王若珺 李若瑜

(北京大學(xué)第一醫(yī)院皮膚性病科 北京大學(xué)真菌和真菌病研究中心 皮膚病分子診斷北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100034)

皮膚是人體與外界環(huán)境的重要屏障，寄居著豐富的微生物群落，包括細(xì)菌、真菌、病毒等，通常不具有致病性，起到抵御外界病原微生物侵入、防止水分丟失等作用。在濕潤(rùn)、干燥、脂溢性等不同環(huán)境的皮膚部位，微生物的群落構(gòu)成具有很大差異[1]。隨著對(duì)真菌內(nèi)基因組轉(zhuǎn)錄間隔區(qū) (internal transcribed spacer, ITS)高通量測(cè)序研究的深入，真菌微生態(tài)與皮膚疾病之間的關(guān)系逐漸引起人們重視。目前已證實(shí)，在銀屑病、特應(yīng)性皮炎、脂溢性皮炎等皮膚疾病中，皮膚真菌微生態(tài)會(huì)出現(xiàn)變化。本文將就皮膚正常真菌微生態(tài)構(gòu)成、微生態(tài)研究方法學(xué)以及真菌微生態(tài)與皮膚疾病間關(guān)系3方面分別進(jìn)行綜述。

1 皮膚正常真菌微生態(tài)

皮膚表面的正常細(xì)菌和真菌菌群相對(duì)穩(wěn)定[1]。按照生理學(xué)特征可將皮膚分為四類：濕潤(rùn) (肘窩、腘窩、腹股溝、手指縫、足趾縫和鼻孔)、干燥 (前臂、小魚際、臀部)、脂溢 (鼻唇溝、面頰、眉心、外耳道、耳后皺襞、枕后、胸骨柄和后背)和足趾甲[2]。既往對(duì)皮膚細(xì)菌微生態(tài)的研究顯示，正常的細(xì)菌群落主要由厚壁菌門 (Firmicutes)、變形菌門 (Proteobacteria)、擬桿菌門 (Bacteroidetes)和放線菌門 (Actinobacteria)構(gòu)成[2]。細(xì)菌微生態(tài)的復(fù)雜性和穩(wěn)定性在不同皮膚部位差別很大，而不同個(gè)體相似的生理環(huán)境中微生態(tài)群落構(gòu)成相似。例如，外耳道和耳后等脂溢性環(huán)境主要為葡萄球菌和丙酸桿菌，而腋下、腹股溝等濕潤(rùn)環(huán)境則主要為棒狀桿菌[2]。

真菌培養(yǎng)已經(jīng)證實(shí)，人類正常皮膚中存在馬拉色菌屬、念珠菌屬等多種真菌。馬拉色菌屬 (Malasseziaspp.)是人體皮膚最常見的正常寄生菌，具有親脂性，生長(zhǎng)需要皮脂腺分泌的脂質(zhì)化合物，在前額、前臂、腹股溝、耳后、肘窩等部位含量最豐富[3]。馬拉色菌包括糠秕馬拉色菌 (M.furfur)、合軸馬拉色菌 (M.sympodialis)、球形馬拉色菌 (M.globosa)、限制馬拉色菌 (M.restricta)、厚皮馬拉色菌 (M.furfur)等14個(gè)菌種，其中11種參與人體皮膚微生態(tài)構(gòu)成[4]。馬拉色菌屬不同分離株的生長(zhǎng)速度不同，糠秕馬拉色菌和球形馬拉色菌生長(zhǎng)速度快，實(shí)驗(yàn)室分離率高，曾被認(rèn)為是皮膚中含量最豐富菌種。既往的定量培養(yǎng)方法顯示，后背皮膚糠秕馬拉色菌含量較高，頭皮和前額皮膚球形馬拉色菌含量較高[5]。然而，近年的分子學(xué)研究則發(fā)現(xiàn)，皮膚中的含量最豐富的為球形馬拉色菌和限制馬拉色菌，含量遠(yuǎn)高于糠秕馬拉色菌[6-8]。進(jìn)一步微生態(tài)分析證實(shí)，手臂、足部、軀干和頭面部等不同部位的皮膚中，馬拉色菌屬的結(jié)構(gòu)有明顯區(qū)別，但不同個(gè)體的相同身體部位差別不大[4]。在外耳道、耳后和前額皮膚中，限制馬拉色菌含量最豐富，后背、枕后部和腹股溝區(qū)球形馬拉色菌最豐富，鼻孔、肘窩等其他身體部位則為馬拉色菌的混合菌種，而足部的真菌構(gòu)成多樣化，包括馬拉色菌、曲霉 (Aspergillus)、隱球菌 (Cryptococcus)、紅酵母 (Rhodotorula)和附球菌 (Epicoccum)等[4]。

