苗小榮 ?？∑?莫昭展 王愛勤 何龍飛

（1. 廣西大學農(nóng)學院，南寧 530005；2. 玉林師范學院生物與制藥學院，玉林 537000）

鐵皮石斛（Dendrobium officinale）是蘭科石斛屬多年生附生草本植物，不僅有觀賞價值，而且具有滋陰補腎、生津益胃、潤肺止咳等功效，被稱為“中華九大仙草”之首。多糖是其主要藥理活性物質(zhì)之一，也是目前評判鐵皮石斛品質(zhì)的主要指標（中國藥典一部，2015）。蔗糖是多糖合成前體物質(zhì)，它只有分解為葡萄糖和果糖，才能進入下游各種代謝途徑，因此研究蔗糖代謝相關(guān)酶活性是研究鐵皮石斛多糖積累的重要組成部分。轉(zhuǎn)化酶（Invertase，INV）是調(diào)節(jié)蔗糖代謝的關(guān)鍵酶之一，能不可逆地催化蔗糖水解成葡萄糖和果糖，在蔗糖的轉(zhuǎn)運、貯藏、分配、以及作物經(jīng)濟產(chǎn)量形成與果實品質(zhì)改良中發(fā)揮重要作用［1］。INV基因的表達受轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的雙重調(diào)控，轉(zhuǎn)化酶抑制子（Invertase inhibitor，InvInh）是轉(zhuǎn)化酶翻譯后酶活性的重要調(diào)節(jié)因子［2］。該類蛋白屬于非糖基化蛋白；具有熱穩(wěn)定性，短時高溫仍具有抑制轉(zhuǎn)化酶活性的作用；對轉(zhuǎn)化酶的抑制作用具有交叉抑制現(xiàn)象；不受低溫、鹽脅迫和成熟等的誘導(dǎo)［3］。

InvInh在轉(zhuǎn)化酶翻譯后水平起調(diào)節(jié)作用，它通過與轉(zhuǎn)化酶結(jié)合，而使轉(zhuǎn)化酶失去活性。與酸性轉(zhuǎn)化酶分類相對應(yīng)，InvInh家族基因也分為液泡轉(zhuǎn)化酶抑制子（Vacuolar invertase inhibitors of β-fructosidase，VIF））和細胞壁結(jié)合轉(zhuǎn)化酶抑制子（Cell wall invertase inhibitors of β-fructosidase，CIF），屬 于 INV/PMEI（Invertase and pectin methylesterase inhibitors）家族成員［4］。InvInh對細胞壁結(jié)合轉(zhuǎn)化酶（Cell wall invertase，CIN）活性的調(diào)節(jié)是通過碳源實現(xiàn)的。當碳源有限時，InvInh能抑制CIN酶活性，此時蔗糖合成酶主要起分解蔗糖作用。當蔗糖濃度充足時，CIN才被激活。InvInh只與“空閑”的CIN結(jié)合，可保護“空閑”的CIN免遭降解，具有分子伴侶的功能［5］。番茄CIN（LIN5）和CIF基因存在于篩管的細胞壁上［6］。InvInh和INV以離子鍵相結(jié)合，將InvInh酶加入煙草懸浮培養(yǎng)細胞中，該酶可以在細胞壁上自由移動，能與CIN酶結(jié)合形成InvInh/CIN復(fù)合物，從而抑制CIN酶活性。在pH 4.5時，擬南芥AtCIF與CIN的結(jié)合量最大。在該pH值條件下，CIF與蔗糖競爭INV的同一結(jié)合位點，CIF能與CIN緊密結(jié)合，使CIN失去酶活性［7］。InvInh酶活性具有劑量依賴型的抑制作用，其使轉(zhuǎn)化酶酶活性降低50%的Ki值為3.82×10-5mol/L［8］。此外，InvInh基因在馬鈴薯“低溫糖化”過程中也發(fā)揮重要作用。在4℃低溫脅迫下，馬鈴薯StINV1/StInvInh2基因的相對表達量與塊莖中還原糖的積累呈顯著的相關(guān)性，StInvInh2通過抑制StINV1酶活性，調(diào)節(jié)塊莖中還原糖的含量變化，以適應(yīng)低溫環(huán)境［9］。在低溫儲藏過程中過量表達StInvInh2基因，能增加冷敏感型馬鈴薯塊莖中InvInh酶活性，降低液泡轉(zhuǎn)化酶活性，降低還原糖含量［10］。

