鄭培君+程海濤+王小博

摘要：以乙醇作為浸提劑，利用響應(yīng)曲面法探討柚子皮總黃酮的最佳提取工藝條件。結(jié)果表明，提取溫度為70 ℃，液料比為20∶1（mL∶g）、乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%、提取時(shí)間為1.5 h，所得的柚子皮中的總黃酮含量最高，為0.864%。

關(guān)鍵詞：柚子皮；響應(yīng)曲面法；總黃酮；提取工藝

中圖分類號：S666.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號：0439-8114（2018）01-0104-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.01.027

Abstract： The optimum extracting parameters were investigated with response surface methodology with alcohol as the extraction agent. The results showed that the extracting rate of total flavonoids reached 0.864% at the optimal processing conditions when extraction temperature was 70 ℃，the ratio of extractant to material was 20∶1（mL∶g），volume percent of alcohol was 80%，and extraction time was 1.5 h.

Key words： pommel peel；response surface methodology；total flavonoids；extract process

黃酮類化合物是一類具有C6C3C6骨架的2-苯基色原酮或色原烷的衍生物[1]。柚子皮中含有豐富的黃酮類物質(zhì)，通常在植物中與糖結(jié)合成苷，主要由柚皮苷、橙皮苷、柚皮素蕓香苷等二氫黃酮類化合物構(gòu)成，其中柚皮苷含量占80%以上[2]。黃酮類化合物具有多種生物活性和藥用價(jià)值，如抗氧化、抗腫瘤、消炎、鎮(zhèn)痛、抗菌、降低血液黏度、減少血脂和血栓的形成、防治胃潰瘍等[3-6]。在食品工業(yè)上，可作為天然的食品添加劑、食用色素、風(fēng)味改良劑和苦味劑[7]，又可合成高甜度、無毒、低能量的柚皮苷二氫查爾酮和新橙皮甙二氫查爾酮。此外，柚皮苷還可以用作合成檸檬素、鼠李糖等具有較高的藥用價(jià)值的原材料[8]。長期以來，柚子主要用來鮮食，而占柚果總重量高達(dá)20%～30%的果皮，大多數(shù)作為廢物被丟棄，既浪費(fèi)資源又污染環(huán)境。從柚子皮中提取黃酮類物質(zhì)可以有效開發(fā)利用柚子資源，對提高柚子產(chǎn)業(yè)的附加值具有重要意義。本研究應(yīng)用乙醇浸提法，通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面優(yōu)化，得出了柚子皮總黃酮提取的最佳工藝參數(shù)，以期為柚子產(chǎn)業(yè)開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑 馬家柚，由江西瀛洲農(nóng)業(yè)科技發(fā)展有限公司提供。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（生化試劑），乙醇、甲醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、三氯甲烷（均為分析純），均購自廣州齊云化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備 HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市華城開元實(shí)驗(yàn)儀器廠）；722 N型可見分光光度計(jì)（上海奧譜勒儀器有限公司）；SHZ-CB型循環(huán)水式多用真空泵（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；JJ200 B型電子天平（常熟市雙杰測試儀器廠）；RV 10型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（德國IKA集團(tuán)）。

1.2 方法

1.2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品15.0 mg，加甲醇溶解并定容100 mL，得到濃度為150 μg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別準(zhǔn)確吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.50、1.00、2.00、3.00、4.00 mL移入10 mL具塞刻度試管中，先加30%乙醇溶液至5 mL，再加入5%NaNO2溶液0.3 mL，搖勻后靜置6 min，加入10%Al（OH）3溶液0.3 mL，搖勻后靜置6 min，再加入1.0 mol/L NaOH溶液2 mL，再用30%乙醇溶液定容至刻度，充分振蕩后放置30 min。以30%乙醇為空白，用1 cm比色杯在波長510 nm下測定吸光度[9]。