2 皮膚真菌微生態(tài)的研究方法

與皮膚的細(xì)菌微生態(tài)相比，真菌微生態(tài)的研究難度更大，其原因主要有3方面因素：①真菌在皮膚中的含量遠(yuǎn)低于細(xì)菌，難以獲得充分樣本量。②人類細(xì)胞DNA會(huì)污染樣本，干擾特異性區(qū)段的擴(kuò)增。③真菌具有堅(jiān)固的細(xì)胞壁，難以破壞細(xì)胞壁并提取出高質(zhì)量遺傳物質(zhì)，其難度遠(yuǎn)高于細(xì)菌和人類細(xì)胞[9]。皮膚取材的方法包括拭子擦取和刀片刮取，有時(shí)需要使用擦拭-刮取-擦拭等組合方法。為獲得最大微生物量，通常取材前12～24 h內(nèi)不允許洗浴或使用潤(rùn)膚劑。取材后的樣本應(yīng)凍存于-20℃或-80℃條件。DNA提取需要使用較強(qiáng)的物理方式裂解真菌，常用滾珠和酶混合裂解方法。目前針對(duì)真菌微生態(tài)的DNA提取步驟尚缺少方法學(xué)上的對(duì)照研究[9]。

真菌菌種的分子鑒定基于高通量測(cè)序方法，目前常用的測(cè)序區(qū)段包括18S rRNA區(qū)和位于18S、5.8S和28S rRNA區(qū)內(nèi)的ITS區(qū)[10]。以全基因組DNA為模板，應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (polumerase chain reaction, PCR)擴(kuò)增上述區(qū)段，可得到數(shù)百萬至數(shù)億條序列，根據(jù)95%～99%相似度分類至種水平的分類操作單位 (operational taxonomic units, OTUs)，與Pubmed等數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行人工比對(duì)，即可通過DOTUR等軟件分析樣本微生物的結(jié)構(gòu)[2]。微生物群落的豐度 (richness)和均衡度 (evenness)可以用香農(nóng)多樣性指數(shù) (Shannon’s diversity index)表示，其他分析方法還包括：β多樣性，用于樣品兩兩之間的比較分析，衡量不同樣本間的變化；排序分析，包括主成分分析 (principal component analysis, PCA)和主坐標(biāo)分析 (principal coordinates analysis, PCoA)，用于研究樣本間相似性和差異性；聚類分析，通過繪制熱圖 (heatmap)，提示樣本間菌屬菌落構(gòu)成的相似性；物種進(jìn)化樹的樣本群落分布圖，可將不同樣本的構(gòu)成在物種進(jìn)化分類樹中顯示，提示樣本間的進(jìn)化關(guān)系。此外，宏基因組測(cè)序能夠反映樣本中功能基因的構(gòu)成[1-2]。