本研究根據(jù)課題組前期構(gòu)建的鐵皮石斛轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，從中篩選到3個InvInh基因，采用 RT-PCR和RACE方法克隆其全長cDNA序列（分別命名為DoInvInh1、DoInvInh2和DoInvInh3）。同時，利用生物信息學軟件分析該蛋白家族基因的理化特性和蛋白結(jié)構(gòu)，采用實時熒光定量PCR方法分析DoInvInh家族基因成員在鐵皮石斛不同組織部位中的表達，旨為研究InvInh家族基因?qū)D(zhuǎn)化酶的抑制機理奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料 鐵皮石斛取自玉林師范學院生物與制藥學院觀賞經(jīng)濟植物培育基地。以鐵皮石斛幼嫩葉片cDNA為材料進行基因克隆。于2016年5月10日分別取2年生的鐵皮石斛根、莖、葉和花，以及1-3年生鐵皮石斛的莖為材料。液氮速凍后，用于RNA提取的材料置-80℃保存，用于酶活性測定的材料置于-20℃保存。

1.1.2 試劑 RNA提取Trizol試劑盒購于天根生化科技（北京）有限公司；5￠RACE試劑盒購于Invitrogen公司；RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Ex Taq酶、dNTPs、pMD18-T載 體、PrimeScript RT reagent Kit With gDNA Eraser、Genome Walking Kit、SYBR Premix Ex Tap II購自TaKaRa寶生物工程（大連）公司。本試驗所用特異引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。實時熒光定量PCR采用ABI Stepone Plus型熒光定量PCR儀。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取和cDNA合成 以鐵皮石斛幼嫩葉為材料提取總RNA，RNA提取采用天根Trizol-A+提取液，具體提取過程參照Trizol試劑盒說明書。利用瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA完整性，利用Thermo Scientific Nanodrop 2000c檢測總RNA濃度及純度。反轉(zhuǎn)錄按照ReverAid First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄成cDNA第一鏈。

1.2.2 鐵皮石斛InvInh基因克隆和拼接驗證 從鐵皮石斛葉片轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中篩選到3個 InvInh基因核苷酸序，DoInvInh1、DoInvInh2和DoInvInh3序列大小分別為 928 bp、722 bp和488 bp，經(jīng)NCBI ORF Finder在線預(yù)測和同源性比對分析，發(fā)現(xiàn)DoInvInh1和DoInvInh2基因已經(jīng)獲得全長基因序列，而DoInvInh3基因在3'片段還缺少大約90 bp 核苷酸序列，通過設(shè)計引物，采用3'RACE技術(shù)進行基因克隆。

依據(jù)DoInvInh3基因中間片段的核苷酸序列，設(shè)計用于3'端擴增的2條特異上游引物：XYF1和XYF2（表1）。以提取的鐵皮石斛葉總RNA為模板，按照ReverAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒說明書，以GZS（5'- GGCCACGCGTCGACTAG TACTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3'）作為反轉(zhuǎn)錄引物，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。用XYF1和XYR1引物進行第1輪PCR擴增，PCR產(chǎn)物稀釋20倍后作為引物XYF2和XYR1的模板，進行第2輪PCR擴增。PCR 反應(yīng)程序 ：94℃ 5 min；94℃ 50 s，57℃ 30 s，72℃ 1.30 min，35個循環(huán)；72℃ 10 min。產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化后克隆到T載體并測序，測序結(jié)果246 bp。利用ContigExpress軟件將3'序列和中間片段核苷酸序列進行拼接后，獲得了DoInvInh3全長cDNA序列。在DoInvInh1、DoInvInh2和DoInvInh3基因的編碼區(qū)序列兩端，分別設(shè)計引物：F1和R1、F2和R2、F3和R3進行PCR擴增驗證，引物序列如表1所示。擴增體系為25 μL（下同）：Ex Taq酶0.25 μL、2×GC Buffer II 12.5 μL、2.5 mmol L-1dNTPs 1.5 μL、10 mmol/L 上下游引物各 1 μL，模板 cDNA 1 μL和ddH2O 7.75 μL。DoInvInh1 PCR反應(yīng)體系：94℃ 5 min ；94℃ 50 s，58℃ 30 s，72℃ 1min，35 個循環(huán) ；72℃延伸10 min。DoInvInh2和DoInvInh3 PCR擴增時的退火溫度分別為57℃和56℃。PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化后克隆到T載體，轉(zhuǎn)入感受態(tài)細胞DH5α中，經(jīng)菌液PCR檢測正確后送深圳華大測序。

