李俊燕+張付云+李妍+付松巖+石楠

摘 要：為獲得卡拉膠酶高產(chǎn)菌株，用卡拉膠作為唯一碳源，對(duì)從海水中分離的13株菌進(jìn)行篩選，進(jìn)而采用分子生物學(xué)方法將3號(hào)菌株鑒定為γ變形桿菌綱的Gilvimarinus屬，并應(yīng)用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)對(duì)3號(hào)菌株降解活性培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果顯示較優(yōu)培養(yǎng)條件為：蛋白胨0.20%，卡拉膠0.20%，瓊脂0.001%，氯化鈉2%，磷酸氫二鉀10%，硫酸鎂0.5%，磷酸鐵0.1%，氯化鈣1%，25 ℃培養(yǎng)2 d。

關(guān)鍵詞：卡拉膠酶，細(xì)菌，篩選，優(yōu)化

卡拉膠（Carrageen，CAS 9000-07-1），又叫做愛爾蘭苔菜膠，或者是鹿角菜膠以及角叉菜膠，卡拉膠的降解產(chǎn)物是卡拉膠寡糖。卡拉膠寡糖有著更高的活性，而且其分子鏈上的中間活性基團(tuán)得到了最大程度的暴露?？ɡz寡糖具有眾多生物特性，如免疫調(diào)節(jié)活性[1-3]、恢復(fù)造血功能[4]、抗氧化活性[5-6]、抑制血管生成作用[7]、抗病毒活性[8-10]和抗腫瘤活性[11]。就目前來看卡拉膠工業(yè)有很好的研究?jī)r(jià)值，而這些高價(jià)值研究的重要方向就是將海洋微生物當(dāng)中卡拉膠降解酶進(jìn)行精準(zhǔn)的提取，然后把提取的酶用來制造卡拉膠活性片段。目前主要有三種方法來制造卡拉膠寡糖，分別是物理降解法[12]，化學(xué)降解法[13-15]以及酶降解法[16-21]。化學(xué)降解，物理降解法由于不易控制反應(yīng)條件，所得寡糖產(chǎn)物復(fù)雜，使其在生產(chǎn)上受到限制，酶降解法雖然專一性強(qiáng)，但因?yàn)槠浠盍^低及成本高，要實(shí)現(xiàn)規(guī)模化生產(chǎn)也是困難的[22]，微生物酶的活性是非常高的，同時(shí)其專一性也是比較高的，在對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行降解的時(shí)候，硫酸根并沒有遭受損害，所以可以很好的對(duì)卡拉膠進(jìn)行降解。通過對(duì)海洋微生物的液體培養(yǎng)物進(jìn)行提取，就可以進(jìn)行卡拉膠酶的制備，這些酶不僅是工具酶，在工業(yè)上也可以作為特殊酶，這就使得海洋微生物成了非常好的生物資源庫。因此篩選卡拉膠降解菌具有很重要的實(shí)際意義。

1 材料與方法

1.1 菌株與培養(yǎng)基

13株海洋細(xì)菌：大連海洋大學(xué)實(shí)驗(yàn)室前期分離所得。

卡拉膠液體培養(yǎng)基：卡拉膠2 g、硝酸鈉2 g、氯化鈉15 g、磷酸氫二鉀1 g、硫酸鎂0.05 g、磷酸鐵0.01 g、氯化鈣0.1 g、蒸餾水1 000 mL（卡拉膠固體培養(yǎng)基再添加20 g瓊脂即可）。

DNS溶液（250 mL）：1.625 g DNS溶于少量蒸餾水中，溶解后移入250 mL容量瓶中，加入2 mol/L NaOH 65 mL，再加入11.25 g丙三醇，搖勻、冷卻后定容至250 mL。