3 真菌微生態(tài)與皮膚疾病

既往對(duì)人體腸道、口腔等器官的微生態(tài)研究已證實(shí)，真菌微生態(tài)的改變與多種疾病的發(fā)生相關(guān)。例如，腸道內(nèi)真菌菌落結(jié)構(gòu)和細(xì)菌結(jié)構(gòu)密切關(guān)聯(lián)，真菌菌落的變化會(huì)引起腸壁中炎癥反應(yīng)增強(qiáng)，誘發(fā)炎癥性腸病[11]；口腔黏膜真菌微生態(tài)發(fā)生變化與慢性黏膜念珠菌感染有關(guān)[12]。隨著皮膚真菌微生態(tài)研究的深入，已證實(shí)皮膚真菌的菌落構(gòu)成改變與多種炎癥性、感染性皮膚疾病的發(fā)生相關(guān)。

特應(yīng)性皮炎是由皮膚干燥及屏障功能受損所導(dǎo)致的慢性瘙癢性皮膚炎癥性疾病。既往對(duì)細(xì)菌16s rRNA DNA區(qū)的測(cè)序分析結(jié)果顯示，特應(yīng)性皮炎患者皮膚中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生紊亂，細(xì)菌微生態(tài)的整體多樣性降低，葡萄球菌屬相對(duì)增多，特別是金黃色葡萄球菌比例明顯增加，并且與特應(yīng)性皮炎嚴(yán)重程度正相關(guān)[13]。金黃色葡萄球菌可通過產(chǎn)生肽鏈形成生物膜形成定植，以及釋放δ-毒素誘導(dǎo)肥大細(xì)胞脫顆粒誘發(fā)皮膚過敏反應(yīng)[14-16]。對(duì)特應(yīng)性皮炎患者皮膚樣本中真菌D1/D2 LSU rDNA的序列分析研究顯示，患者皮膚中馬拉色菌屬仍為主要菌屬，占63.2%～72.7%，其中限制馬拉色菌和球形馬拉色菌在患者和健康人中含量均最高，而二者的含量比在不同嚴(yán)重程度患者皮膚中具有差異，其中輕度特應(yīng)性皮炎患者最高[含量比=(3.1～3.4)∶1]，高于中度和重度特應(yīng)性皮炎患者[含量比分別為 (2.1～4.1)∶1和 (1.1～1.4)∶1][17]。此外，患者皮膚中非馬拉色菌屬酵母菌的多樣性增加，并且與病情嚴(yán)重程度呈正比，其中白念珠菌、阿薩希毛孢子菌、異常維克漢姆酵母等酵母菌在患者中檢出率增高。主坐標(biāo)分析顯示，健康人、輕中度患者和重度患者在PCoA維度上具有差異，說明真菌微生態(tài)的改變與疾病嚴(yán)重程度相關(guān)[17]。

銀屑病是慢性炎癥性皮膚疾病，病因包括遺傳易感性和環(huán)境暴露等。既往皮膚細(xì)菌微生態(tài)的研究已證實(shí)，銀屑病的發(fā)生與溶血性鏈球菌定植和葡萄球菌超抗原激活T淋巴細(xì)胞相關(guān)，而其他可能的相關(guān)微生物還包括金黃色葡萄球菌、馬拉色菌、白念珠菌和人乳頭瘤病毒等[18]。Alekseyenk等[18]研究顯示，銀屑病患者皮膚細(xì)菌微生態(tài)的豐度及均衡度均較正常人降低 (P<0.01)，β多樣性分析則顯示患者皮損處的微生態(tài)組內(nèi)差異高于健康對(duì)照，提示患者皮膚的壓力環(huán)境會(huì)對(duì)正常菌群進(jìn)行篩選。另一項(xiàng)基于鳥槍法宏基因組學(xué)測(cè)序 (shotgun metagenomics sequencing)的研究發(fā)現(xiàn)，銀屑病與葡萄球菌含量增加相關(guān)，并且兩株含葡萄球菌分泌抗原基因的菌株在病損部位含量豐富[19]。迄今為止，僅有1項(xiàng)針對(duì)銀屑病皮膚真菌微生態(tài)的研究，結(jié)果顯示，銀屑病皮損部位的真菌微生態(tài)的整體豐度升高，而馬拉色菌含量較正常對(duì)照降低，且球形馬拉色菌和限制馬拉色菌在患者皮膚中含量偏低，真菌菌落結(jié)構(gòu)PCoA分析顯示銀屑病患者與健康人群具有差異[20-21]。此外，研究顯示馬拉色菌定植水平與銀屑病面積與嚴(yán)重程度指數(shù)評(píng)分 (psoriasis area and severity index, PASI)無明顯相關(guān)性[22]。