1.2.2 黃酮類物質(zhì)的提取 將柚子清洗除雜后，剝?nèi)∑涔?，柚子皮?jīng)過挑選清洗，切割成1 cm2的小塊，置于70 ℃的烘箱中干燥10 h，用小型高速粉碎機(jī)將其粉碎過100目篩。精確稱取2.5 g制備好的柚皮粉，置于錐形瓶中。按照張怡等[10]的方法提取后作為待測液。

1.2.3 總黃酮的檢測 用移液管吸取1 mL待測液，按標(biāo)準(zhǔn)曲線指標(biāo)操作步驟于波長510 nm處進(jìn)行吸光度測定。通過吸光度的測定，根據(jù)以下公式算出樣品中總黃酮提取率[10]。重復(fù)3次，取平均值。

總黃酮提取率：X=（M1V2/MV1）×10-6。式中，M1為依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出被測液中總黃酮的含量（μg）；M為試樣的質(zhì)量（g）；V1為待測液分取的體積（mL）；V2為待測液的總體積（mL）。

1.2.4 單因素試驗(yàn)

1）提取溫度的選擇。固定液料比為20∶1（mL∶g，下同），乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%，提取時(shí)間為2 h的提取條件下，在提取溫度為60、70、80、90、100 ℃時(shí)，測定柚子皮中的總黃酮提取率。

2）液料比的選擇。固定提取溫度為70 ℃，乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%，提取時(shí)間為2 h的提取條件下，液料比分別為10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1（mL∶g，下同）時(shí)，測定柚子皮中的總黃酮提取率。

3）乙醇體積分?jǐn)?shù)的選擇。固定提取溫度為70 ℃，液料比為20∶1，提取時(shí)間為2 h的提取條件下，乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為50%、60%、70%、80%、90%時(shí)，測定柚子皮中的總黃酮提取率。endprint

4）提取時(shí)間的選擇。固定提取溫度為70 ℃，乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%，液料比為20∶1的提取條件下，提取時(shí)間分別為1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h時(shí)，測定柚子皮中的總黃酮提取率。

1.2.5 響應(yīng)面優(yōu)化 在單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，采用Design-Expert 8.06軟件的Box-Behnken設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)試驗(yàn)，并對提取條件進(jìn)行優(yōu)化。選取提取溫度、液料比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間4個(gè)因素作為試驗(yàn)因素，總黃酮提取率為響應(yīng)值。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS19.0軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用Origin 8.5軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 提取溫度對柚子皮總黃酮提取率的影響 由圖1可知，在70 ℃，柚子皮總黃酮提取率最高，當(dāng)溫度大于70 ℃時(shí)，提取率反而呈下降趨勢。這是因?yàn)殡S著溫度的增加，可溶性成分的溶解度和擴(kuò)散系數(shù)增大，有利于浸提；但過高的溫度，會(huì)破壞不耐熱的活性成分，降低柚子皮總黃酮的提取率；此外，溫度較高時(shí)乙醇揮發(fā)嚴(yán)重，也會(huì)降低總黃酮提取率[11]。因此，初步確定70 ℃為最佳的浸提溫度。

2.1.2 液料比對柚子皮總黃酮提取率的影響 由圖2可以看出，隨著液料比的增大，總黃酮提取率增加，20∶1時(shí)最大。這是因?yàn)殡S著溶劑的增多，增加了柚子皮粉與溶劑的接觸面積，提高了傳質(zhì)效率[11]。但當(dāng)液料比大于20∶1時(shí)，總黃酮提取率反而略有下降。這可能是因?yàn)?，料液浸提法是一種傳質(zhì)擴(kuò)散的過程，當(dāng)增加溶劑用量時(shí)，提取時(shí)間也需要延長，因此在限定的時(shí)間內(nèi)提取率會(huì)稍有下降[12]。此外液料比過大，不利于濃縮回收，還增加能耗，考慮到節(jié)約成本，確定液料比為20∶1。