1.2 儀器與設(shè)備

S.HS-1300凈化工作臺(tái)（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）；YX280B手提式不銹鋼蒸汽消毒器（上海三申醫(yī)療器械有限公司）；101-2B電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海實(shí)驗(yàn)儀器廠有限公司）；721型可見分光光度計(jì)（上海光譜儀器有限公司）；Sartorius精密天平（北京賽多利儀器系統(tǒng)有限公司）；HH.BII.420-BS電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）；ZD-85A測(cè)速氣浴振蕩器（蘇州威爾實(shí)驗(yàn)用品有限公司）；XMTB儀表恒溫水浴鍋（北京金北德工貿(mào)有限公司）；90-2離心機(jī)（上海手術(shù)器械廠）。

1.3 菌株的篩選與鑒定

1.3.1 菌種的初篩和復(fù)篩 將13株海洋細(xì)菌菌株接種于卡拉膠液體篩選培養(yǎng)基內(nèi)，25 ℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)3 d，離心取發(fā)酵上清液，測(cè)定酶活力。將篩選后的卡拉膠酶產(chǎn)生菌3號(hào)菌株接種于卡拉膠唯一碳源平板培養(yǎng)基上，25 ℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)3 d，觀察菌落形態(tài)。

1.3.2 菌株酶活力測(cè)定[23] 發(fā)酵液經(jīng)離心取上清液，DNS法[24]測(cè)酶活力。一個(gè)酶活力單位（U）定義為：在32 ℃下，每分鐘產(chǎn)生1 μg還原糖（以半乳糖計(jì)）的酶的劑量。

1.3.3 分子生物鑒定3號(hào)菌株 3號(hào)菌株的16SrDNA序列測(cè)定由上海生工生物擴(kuò)增、測(cè)序，并與核酸數(shù)據(jù)庫（Bibosomal Database Project）進(jìn)行比對(duì)，利用MEGA5進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建。

1.4 菌株產(chǎn)酶發(fā)酵條件的優(yōu)化

1.4.1 碳源對(duì)酶活力的影響 分別將瓊脂、卡拉膠、酵母膏、麥芽糖、葡萄糖、乳糖作為唯一碳源替代卡拉膠液體篩選培養(yǎng)基中的卡拉膠，25 ℃搖床培養(yǎng)2 d，DNS法測(cè)酶活力，篩選較優(yōu)碳源。

1.4.2 氮源對(duì)酶活力的影響 分別將氯化銨、硝酸銨、硝酸鉀、酵母膏，蛋白胨，牛肉膏，硫酸銨作為卡拉膠液體篩選培養(yǎng)基中的唯一氮源，25 ℃搖床培養(yǎng)2 d，DNS法測(cè)酶活力，篩選較優(yōu)氮源。

1.4.3 卡拉膠濃度對(duì)酶活力的影響 分別將015%、0.1%、0.05%濃度的卡拉膠加入以卡拉膠為唯一碳源，蛋白胨為唯一氮源的液體培養(yǎng)基，25 ℃搖床培養(yǎng)2 d，DNS法測(cè)酶活力，篩選較優(yōu)卡拉膠濃度。

1.4.4 瓊脂濃度對(duì)酶活力的影響 分別將0010%、0.005%、0.001%濃度的瓊脂加入以015%卡拉膠為唯一碳源，蛋白胨為唯一氮源的液體培養(yǎng)基，25 ℃搖床培養(yǎng)2 d，DNS法測(cè)酶活力，篩選較優(yōu)瓊脂濃度。

1.4.5 氯化鈉濃度對(duì)酶活力的影響 分別將25%、2%、1.5%濃度的氯化鈉加入以0.15%卡拉膠為唯一碳源，蛋白胨為唯一氮源，瓊脂濃度為0.005%的液體培養(yǎng)基，25 ℃搖床培養(yǎng)2 d，DNS法測(cè)酶活力，篩選較優(yōu)氯化鈉濃度。

1.4.6 硝酸鈉濃度對(duì)酶活力的影響 分別將025%、0.2%、0.15%濃度的硝酸鈉加入以015%卡拉膠為唯一碳源，蛋白胨為唯一氮源，瓊脂濃度為0.005%，氯化鈉濃度為1.5%的液體培養(yǎng)基，25 ℃搖床培養(yǎng)2 d，DNS法測(cè)酶活力，篩選較優(yōu)硝酸鈉濃度。