脂溢性皮炎是一種常見的皮膚疾病，表現(xiàn)為紅斑上覆著油膩的黃色鱗屑、結(jié)痂，常累及頭皮、耳后、眉弓、鼻唇溝和前胸等皮脂腺豐富部位。既往基于培養(yǎng)的研究認(rèn)為糠秕馬拉色菌為脂溢性皮炎的主要致病菌，而分子學(xué)研究則顯示，與脂溢性皮炎的發(fā)生相關(guān)的真菌主要是球形馬拉色菌和限制馬拉色菌，并且與其中特定亞種相關(guān)[23]。對(duì)脂溢性皮炎患者頭皮皮膚的高通量測(cè)序研究證實(shí)，患者和健康對(duì)照頭皮中含量最高的真菌分別是擔(dān)子菌和子囊菌，但患者子囊菌門的支頂孢屬和青霉菌屬的含量明顯升高[24]。Soares等[25]研究發(fā)現(xiàn)，脂溢性皮炎患者皮損中限制馬拉色菌含量最高，球形馬拉色菌次之，合軸馬拉色菌、厚皮馬拉色菌僅在少數(shù)樣本中測(cè)出，另有3個(gè)新馬拉色菌屬種型與脂溢性皮炎的發(fā)生有關(guān)。令人意外的是，糠秕馬拉色菌遺傳物質(zhì)在皮膚中含量較低，甚至在部分標(biāo)本中通過高通量測(cè)序方法未被檢出，但可能受到取材方法等因素影響。[25]。此外，馬拉色菌菌種水平微生態(tài)結(jié)構(gòu)相近的樣本，亞種水平構(gòu)成仍有較大區(qū)別，但亞種與疾病間關(guān)系尚需進(jìn)一步研究[25]。

痤瘡為人類最常見的皮膚疾病，以往認(rèn)為，革蘭陽(yáng)性親脂性的痤瘡丙酸桿菌是導(dǎo)致痤瘡發(fā)生的關(guān)鍵因素。微生態(tài)研究顯示，痤瘡丙酸桿菌是未治療痤瘡患者和健康人皮膚表面含量最豐富的細(xì)菌，系統(tǒng)使用異維A酸或抗生素治療后，其含量顯著下降[26]。然而，Dreno等[27]進(jìn)行的另一項(xiàng)微生態(tài)分析顯示，患者面部的痤瘡丙酸桿菌的相對(duì)含量反而較健康對(duì)照低，僅占細(xì)菌菌群的不到2%，而葡萄球菌在患者痤瘡、膿皰等病損部位的含量較高，與疾病嚴(yán)重度正相關(guān)。除丙酸桿菌和葡萄球菌外，馬拉色菌在所有痤瘡炎性皮損處中均可檢測(cè)到，是痤瘡中真菌菌群的主要成分，其中限制馬拉色菌含量最高，提示馬拉色菌可能與痤瘡的產(chǎn)生有關(guān)[28]。此外，Barnard等[29]的宏基因組學(xué)研究顯示，痤瘡患者皮膚微生態(tài)中各功能基因間的相互平衡性起到重要作用，其作用甚至高于某些單一菌株的作用。

