余麗麗 林鵬 郭松林 王藝?yán)?張子平 王婷婷 馮建軍

（1. 集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院 鰻鱺現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)教育部工程研究中心 農(nóng)業(yè)部東海海水健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廈門 361021；2. 福建農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，福州 350002）

與哺乳動(dòng)物類似，魚類也存在天然和獲得性兩種免疫應(yīng)答方式。其中，天然免疫既是抵御病原微生物侵害的第一道防線，同時(shí)也具有誘導(dǎo)獲得性免疫應(yīng)答反應(yīng)的作用［1］。Toll樣受體（Tolllike receptor，TLR）是一類重要的模式識(shí)別受體（Pattern recognition receptor，PRR），在天然免疫和獲得性免疫中起著橋梁作用，主要是通過識(shí)別具有保守微生物結(jié)構(gòu)的病原相關(guān)分子模式（Pathogenassociated molecular pattern，PAMPs），包括脂多糖（Lipopolysaccharides，LPS）、肽聚糖（Peptidoglycan，PGN）、鞭毛蛋白、CpG-DNA、poly I∶C以及酵母聚糖等引發(fā)先天免疫應(yīng)答［2］。目前，在哺乳動(dòng)物中有13種不同類型TLRs，而魚類中發(fā)現(xiàn)17種，在結(jié)構(gòu)與功能方面具有高度相似性［3］。TLRs家族中，Toll樣受體3（TLR3）在識(shí)別雙鏈RNA（dsRNA）或病毒類似物poly I∶C中發(fā)揮重要作用［4-5］。從低等動(dòng)物到高等動(dòng)物，TLR3在結(jié)構(gòu)上非常保守，具有多個(gè)亮氨酸重復(fù)序列（Leucine-rich repeat，LRR）的胞外結(jié)構(gòu)域、N和C末端側(cè)翼區(qū)的跨膜結(jié)構(gòu)域以及TIR（Toll-like/IL-1 receptor，TIR）結(jié)構(gòu)域［6］。TLR3的信號(hào)傳導(dǎo)方式主要通過兩種途徑：一種是髓樣分化因子88（Myeloid differentiation factor 88，MyD88）依賴途徑，即TIR結(jié)構(gòu)域與接頭蛋白MyD88或其類似物相互作用后將信號(hào)傳遞到細(xì)胞內(nèi)，引起免疫應(yīng)答［7］；另一種是MyD88非依賴途徑，主要通過TIR結(jié)構(gòu)域募集的另一接頭蛋白TRIF（TIR-domaincontaining adaptor inducing interferon-β，TRIF） 傳 遞信號(hào)，TRIF招募不同信號(hào)通路下游的蛋白分子并與其結(jié)合，激活不同的轉(zhuǎn)錄因子和轉(zhuǎn)錄激酶，如NF-κB、干擾素調(diào)節(jié)因子3（Interferon regulatory factor 3，IRF- 3）和MAP激酶等，進(jìn)而激活相應(yīng)的信號(hào)通路［4］。

迄今為止，已有多種魚類的TLR3基因序列被克隆和報(bào)道，包括斑馬魚（Danio rerio）［8］、斑點(diǎn)叉尾鮰（Ictalurus punctatus）［9］、紅鰭東方鲀（Takifugu rubripes）［10］、 鯉 魚（Cyprinus carpio）［11］、 稀 有 鮈鯽（Gobiocypris rarus）［12］、草魚（Ctenopharyngodon idella）［13］以及虹鱒（Oncorhynchus mykiss）［14］等。越來越多的研究表明TLR3 在魚類抗病毒免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用［15］。經(jīng)poly I:C免疫注射后，斑點(diǎn)叉尾鮰［9］、鯉魚［11］以及大黃魚（Larimichthys crocea）［16］的 TLR3基 因 表 達(dá) 量 顯 著 上 調(diào)。Su等［12］用 草 魚 呼 腸 孤 病毒（Grass carp reovirus，GCRV）感染稀有鮈鯽、團(tuán)頭魴（Megalobrama amblycephala）［17］后，TLR3基因表達(dá)水平均有明顯提高，提示TLR3與抗病毒免疫應(yīng)答緊密相關(guān)。近年來的研究也發(fā)現(xiàn)TLR3在抗細(xì)菌免疫應(yīng)答中扮演重要角色。大黃魚［16］和斑馬魚［8］分別經(jīng)副溶血弧菌（Vibrio Parahaemolyticus）和遲緩愛德華菌（Edwardsiella tarda）感染后，TLR3基因表達(dá)水平均有顯著提高。最近的研究發(fā)現(xiàn)，LPS和PGN能顯著增強(qiáng)草魚頭腎細(xì)胞TLR3基因的表達(dá)［18］，提示該分子參與了抗細(xì)菌感染的免疫反應(yīng)。