1.4.7 磷酸氫二鉀濃度對(duì)酶活力的影響 分別將1.25%、1.00%、0.75% 濃度的磷酸氫二鉀加入以0.15%卡拉膠為唯一碳源，蛋白胨為唯一氮源，瓊脂濃度為0.005%，氯化鈉濃度為1.5%，硝酸鈉濃度為0.2%的液體培養(yǎng)基，25 ℃搖床培養(yǎng)2 d，DNS法測(cè)酶活力，篩選較優(yōu)磷酸氫二鉀濃度。endprint

1.4.8 正交試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)數(shù)據(jù)基礎(chǔ)上，利用正交試驗(yàn)方法[25]對(duì)3號(hào)活性菌株的產(chǎn)酶條件進(jìn)行優(yōu)化，其因素水平表見表1，按照正交試驗(yàn)表進(jìn)行試驗(yàn)，正交試驗(yàn)方案見表2，對(duì)不同培養(yǎng)條件下菌株產(chǎn)酶的結(jié)果用分光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)定，根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果得出較優(yōu)產(chǎn)酶條件。

根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果，確定出較優(yōu)發(fā)酵條件。按條件配制培養(yǎng)基，接種（2%接種量）培養(yǎng)。取出較優(yōu)條件下培養(yǎng)的發(fā)酵液離心去菌體，用DNS法測(cè)其酶活力。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)酶活性菌株的篩選結(jié)果

將13株海洋細(xì)菌菌株接種于卡拉膠液體培養(yǎng)基中，25 ℃振蕩培養(yǎng)3 d，發(fā)酵上清液測(cè)定卡拉膠酶活性，測(cè)定結(jié)果如圖1所示，3號(hào)菌株具有較高的卡拉膠降解活性，將3號(hào)菌株接種于以卡拉膠為唯一碳源的培養(yǎng)基上，25 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)3 d，菌落長(zhǎng)出情況如圖2。菌株在卡拉膠培養(yǎng)皿上長(zhǎng)勢(shì)良好，且菌落周圍有透明圈和凹陷出現(xiàn)，表明該菌株具有降解卡拉膠的活性，能夠產(chǎn)生卡拉膠酶。

2.2 分子生物鑒定16SrDNA測(cè)序鑒定結(jié)果

將測(cè)序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行序列比對(duì)，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果如圖3所示，3號(hào)菌株與分離自韓國(guó)濟(jì)州島的Gilvimarinus agarilyticus strain M5c同源性最高，因此將3號(hào)菌株鑒定為γ變形桿菌綱Gilvimarinus屬，由于Gilvimarinus agarilyticus strain M5c具有降解瓊脂糖活性，因此后續(xù)研究可對(duì)3號(hào)菌株是否具有潛在的瓊脂糖酶活性，進(jìn)行深入研究。

2.2 發(fā)酵條件的優(yōu)化結(jié)果

2.2.1 碳源對(duì)菌株酶活力的影響 卡拉膠為唯一碳源時(shí)，3號(hào)菌株的卡拉膠酶活性最高，結(jié)果如圖4所示。

2.2.2 氮源對(duì)菌株酶活力的影響 當(dāng)以卡拉膠為唯一碳源，添加蛋白胨為唯一氮源時(shí)3號(hào)菌株降解卡拉膠的活性最高，結(jié)果如圖5所示。

2.2.3 卡拉膠濃度對(duì)酶活力的影響 當(dāng)以卡拉膠為唯一碳源，蛋白胨為唯一氮源時(shí)，不同濃度卡拉膠對(duì)3號(hào)菌株產(chǎn)酶活力有影響，當(dāng)卡拉膠濃度為0.15%，酶活力最高，如圖6所示。

2.2.4 瓊脂濃度對(duì)酶活力的影響 當(dāng)以0.15%卡拉膠為唯一碳源，蛋白胨為唯一氮源時(shí)，不同濃度瓊脂對(duì)3號(hào)菌株產(chǎn)酶活力有影響，當(dāng)瓊脂濃度為0.005%，酶活力最高，其發(fā)酵液卡拉膠酶活力如圖7所示。