2.1.3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對柚子皮總黃酮提取率的影響 黃酮類化合物易溶于甲醇、乙醇和丙酮等有機(jī)溶劑?？紤]溶劑的安全性及有效性，本研究選用乙醇作為浸提劑。乙醇作為浸提劑，具有滲透性強(qiáng)、提取效率高、選擇性好等優(yōu)點(diǎn)，且黃酮類化合物具有酚羥基在水中有一定的溶解度[13]。由此，確定使用乙醇水溶液作為提取溶劑。由圖3可知，柚子皮中的總黃酮得率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加而升高，這可能是由于乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，減少了柚子皮與溶劑間黃酮類化合物的濃度差，從而增加了柚子皮中總黃酮提取效率，而且隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)增大，部分脂溶性黃酮一并提取，所以吸光度和黃酮得率在不斷增大[14]。乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到70%時(shí)，提取率最高，而后反而下降。這可能是由于乙醇體積分?jǐn)?shù)過高時(shí)，乙醇大量揮發(fā)，同時(shí)增加了一些醇溶性雜質(zhì)、色素、親脂性強(qiáng)成分的溶出，與黃酮類化合物競爭與乙醇結(jié)合，且乙醇體積分?jǐn)?shù)過高降低了水溶性黃酮的溶解度，從而導(dǎo)致總黃酮提取率的下降[11]。因此，確定乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%。

2.1.4 提取時(shí)間對柚子皮總黃酮提取率的影響 由圖4可知，柚子皮總黃酮的提取率隨時(shí)間的增加而快速增加，2.0 h達(dá)到最高；此后隨著時(shí)間的延長，總黃酮提取率反而略有下降，究其原因可能是提取時(shí)間太長，部分乙醇揮發(fā)導(dǎo)致沸點(diǎn)增大，提取液中對熱敏感的黃酮類化合物發(fā)生水解[15]，進(jìn)而影響柚子皮總黃酮提取率。因此，為使浸提充分又節(jié)約能耗，初步確定提取時(shí)間為2.0 h。

2.2 響應(yīng)面分析

由單因素試驗(yàn)結(jié)果可以看出，柚子皮總黃酮的提取效果取決于提取溫度、液料比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間的選擇以及各提取條件間的相互組合[16]。采用響應(yīng)面法優(yōu)化柚子皮總黃酮的提取條件，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以提取溫度、液料比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間為自變量，總黃酮提取率為響應(yīng)值，采用Design Expert 8.06軟件根據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)試驗(yàn)，并對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析（表1）。

2.1.1 擬合模型 根據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)原則，Design Expert 8.06軟件設(shè)計(jì)了29組試驗(yàn)（表2），被用于優(yōu)化提取條件。采用方差分析（ANOVA），二階多項(xiàng)式模型來計(jì)算預(yù)測的響應(yīng)，公式如下：

Y=0.82+5.18×10-3A-9.2×10-3B+0.026C-0.027D+2.53×10-3AB-1.75×10-3AC+3.25×10-3AD+5.03×10-3BC-0.011BD-5×10-4CD-0.057A2-0.053B2+0.027C2+7.517×10-3D2。

式中，Y表示總黃酮提取率，A表示提取溫度，B表示液料比，C表示乙醇體積分?jǐn)?shù)，D表示提取時(shí)間。其中，R2=0.998 6，表明方程可信度較好，能夠準(zhǔn)確地分析和預(yù)測黃酮的提取條件。

采用F檢驗(yàn)、P值來評價(jià)模型方程的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，F(xiàn)值和P值用來檢驗(yàn)每個(gè)系數(shù)的顯著性。F越大，P值越小，則相應(yīng)的系數(shù)越顯著。根據(jù)方差分析結(jié)果（表3），模型的F為698.65，P<0.000 1，這表明模型極顯著。系數(shù)A、B、C、D、AD、BC、BD、A2、B2、C2、D2均顯著（P<0.05），其他系數(shù)并不顯著（P>0.05）。此外，失擬項(xiàng)F為1.22，P=0.459>0.05，說明了失擬性誤差不顯著。決定系數(shù)（R2=0.998 6）的值接近于1，表明預(yù)測值與實(shí)際值具有有效的關(guān)聯(lián)性。調(diào)整后的決定系數(shù)（R2adj=0.997 1）也接近1，這表明試驗(yàn)值可以由模型來預(yù)測。