日本鰻鱺（Anguilla japonica）是中國、日本和韓國等東亞國家的重要養(yǎng)殖種類，味道鮮美、營養(yǎng)豐富，具有極高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值［19］。然而，由于養(yǎng)殖過程中的病害頻繁發(fā)生，給日本鰻鱺養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失［20］。因此，對(duì)于日本鰻鱺抵抗外源微生物免疫機(jī)制的研究顯得尤為重要。本實(shí)驗(yàn)克隆了日本鰻鱺AjTLR3全長cDNA序列，利用熒光定量PCR技術(shù)研究了經(jīng)poly I∶C和LPS免疫刺激后的日本鰻鱺肝、脾、腸、鰓、腎、皮膚、心臟及肌肉AjTLR3基因表達(dá)水平變化。此外，選擇病毒和細(xì)菌不同的病原體相關(guān)分子模式（LPS，poly I∶C，CpG-DNA和PGN）以及不同濃度的嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila），對(duì)體外培養(yǎng)的日本鰻鱺肝臟細(xì)胞進(jìn)行免疫刺激，檢測(cè)不同時(shí)相AjTLR3基因表達(dá)譜的變化，以期為深入了解日本鰻鱺AjTLR3在抗病毒和抗細(xì)菌免疫應(yīng)答中的作用機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

日本鰻鱺體重約45-50 g，購自中國福清鰻魚養(yǎng)殖場(chǎng)，于25℃，1 000 L循環(huán)水中暫養(yǎng)一周以適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境。解剖取各組織器官，包括肝臟、脾臟、鰓、腎、腸、心臟、皮膚和肌肉，放入液氮冷凍后置于-80℃保存，用于RNA提取。體外實(shí)驗(yàn)采用的日本鰻鱺肝臟細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室制備，培養(yǎng)方法參照文獻(xiàn)［21］。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物免疫刺激 將LPS和poly I∶C（均購自SIGMA公司）用PBS溶解稀釋，至終濃度分別為4 mg/mL和2 mg/mL。日本鰻鱺被分為3組進(jìn)行腹腔注射，實(shí)驗(yàn)組分別注射250 μL LPS和250 μL poly I∶C，對(duì)照組注射250 μL滅菌PBS溶液。免疫刺激24 h后，每組隨機(jī)選擇6尾日本鰻鱺，取血、肝臟、脾臟、鰓、腎、腸、心臟、皮膚和肌肉，液氮迅速冷凍，置于-80℃冰箱保存。

1.2.2 細(xì)胞免疫刺激 當(dāng)細(xì)胞貼壁覆蓋率達(dá)到90%以上用含0.25%胰酶的消化液進(jìn)行消化，隨后轉(zhuǎn)入3 cm 的細(xì)胞培養(yǎng)板，細(xì)胞長滿后更換細(xì)胞培養(yǎng)液，分 別加入 poly I∶C（50 μg/mL）、LPS（30 μg/mL）、CpG（10 μg/mL）、PGN（30 μg/mL）［21］，以及終濃度分別為106CFU/mL、107CFU/mL和108CFU/mL的嗜水氣單胞菌，對(duì)照組加入等體積細(xì)胞培養(yǎng)液。在免疫刺激后0 h、3 h、6 h、12 h、24 h和48 h取樣，每個(gè)時(shí)相取4個(gè)細(xì)胞樣品重復(fù)。