2.2.5 氯化鈉濃度對(duì)酶活力的影響 當(dāng)以015%卡拉膠為唯一碳源，蛋白胨為唯一氮源，瓊脂濃度為0.005%時(shí)，不同濃度氯化鈉對(duì)3號(hào)菌株產(chǎn)酶活力有影響，當(dāng)氯化鈉濃度為1.5%時(shí)，酶活力最高，卡拉膠酶活力如圖8所示，因此正交因素考察2.0%、1.5%和1.0%三個(gè)水平。

2.2.6 硝酸鈉濃度對(duì)酶活力的影響 當(dāng)以015%卡拉膠為唯一碳源，蛋白胨為唯一氮源，瓊脂濃度為0.005%，氯化鈉濃度為1.5%時(shí)，不同濃度硝酸鈉對(duì)3號(hào)菌株產(chǎn)酶活力有影響，當(dāng)硝酸鈉濃度為0.2%，酶活力最高，其發(fā)酵液卡拉膠酶活力如圖9所示。

2.2.7 磷酸氫二鉀的濃度對(duì)酶活力的影響 當(dāng)以0.15%卡拉膠為唯一碳源，蛋白胨為唯一氮源，瓊脂濃度為0.005%，氯化鈉濃度為1.5%，硝酸鈉濃度為0.2%時(shí)，不同濃度磷酸氫二鉀對(duì)3號(hào)菌株產(chǎn)酶活力有影響，當(dāng)硝磷酸氫二鉀濃度為1.0%，酶活力最高，其發(fā)酵液卡拉膠酶活力如圖10所示。

2.2.8 培養(yǎng)條件正交試驗(yàn)結(jié)果 在單因素試驗(yàn)結(jié)果及前人文獻(xiàn)（溫度和時(shí)間）基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)方案對(duì)3號(hào)活性菌株進(jìn)行酶活力條件優(yōu)化，測(cè)定結(jié)果通過標(biāo)準(zhǔn)曲線的公式計(jì)算出酶活力值記錄于表3。

按照下表結(jié)果，確定較優(yōu)發(fā)酵條件為：培養(yǎng)溫度25 ℃，培養(yǎng)時(shí)間為2 d，蛋白胨濃度為0.30%，卡拉膠濃度為0.15%，瓊脂濃度為0.005%、氯化鈉濃度為2%、母液添加量15% 。

2.2.9 正交試驗(yàn)驗(yàn)證 依據(jù)正交試驗(yàn)方案對(duì)活性菌株進(jìn)行酶活力條件優(yōu)化實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，理論分析出較優(yōu)條件與兩個(gè)較優(yōu)正交試驗(yàn)方案進(jìn)行驗(yàn)證，記錄結(jié)果于表4。

由表4結(jié)果可知，卡拉膠酶活性較好的培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度25 ℃，培養(yǎng)時(shí)間為2 d，蛋白胨濃度為0.20%，卡拉膠濃度為0.20%，瓊脂濃度為0.001%、氯化鈉濃度為2%、母液添加量10%，此條件下3號(hào)菌株的卡拉膠酶活性達(dá)到17.4 U/mL。

3 結(jié)論

從海水中分離的13株菌中篩選出的3號(hào)菌株具有較高的降解卡拉膠的活性。通過分子生物學(xué)鑒定方法鑒定3號(hào)菌株為γ變形桿菌綱，Gilvimarinus屬，通過單因素條件優(yōu)化、正交試驗(yàn)優(yōu)化出3號(hào)菌株卡拉膠降解活性的較佳培養(yǎng)條件為：25 ℃，培養(yǎng)2 d，蛋白胨濃度0.20%，卡拉膠濃度0.20%，瓊脂濃度0.001%、氯化鈉濃度2%、母液添加量10%。本研究為后期的工業(yè)化生產(chǎn)奠定理論基礎(chǔ)。

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