并制備脾細(xì)胞懸浮液，按照改良玻片法［10］測定溶血空斑數(shù)。

1.2.5 小鼠淋巴細(xì)胞增值能力測定

飼喂實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，每組取10只小鼠無菌取脾臟，制備細(xì)胞懸浮液，用刀豆蛋白（ConA）對脾淋巴細(xì)胞進(jìn)行刺激，采用MTT比色法［11］測定小鼠脾淋巴細(xì)胞的增值能力。

1.2.6 小鼠足跖厚度測定

飼喂實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，每組取10只小鼠分別于腹腔注射0.2 mL 5%的綿羊紅細(xì)胞，經(jīng)4 d致敏反應(yīng)，測量各小鼠左后足跖厚度。在測量部位二次注射20 μL 20%的綿羊紅細(xì)胞，進(jìn)行二次致敏，于24 h后測定其厚度，并計(jì)算2次測量的厚度差值。

1.2.7 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬率及吞噬指數(shù)測定

飼喂實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，每組取10只小鼠，分別于腹腔注射1 ml20%的雞紅細(xì)胞懸浮液，采用頸椎脫臼法處死，采用柳璐的方法［12］計(jì)算巨噬細(xì)胞數(shù)、吞噬雞紅細(xì)胞巨噬細(xì)胞數(shù)和被吞噬雞紅細(xì)胞數(shù)，并采用如下公式計(jì)算吞噬率和吞噬指數(shù)：吞噬百分率＝吞噬雞紅細(xì)胞的巨噬細(xì)胞數(shù)／計(jì)數(shù)的巨噬細(xì)胞數(shù)×100%；吞噬指數(shù)=被吞噬的雞紅細(xì)胞數(shù)總數(shù)／計(jì)數(shù)的巨噬細(xì)胞數(shù)。

1.2.8 小鼠碳粒廓清指數(shù)測定

末次飼喂1 h后，每組選取10只小鼠分別從鼠尾靜脈處注射0.05 mL·1og-1g的稀釋印度墨汁，并按如下公示計(jì)算碳粒廓清指數(shù)：K=（lgOD1-lgOD2）/（t2-t1），其中，OD1為t1時(shí)（2 min）血標(biāo)本光密度值，OD2為t2時(shí)（10 min）血標(biāo)本光密度值。

1.2.9 小鼠NK細(xì)胞活性測定

飼喂實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，每組取10只小鼠無菌取脾，并制備成單細(xì)胞懸浮液，采用乳酸脫氫酶法［13］分別測定反應(yīng)孔OD值、自然釋放孔OD值和最大釋放孔OD值，并按照如下公式計(jì)算NK細(xì)胞活性：NK細(xì)胞活性（%）=（反應(yīng)孔OD值-自然釋放孔OD值）/（最大釋放孔OD值-自然釋放孔OD值）×100%。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析

2.1 復(fù)合微生物制劑處理對小鼠生長性能的影響

不同劑量的復(fù)合微生物制劑處理對小鼠生長性能的影響如表1所示，對照組、低劑量組、中劑量組和高劑量組小鼠的初始體重統(tǒng)計(jì)學(xué)差異不顯著，但是經(jīng)飼養(yǎng)5周后，4組小鼠的平均體重分別增長 10.95 g、12.86 g、14.43 g 和 14.69 g。與對照組相比，低劑量組復(fù)合微生物制劑處理顯著增加小鼠的體重，中劑量組和高劑量組處理極顯著增加小鼠體重。這表明，復(fù)合微生物制劑處理會(huì)顯著增加的小鼠的生長性能。

表1 復(fù)合微生物制劑處理對小鼠生長性能的影響（n=10）

2.2 復(fù)合微生物制劑處理對小鼠免疫器官指數(shù)的影響

脾臟和胸腺是小鼠重要的免疫器官，對免疫功能具有顯著影響。復(fù)合微生物制劑處理對小鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)的影響如表2所示，與對照組相比，復(fù)合微生物制劑處理顯著增加了小鼠脾臟指數(shù)，其中，中劑量組增加幅度最大，達(dá)到1.47 mg·g-1；與對照組相比，低劑量組復(fù)合微生物制劑處理顯著增加小鼠胸腺指數(shù)，而中、高劑量組處理則極顯著增加小鼠胸腺指數(shù)，其中，高劑量組增加幅度最大，達(dá)到0.7 mg·g-1。這表明，復(fù)合微生物制劑處理可顯著增加小鼠的免疫器官指數(shù)。

表2 復(fù)合微生物制劑處理對小鼠免疫器官指數(shù)的影響（n=10）

2.3 復(fù)合微生物制劑處理對小鼠體液免疫功能的影響

血清半數(shù)溶血值HC50和溶血空斑數(shù)是衡量動(dòng)物體液免疫功能強(qiáng)弱的重要指標(biāo)。復(fù)合微生物制劑處理對小鼠血清半數(shù)溶血值HC50和溶血空斑數(shù)的影響如表3所示，與對照組相比，低劑量組復(fù)合微生物制劑處理可顯著增加小鼠血清半數(shù)溶血值和溶血空斑數(shù)，中、高劑量組復(fù)合微生物制劑處理可極顯著增加小鼠血清半數(shù)溶血值和溶血空斑數(shù)，其中高劑量組處理增加幅度最大，分別達(dá)到18.05，24.5。這表明，低劑量復(fù)合微生物制劑處理可顯著增加小鼠體液免疫功能，中、高劑量組處理可極顯著增加小鼠體液免疫功能。