1.2.3 總RNA的提取以及cDNA的合成 日本鰻鱺不同組織樣品以及肝臟細(xì)胞樣品總RNA的提取均采用E.Z.N.A.TM總RNA試劑盒II（Omega），具體方法參照試劑盒說明書。取1μg的RNA通過PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）試劑盒（TaKaRa，China）制備得到cDNA模板，稀釋100倍后用于日本鰻鱺組織和細(xì)胞熒光定量PCR。另取部分肝臟總RNA，通過SMART RACE cDNA擴(kuò)增試劑盒（TaKaRa，China）合成RACE反應(yīng)的第一鏈cDNA，用于AjTLR3基因全長的克隆。

1.2.4 日本鰻鱺AjTLR3基因全長的克隆 根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室日本鰻鱺轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析獲得AjTLR3基因片段序列，利用Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)工具（http：//www.premierbiosoft.com/primerdesign/index.html）（表 1）設(shè)計(jì)引物，隨后進(jìn)行PCR，擴(kuò)增日本鰻鱺AjTLR3部分基因片段。將純化產(chǎn)物插入pMD19-T載體（TaKaRa，China），并轉(zhuǎn)化至感受態(tài)中，隨后將陽性克隆的質(zhì)?？寺〔⒂缮虾ＩみM(jìn)行測(cè)序?；跍y(cè)序正確的AjTLR3部分基因序列，使用表1中列出的特異性引物擴(kuò)增日本鰻鱺AjTLR3基因全長的cDNA序列，并通過頭至趾引物驗(yàn)證其開放閱讀框（Open reading frame，ORF）的正確性。

表1 實(shí)驗(yàn)中用到的引物及其序列

1.2.5 熒光定量PCR（qRT-PCR） 選擇β-actin作為內(nèi)參基因（引物 5'-β-actin 和 3'-β-actin，表 1），選擇引物5' real-TLR3和3' real-TLR3（表1）特異性擴(kuò)增AjTLR3基因片段，進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，以確保沒有引物二聚體的單個(gè)離散帶的擴(kuò)增。將PCR產(chǎn)物，純化后測(cè)序分析。實(shí)時(shí)熒光定量PCR總反應(yīng)體系為20 μL，含有 cDNA 模板 9 μL，2×SYBR Green Master Mix（Vazyme TM，Q111-02）10 μL以及引物各 0.5 μL，在 Roche Light Cycler 480 機(jī)器（Roche，Sussex，UK）上進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件如下：95℃，1 min，40個(gè)循環(huán)（94℃，20 s，60℃，1 min）。熒光定量PCR數(shù)據(jù)結(jié)果根據(jù)Roche480自動(dòng)給出的每個(gè)樣品的Cp值，并使用比較CT方法（即2-ΔΔCT方法）計(jì)算出樣品的RQ值。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS 15.0版（SPSS Inc，Chicago，IL，USA）分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。天然日本鰻鱺不同組織基因表達(dá)水平差異采用方差分析以及Duncan多重比較法；不同實(shí)驗(yàn)處理組之間的基因水平差異采用成組T-檢驗(yàn)分析。

1.2.7 生物信息學(xué)分析 序列相似性分析采用BLAST程 序（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）， 用 ORF Finder（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gorf/）分析AjTLR3的全長cDNA序列；在（http：//cn.expasy.org/tools/pi_tool.html） 網(wǎng) 站 上進(jìn)行等電點(diǎn)、分子量預(yù)測(cè)；蛋白質(zhì)域特征由Simple Modula Architecture Reach Tool（SMART）（http：//smart.embl-heidelberg.de/）；使用BioEdit程序進(jìn)行蛋白質(zhì)序列的多重比對(duì)；通過MEGA 5.0軟件構(gòu)建N-J系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果