皮膚慢性潰瘍?cè)谔悄虿?、老年人和免疫受損患者等人群中具有較高致殘率和致死率。微生態(tài)分析顯示，在皮膚慢性傷口中，細(xì)菌微生態(tài)穩(wěn)定性降低則愈合速度加快，截肢、傷口惡化或骨髓炎等臨床并發(fā)癥減少；系統(tǒng)性使用抗生素可使微生態(tài)穩(wěn)定性降低，促進(jìn)愈合[30-31]。此外，皮膚慢性傷口的真菌微生態(tài)在不同時(shí)間和個(gè)體中也具有顯著差異，并可提示疾病預(yù)后。傷口真菌微生態(tài)子囊菌比例升高，愈合時(shí)間延長(zhǎng)；而出現(xiàn)截肢等臨床并發(fā)癥時(shí)，真菌微生態(tài)豐度和穩(wěn)定性均升高，這可能是由于微生態(tài)穩(wěn)定性高伴隨生物膜形成，導(dǎo)致愈合不良[32]。

除上述皮膚疾病外，Gupta等[33]對(duì)花斑糠疹中馬拉色菌的研究顯示，與正常皮膚相比，皮損處球形馬拉色菌、合軸馬拉色菌和糠秕馬拉色菌的分離率提高。實(shí)時(shí)定量熒光PCR分析顯示，花斑糠疹皮損處檢出率最高的馬拉色菌種分別為球形馬拉色菌 (95.8%)、限制馬拉色菌 (91.7%)和合軸馬拉色菌 (50.0%)，均明顯高于正常皮膚[34]。然而目前尚無針對(duì)花斑糠疹的細(xì)菌和真菌微生態(tài)研究。

4 總結(jié)與展望

人類與細(xì)菌、真菌、病毒等微生物的群落長(zhǎng)期處于共生關(guān)系，微生物在人體生理和免疫功能等方面都發(fā)揮重要作用。近年來，皮膚微生態(tài)的研究發(fā)展迅速，已有較多研究證實(shí)細(xì)菌微生態(tài)與多種炎癥性疾病、感染性疾病的發(fā)生和慢性傷口的愈合有關(guān)。

真菌的微生態(tài)研究?jī)H在最近幾年才開始引起重視。目前皮膚真菌微生態(tài)的研究尚存在取材、DNA提取等方法學(xué)上的困難，需要進(jìn)一步優(yōu)化研究方法，以得到準(zhǔn)確、可靠的數(shù)據(jù)。皮膚的微生態(tài)環(huán)境中，真菌與細(xì)菌之間具有復(fù)雜的相互作用。目前研究已證實(shí)，包括馬拉色菌在內(nèi)的多種真菌菌落構(gòu)成會(huì)對(duì)銀屑病、特應(yīng)性皮炎、脂溢性皮炎等疾病產(chǎn)生影響，但仍需要更多的大規(guī)模對(duì)照研究證實(shí)。

此外，皮膚真菌感染是常見的皮膚科疾病，皮膚癬菌病、花斑糠疹、黏膜念珠菌病等感染性疾病的發(fā)生與真菌微生態(tài)之間的關(guān)系也逐漸引起學(xué)者重視。皮膚和黏膜的真菌感染常見于免疫功能受損人群，例如，HIV感染患者口腔內(nèi)的細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)改變，穩(wěn)定性降低，而真菌菌群多樣性提高，念珠菌、曲霉等機(jī)會(huì)致病菌含量增多，可能與慢性黏膜真菌感染有關(guān)[35]。白念珠菌通過細(xì)胞膜Dectin-1蛋白識(shí)別，經(jīng)SYK和CARD9途徑介導(dǎo)產(chǎn)生炎癥反應(yīng)[36-37]。研究已證實(shí)，dectin-1缺陷小鼠腸道內(nèi)念珠菌含量提高，其他酵母菌減少，并且腸道炎癥反應(yīng)增強(qiáng)，提示真菌微生態(tài)的改變與炎癥性腸病的產(chǎn)生密切相關(guān)[38]。HIV感染患者以及先天性CARD9、DECTIN1基因缺陷等免疫受損的患者，皮膚真菌微生態(tài)的改變與疾病發(fā)生的關(guān)系有待未來進(jìn)一步研究。