表3 復(fù)合微生物制劑處理對小鼠體液免疫功能的影響（n=10）

2.4 復(fù)合微生物制劑處理對小鼠細(xì)胞免疫功能的影響

淋巴細(xì)胞增值能力和足跖厚度與小鼠細(xì)胞免疫功能強(qiáng)弱息息相關(guān)。復(fù)合微生物制劑處理對小鼠細(xì)胞免疫功能的影響如表4所示，與對照組相比，低、中劑量組復(fù)合微生物制劑處理顯著增強(qiáng)小鼠的淋巴細(xì)胞增長能力，高劑量組處理極顯著增強(qiáng)小鼠淋巴細(xì)胞增長能力，最大增幅達(dá)到0.075；與對照組相比，低、中劑量組復(fù)合微生物制劑處理顯著增加了足跖厚度，高劑量組處理極顯著增強(qiáng)小鼠足跖厚度，最大增幅達(dá)到0.15 mm。這表明，低、中劑量的復(fù)合微生物制劑處理可顯著增加小鼠的細(xì)胞免疫功能，而高劑量組的復(fù)合微生物制劑可極顯著增加小鼠的細(xì)胞免疫功能。

表4 復(fù)合微生物制劑處理對小鼠細(xì)胞免疫功能的影響（n=10）

2.5 復(fù)合微生物制劑處理對小鼠巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響

巨噬細(xì)胞是動(dòng)物免疫細(xì)胞的重要類型，通過吞噬病原體來實(shí)現(xiàn)機(jī)體的免疫功能。復(fù)合微生物制劑處理對小鼠巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響如表5所示，與對照組相比，低劑量的復(fù)合微生物制劑處理可顯著提升小鼠巨噬細(xì)胞的吞噬率、吞噬指數(shù)及碳粒廓清指數(shù)；與對照組相比，中、高劑量組復(fù)合微生物制劑處理可極顯著提高小鼠巨噬細(xì)胞的吞噬率、吞噬指數(shù)及碳粒廓清指數(shù)，增幅分別達(dá)到12.8%、0.11及1.95。這表明，低劑量的復(fù)合微生物制劑處理可顯著提升小鼠巨噬細(xì)胞吞噬功能，中、高劑量復(fù)合微生物制劑處理可極顯著提升小鼠巨噬細(xì)胞的細(xì)胞吞噬功能。

表5 復(fù)合微生物制劑處理對小鼠巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響（n=10）

2.6 復(fù)合微生物制劑處理對小鼠NK細(xì)胞活性的影響

自然殺傷細(xì)胞（natural kill cell，NK）是動(dòng)物體內(nèi)一類與B、T淋巴細(xì)胞并列的非常重要的免疫細(xì)胞，具有殺傷介質(zhì)、識(shí)別靶細(xì)胞等重要功能，不僅與自身免疫調(diào)節(jié)、抗病毒感染等息息相關(guān)，而且與時(shí)常參與超敏反應(yīng)等的發(fā)生。復(fù)合微生物制劑處理對小鼠NK細(xì)胞活性的影響如圖1所示，與對照組相比，低、中、高劑量組復(fù)合微生物制劑處理均可顯著提升NK細(xì)胞的活性，其中，高劑量組復(fù)合微生物制劑處理提升幅度最大，達(dá)到79.58%。這表明，復(fù)合微生物制劑處理可顯著提升自然殺傷細(xì)胞的活性，提升免疫功能。

3 結(jié)論

動(dòng)物的免疫系統(tǒng)由免疫器官、細(xì)胞、分子等組成，是機(jī)體發(fā)生免疫反應(yīng)的物質(zhì)基礎(chǔ)。免疫器官指數(shù)是初步衡量機(jī)體免疫功能的指標(biāo)，而以B、T細(xì)胞為主的體液免疫和細(xì)胞免疫則是反應(yīng)機(jī)體免疫調(diào)節(jié)功能的重要參數(shù)，巨噬細(xì)胞的吞噬能力是衡量動(dòng)物機(jī)體非特異性免疫功能強(qiáng)弱的重要指標(biāo)，NK細(xì)胞是與B、T細(xì)胞并列的第三類群淋巴細(xì)胞，其活性高低與機(jī)體免疫功能強(qiáng)弱顯著相關(guān)。因此，本研究從免疫器官指數(shù)、體液免疫、細(xì)胞免疫、巨噬細(xì)胞吞噬及NK細(xì)胞活性等方面研究了復(fù)合微生物制劑處理對小鼠免疫功能的影響，結(jié)果表明，復(fù)合微生物制劑不僅提升了小鼠的生長性能而且顯著提高了小鼠的機(jī)體免疫功能，其中尤以中、高劑量處理效果最佳。

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