2.1 AjTLR3基因全長克隆以及序列分析

日本鰻鱺AjTLR3（GenBank登錄號(hào)：KJ726740）的cDNA全長為3 383 bp，包含93 bp的5'非翻譯區(qū)（Untranslated regions，UTR），524 bp的 3'-UTR以及2 766 bp的ORF，編碼921個(gè)氨基酸（圖1）。預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)分子量為103.0 kD，理論等電點(diǎn)為pI 8.84。通過SMART程序預(yù)測(cè)的AjTLR3的結(jié)構(gòu)域顯示：AjTLR3分子由16個(gè)富含亮氨酸重復(fù)序列（Leucinerich repeat，LRR）的胞外結(jié)構(gòu)域、TIR結(jié)構(gòu)域（773-917 aa）以及在N末端（13-25 aa）與C末端（721-743 aa）的兩個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域組成（圖1-2）。其中胞外結(jié)構(gòu)域含有11個(gè)保守LRR結(jié)構(gòu)域、3個(gè)特殊LRR結(jié)構(gòu)域（LRR-TYP）、1個(gè)N末端區(qū)域的LRR-NT結(jié)構(gòu)域（44-76 aa）以及1個(gè)C末端的LRR-CT結(jié)構(gòu)域（663-715 aa）。

2.2 系統(tǒng)發(fā)育樹及氨基酸多重比對(duì)分析

系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3）顯示，日本鰻鱺與其他魚類TLR3聚為一支，哺乳類、鳥類、兩棲類各聚為一支。通過比較不同物種的氨基酸序列顯示（表2），AjTLR3氨基酸序列分別與亞洲龍魚（Scleropages formosus）、衰白鮭（Coregonus maraena）、虹鱒魚、大西洋鮭（Salmo salar）、黑鯽（Carassius carassius）、稀有鮈鯽、斑點(diǎn)叉尾鮰、鯽魚、草魚、團(tuán)頭魴、橫口裂腹魚（Schizothorax richardsonii）、鮸魚（Miichthys miiuy）、牙鲆（Paralichthys olivaceus）、大菱鲆（Scophthalmus maximus）、紅鰭東方鲀、人類（Homo sapiens） 和 貓（Felis catus） 有 60%、59%、58%、58%、57%、56%、56%、56%、56%、56%、56%、55%、55%、55%、55%、49%和49%的一致性。AjTLR3氨基酸序列與魚類一致性較高（55%-60%），而與哺乳動(dòng)物基因的一致性較低（49%）。將日本鰻鱺AjTLR3基因氨基酸序列與其他物種進(jìn)行多重序列比對(duì)分析見圖4，結(jié)果表明日本鰻鱺AjTLR3與鳥類和哺乳類一樣，均具有跨膜結(jié)構(gòu)域和TIR結(jié)構(gòu)域。此外，在哺乳動(dòng)物TLR3基因上有4個(gè)高度保守的氨基酸殘基，也在日本鰻鱺的AjTLR3的序列中發(fā)現(xiàn)，分別為 Phe750、Leu761、Gly762和 Tyr778。

2.3 AjTLR3基因在日本鰻鱺不同組織中的表達(dá)

日本鰻鱺 AjTLR3基因?yàn)榻M成型表達(dá)模式。其中肝臟表達(dá)量顯著高于其他組織（P＜0.05）；其次是脾臟、腸、鰓、腎及皮膚，在心臟和肌肉中的表達(dá)水平較低（圖5）。

2.4 poly I∶C和LPS刺激后AjTLR3基因在日本鰻鱺不同組織中的表達(dá)

為了探討AjTLR3對(duì)抗病毒和抗細(xì)菌免疫應(yīng)答

的作用，利用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)了在poly I∶C和LPS感染后AjTLR3基因表達(dá)水平見圖6。

圖1 AjTLR3 cDNA的核苷酸序列和推導(dǎo)的氨基酸序列

圖2 AjTLR3結(jié)構(gòu)域示意圖

圖3 日本鰻鱺AjTLR3和其他物種TLR3氨基酸序列的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹

日本鰻鱺經(jīng)poly I∶C免疫刺激后，AjTLR3基因的表達(dá)量在肝臟組織（1.6倍，P＜0.01）、脾臟（1.9倍，P＜0.01）、 腸（1.5倍，P＜0.05）、 血（1.7倍，P＜0.05）、皮膚（2.4倍，P＜0.01）、 心 臟（3.7倍，P＜0.01）和肌肉（3.3倍，P＜0.01）中顯著上調(diào)，而在鰓和腎臟中無明顯變化。同時(shí)，在LPS的刺激下，僅肝臟（1.7倍，P＜0.05）和腸（1.3倍，P＜0.05）的AjTLR3基因水平顯著提高，而血液的中的表達(dá)量（0.4倍，P＜0.05）顯著降低，其他組織無明顯變化。此外，Poly I∶C免疫注射組中的脾臟、皮膚、心臟和肌肉組織的AjTLR3基因表達(dá)水平顯著高于LPS注射組（P＜0.05）。

2.5 嗜水氣單胞菌感染日本鰻鱺肝臟細(xì)胞后的AjTLR3基因表達(dá)變化

三種不同濃度的嗜水氣單胞菌感染日本鰻鱺肝臟細(xì)胞，其AjTLR3基因表達(dá)水平見圖7。如圖7所示：濃度為106CFU/mL的嗜水氣單胞菌未能引起日本鰻鱺肝臟細(xì)胞AjTLR3基因表達(dá)水平的變化；濃度為107CFU/mL的嗜水氣單胞菌處理日本鰻鱺肝臟細(xì)胞后，AjTLR3的基因表達(dá)水平在24 h（2.7倍，

P＜0.01）和48 h（2.3倍，P＜0.05）顯著升高，于24 h達(dá)到峰值；當(dāng)嗜水氣單胞菌濃度達(dá)到108CFU/mL時(shí)，AjTLR3的基因表達(dá)量在12 h（1.9倍，P＜0.01），24 h（1.7 倍，P＜0.05）及 48 h（1.8倍，P＜0.05）均有顯著增加，并于12 h達(dá)到峰值。

（接下頁）

圖4 日本鰻鱺和其他物種TLR3氨基酸序列多重比對(duì)

2.6 病毒/細(xì)菌PAMPs刺激后的日本鰻鱺肝臟細(xì)胞AjTLR3基因表達(dá)變化

不同病原相關(guān)分子模式LPS、poly I∶C、CpGDNA和PGN刺激下日本鰻鱺肝臟細(xì)胞AjTLR3基因的表達(dá)水平見圖8。如圖所示，LPS刺激未能引起AjTLR3基因表達(dá)變化；poly I:C刺激后的12 h（1.6倍，P＜0.05） 及 24 h（1.5 倍，P＜0.05），AjTLR3 表達(dá)量顯著提高；CpG處理組中的AjTLR3基因表達(dá)水平在24 h極顯著（P＜0.01）提高，是對(duì)照的6.4倍；PGN免疫組在24 h時(shí)基因表達(dá)水平極顯著升高（3.7倍，P＜0.01）。

3 討論

日本鰻鱺AjTLR3基因編碼921個(gè)氨基酸，具有類似高等哺乳類TLR3結(jié)構(gòu)域，包括亮氨酸的重復(fù)序列LRR、跨膜結(jié)構(gòu)域以及TIR結(jié)構(gòu)域，系TLRs家族基因的典型結(jié)構(gòu)特征［22］。LRR結(jié)構(gòu)域參與了特定病原微生物分子模式的識(shí)別，誘導(dǎo)I型干擾素（Interferon，IFN）以及其他細(xì)胞因子的產(chǎn)生，進(jìn)而引發(fā)下游的免疫信號(hào)分子傳導(dǎo)［2］。AjTLR3有16個(gè)LRR結(jié)構(gòu)域，與虹鱒TLR3完全一致［14］，其中位于C端以及N端的LRR的結(jié)構(gòu)有利于包埋暴露的疏水性氨基酸，使胞外結(jié)構(gòu)域（Extracellular domain，ECD）趨于穩(wěn)定［22-23］。人類TLR3中的TIR結(jié)構(gòu)域上有兩個(gè)保守的酪氨酸殘基，磷酸化后能誘導(dǎo)TLR3分子識(shí)別dsRNA，激發(fā)免疫信號(hào)通路的傳導(dǎo)［24］。其中，一個(gè)保守的氨基酸殘基（Tyr777）在日本鰻鱺AjTLR3中被發(fā)現(xiàn)，而另一個(gè)被組氨酸替代。此外，在人類TLR3的TIR結(jié)構(gòu)域與跨膜結(jié)構(gòu)域之間存在3個(gè)保守氨基酸殘基（Phe732、Leu742和Gly743），與NF-κB 和 IFN-β 啟動(dòng)子激活密切相關(guān)［25］。這 3 個(gè)保守氨基酸在日本鰻鱺（Phe750、Leu761和Gly762）和斜帶石斑魚（Phe748、Leu758和Gly759）（圖4）均有發(fā)現(xiàn)。推測(cè)日本鰻鱺AjTLR3與人類TLR3類似，具有誘導(dǎo)