2.1.2 響應(yīng)面分析 響應(yīng)面模型是表達(dá)不同參數(shù)對總黃酮提取效果的最好方式。三維（3D）響應(yīng)面作為回歸方程的一個(gè)重要組成部分，可以描述兩個(gè)變量之間的相互作用，并確定它們的最優(yōu)水平。它提供了一個(gè)有效的方法來反映響應(yīng)值與各變量試驗(yàn)水平間的關(guān)系及兩個(gè)變量間相互作用的類型。圖的形狀可以反應(yīng)變量之間的相互作用是否顯著[17]。圖5顯示提取溫度、液料比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間之間的相互作用對總黃酮提取率的影響。結(jié)合方差分析，可以知道提取溫度-液料比之間的相互作用對總黃酮提取率影響顯著（圖5-A）；乙醇體積分?jǐn)?shù)-提取溫度之間的相互作用對總黃酮提取率影響顯著（圖5-B）；提取時(shí)間-溫度之間的相互作用對總黃酮提取率影響顯著（圖5-C）；乙醇體積分?jǐn)?shù)-液料比之間的相互作用對總黃酮提取率影響顯著（圖5-D）；提取時(shí)間-液料比之間的相互作用對總黃酮提取率影響顯著（圖5-E）；提取時(shí)間-乙醇體積分?jǐn)?shù)之間的相互作用對總黃酮提取率影響顯著（圖5-F）。由此可知，總黃酮提取量與提取時(shí)間、 乙醇體積分?jǐn)?shù)呈正比；提取溫度以及液料比會(huì)對提取效果帶來較大影響；各因素之間存在明顯的交互作用。同時(shí)采用乙醇提取柚子皮總黃酮時(shí)，提取溫度不宜過高，提取時(shí)間不宜過長。柚子皮總黃酮中的柚皮苷為酚羥基化合物，溫度過高、時(shí)間過長時(shí)柚皮苷容易氧化，反而導(dǎo)致提取率下降[10]。endprint

回歸分析結(jié)果與4個(gè)因素對響應(yīng)值的影響以及各因素之間的交互影響相吻合。在響應(yīng)面最高點(diǎn)和等高線所選范圍內(nèi)存在極值，即為最優(yōu)點(diǎn)。綜上分析，柚子皮總黃酮最佳提取條件為溫度72.39 ℃，液料比為20.40∶1，乙醇體積分?jǐn)?shù)為82.56%，提取時(shí)間為1.5 h。根據(jù)實(shí)際試驗(yàn)條件，將提取條件調(diào)整為溫度70 ℃，液料比為20∶1，乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%，提取時(shí)間為1.5 h。在此條件下，重復(fù)5次，柚子皮總黃酮提取率接近預(yù)測值，證明擬合響應(yīng)面模型的適用性。因此，響應(yīng)面設(shè)計(jì)更好地預(yù)測了柚子皮總黃酮的提取效果，可信度高。

3 結(jié)論

采用 Design-Expert 8.06軟件的Box-Behnken設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)，建立數(shù)學(xué)模型。方差分析結(jié)果表明，柚子皮中總黃酮提取量與提取時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)呈正比；同時(shí)提取溫度和液料比也對提取效果影響較大。通過響應(yīng)優(yōu)化及根據(jù)實(shí)際試驗(yàn)條件，柚子皮中總黃酮最佳提取條件為溫度70 ℃、液料比為20∶1、乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%、提取時(shí)間為1.5 h，在此條件下總黃酮提取率可達(dá)到0.864%。

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