表2 日本鰻鱺AjTLR3與其他物種的氨基酸序列比較

圖5 AjTLR3基因在健康日本鰻鱺各組織中的相對(duì)表達(dá)水平

圖6 LPS和poly I∶C刺激下24 h后不同組織中TLR3基因的相對(duì)表達(dá)水平

圖7 三種濃度嗜水氣單胞菌作用下TLR3在鰻鱺肝細(xì)胞系不同時(shí)相的表達(dá)變化

嗜水氣單胞菌濃度/CFU/mL

NF-κB/ IFN-β的表達(dá)和細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)的功能。

圖8 LPS，poly I∶C，CpG-DNA和PGN對(duì)鰻鱺肝細(xì)胞AjTLR3基因表達(dá)的影響

日本鰻鱺AjTLR3基因在各組織中均有不同程度的表達(dá)，與大黃魚［16］、斜帶石斑魚［26］、鯉魚［11］和黃顙魚［27］等魚類表達(dá)情況相似。魚類TLR3基因組成型表達(dá)模式反映該分子在宿主不同組織的免疫監(jiān)測(cè)中發(fā)揮作用。日本鰻鱺肝臟AjTLR3基因表達(dá)水平明顯高于其他組織器官，在其他多種魚類如大黃魚、斜帶石斑魚、鯉魚和黃顙魚的肝臟中也均有高表達(dá)，表明肝臟是日本鰻鱺重要的免疫器官，在天然免疫中具有重要作用［28］。

肖調(diào)義等［29］研究發(fā)現(xiàn)，赤眼鱒（Squaliobarbus curriculus）感染GCRV后其肝臟、脾臟、腎臟的TLR3表達(dá)水平顯著升高，而Rodriguez等［14］發(fā)現(xiàn)感染傳染性造血器官壞死病病毒（Infectious hematopoietic necrosis virus，IHNV）可以引起虹鱒TLR3的表達(dá)水平顯著上調(diào)，表明TLR3分子與魚體抗病毒的免疫應(yīng)答密切相關(guān)。已有的研究表明，作為病毒類似物的poly I∶C免疫注射大黃魚［16］、日本牙鲆［30］、虹鱒［14］以及稀有鮈鯽［12］后，TLR3 基因的表達(dá)量均有顯著提高。在本研究中，日本鰻鱺免疫注射poly I∶C后，AjTLR3基因表達(dá)量在肝臟、脾臟、皮膚、心臟、肌肉和腸中顯著上調(diào)（P＜0.05）。此外，日本鰻鱺肝臟細(xì)胞經(jīng)poly I:C刺激12 h和24 h后AjTLR3表達(dá)量顯著升高（P＜0.05），表明poly I∶C作為特異性配體被AjTLR3識(shí)別，這與草魚頭腎細(xì)胞在poly I∶C刺激下的TLR3表達(dá)量顯著增加的結(jié)果一致［18］。以上的日本鰻鱺體內(nèi)和體外研究結(jié)果表明AjTLR3分子在抗病毒免疫應(yīng)答中起重要作用。

嗜水氣單胞菌屬于革蘭氏陰性細(xì)菌，是養(yǎng)殖魚類主要病原菌之一［31］。最近，Zhang等［27］研究發(fā)現(xiàn)黃顙魚經(jīng)嗜水氣單胞菌免疫刺激后的TLR3基因水平在肝臟、腎臟及脾臟免疫器官均有顯著提高。本研究發(fā)現(xiàn)高濃度的嗜水氣單胞菌能夠引起日本鰻鱺肝臟細(xì)胞AjTLR3的表達(dá)量顯著增加，與遲緩愛德華菌感染后的斑馬魚以及副溶血弧菌免疫刺激后的大黃魚中的研究結(jié)果相似［8，16］，這可能與AjTLR3參與了肝臟細(xì)胞抗細(xì)菌免疫應(yīng)答反應(yīng)有關(guān)。LPS作為革蘭氏陰性細(xì)菌的主要病原模式分子，能夠誘導(dǎo)日本鰻鱺肝臟和腸中AjTLR3表達(dá)水平升高，表明AjTLR3參與了相關(guān)組織器官對(duì)細(xì)菌的免疫識(shí)別與應(yīng)答反應(yīng)。此外，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)LPS刺激并未引起AjTLR3基因在日本鰻鱺肝臟細(xì)胞中的明顯變化，其原因可能是由于機(jī)體內(nèi)以及單獨(dú)肝臟細(xì)胞針對(duì)LPS的免疫應(yīng)答機(jī)制不同所致。PGN作為革蘭陽性菌細(xì)胞壁的主要組分，免疫刺激日本鰻鱺肝臟細(xì)胞24 h后，其AjTLR3的表達(dá)量顯著增高，且達(dá)到峰值，這與草魚頭腎細(xì)胞的經(jīng)PGN刺激后的結(jié)果相一致［18］。以上結(jié)果提示，AjTLR3在日本鰻鱺抗細(xì)菌免疫應(yīng)答中扮演重要角色。

細(xì)菌基因組DNA存在富含CpG的寡脫氧核苷酸（ODNs）序列，可以激活脊椎動(dòng)物的天然免疫和適應(yīng)性免疫應(yīng)答［32］。Tsujimoto 等［33］研究發(fā)現(xiàn) CpGODN能夠提高小鼠的抗腫瘤細(xì)胞的免疫能力。在本實(shí)驗(yàn)中，CpG-ODN也能誘導(dǎo)日本鰻鱺肝臟細(xì)胞的AjTLR3基因表達(dá)水平顯著升高，這與日本牙鲆淋巴外周血細(xì)胞研究結(jié)果一致［30］，推測(cè)CpG-ODN在促進(jìn)細(xì)胞抗病毒炎癥反應(yīng)方面發(fā)揮作用。

綜上所述，經(jīng)poly I∶C免疫刺激后，AjTLR3基因表達(dá)水平在日本鰻鱺多個(gè)組織中顯著提高，同時(shí)也能增強(qiáng)日本鰻鱺肝臟細(xì)胞AjTLR3基因的表達(dá)，表明AjTLR3在日本鰻鱺抗病毒免疫應(yīng)答中具有重要作用。此外，嗜水氣單胞菌以及病原相關(guān)分子模式CpG和PGN均能誘導(dǎo)AjTLR3基因在日本鰻鱺肝臟細(xì)胞中的高水平表達(dá)，顯示該分子也與日本鰻鱺抗細(xì)菌免疫反應(yīng)密切相關(guān)。本研究結(jié)果為日本鰻鱺針對(duì)不同病原微生物免疫防御機(jī)制的深入探討提供了參考。

4 結(jié)論

本研究中克隆了日本鰻鱺AjTLR3基因，其全長3 383 bp，編碼921個(gè)氨基酸，包含16個(gè) LRR的胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域以及TIR結(jié)構(gòu)域，其中在TIR結(jié)構(gòu)域含有一個(gè)高度保守的氨基酸殘基Tyr778。在不同病原分子模式刺激下，體內(nèi)以及體外實(shí)驗(yàn)的Real-time PCR結(jié)果充分證明，AjTLR3在日本鰻鱺抵御病毒及細(xì)菌的免疫應(yīng)答過程中具有重要作用。

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