1.2.3 生物信息學分析 利用http://web.expasy.org/protparam分析編碼蛋白的氨基酸組成、理論分子量和等電點；利用http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html分析跨膜結(jié)構(gòu)；利用MEGA6.0軟件構(gòu)建基因系統(tǒng)進化樹；利用http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP分析蛋白的亞細胞定位；利用http://smart.embl-heidelberg.de進行保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測；利用Vector NTI Advance 11.0進行氨基酸序列同源性比對分析；利用http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP分析蛋白信號肽；利用http://hits.isb-sib.ch/cgi-bin/motif_scan分析蛋白的活性位點。

表1 實驗中所用引物

1.2.4 基因表達、轉(zhuǎn)化酶酶活性和還原糖含量的測定 依據(jù)3個DoInvInh基因的全長cDNA核苷酸序列，設(shè)計用于實時熒光定量PCR的引物：TF1和TR1、TF2和TR2、TF3和TR3（表1）。以持家基因Actin為內(nèi)參基因，引物序列參照蔣園等［11］的方法。利用熒光染料法進行實時熒光定量表達分析，反應(yīng)參數(shù)：95℃ 30 s，一個循環(huán)；95℃ 5 s，60℃ 20 s，共45個循環(huán)。采用2-ΔΔCT法分析數(shù)據(jù)，分析基因的相對表達量。莖中還原糖含量的測定，采用硫酸蒽酮法?？扇苄运嵝赞D(zhuǎn)化酶（Soluble acid invertase，SAI）和細胞壁結(jié)合轉(zhuǎn)化酶（Cell wall invertase，CIN）酶活性的提取和測定參照?？∑娴龋?2］的方法。利用SPSS19.0進行數(shù)據(jù)分析，采用 Duncan 新復(fù)極差法，顯著水平為0.05。采用Pearson相關(guān)系數(shù)法分析相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1 鐵皮石斛InvInh家族基因的克隆和序列分析

DoInvInh1、DoInvInh2和 DoInvInh3基因的 編碼區(qū)引物的PCR擴增產(chǎn)物，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測（圖1）。其序列測序結(jié)果分別為531 bp、534 bp和537 bp，與預(yù)測的大小相符，與從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中篩選出的InvInh基因的同源性都在99.5%以上，說明拼接結(jié)果正確。DoInvInh1基因cDNA序列全長928 bp，包含6 bp 的5'非翻譯區(qū)（Untranslated Regions，UTR），391 bp的 3'UTR和 1個531 bp開放閱讀框（Open reading frame，ORF），編碼176 個氨基酸。DoInvInh2基因cDNA序列全長722 bp，包含84 bp的5'UTR，104 bp的3'UTR和1個534 bp的ORF，編碼177 個氨基酸。DoInvInh3基因 cDNA序列全長674 bp，包含32 bp的5'UTR，105 bp的3'UTR和1個534 bp的ORF，編碼178 個氨基酸。這3個DoInvInh基因已在GenBank數(shù)據(jù)庫注冊，其注冊號為KY947274- KY947276（表2）。

2.2 DoInvInh家族基因成員的編碼蛋白質(zhì)的性質(zhì)分析

圖1 鐵皮石斛3個DoInvInh基因ORF序列的PCR擴增產(chǎn)物的電泳檢測

利用ProtParam對3個DoInvInh蛋白的理化性質(zhì)進行分析，預(yù)測分子量在18.38-18.84 kD，等電點在4.4-6.25。DoInvInh2蛋白和DoInvIn3蛋白的等電點比較接近，都在6.0以上，而DoInvInh1蛋白的等電點較低，為4.4。3個DoInvInh基因核苷酸序列同源率在49%-60%之間，氨基酸序列同源性在28%-41%之間，其中DoInvInh2蛋白的氨基酸與DoInvIn3蛋白的氨基酸序列同源性比較高，為41%，而DoInvInh2和DoInvIn3之間氨基酸序列同源性較低，為28%（表2）。3個DoInvInh蛋白的親水性指數(shù)為0.06-0.121，為疏水性蛋白；不穩(wěn)定指數(shù)在30.49-48.01之間，為不穩(wěn)定蛋白；都具有2個跨膜結(jié)構(gòu)和PMEI蛋白的保守結(jié)構(gòu)域。在N端都具有一個1-23 bp信號肽序列；Target P1.1在線軟件預(yù)測3個DoInvInh蛋白都屬于分泌型蛋白，其可能性為分別為0.931、0.712和0.959；利用Motif Scan Results進行蛋白活性位點的分析，3個DoInvInh蛋白都具有糖基化位點、絡(luò)蛋白激酶 II磷酸化位點、豆蔻?；稽c和蛋白激酶C磷酸化位點。

2.3 DoInvInh家族蛋白的二級和三級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析

利用http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred分析蛋白的二級結(jié)構(gòu)，結(jié)果（圖2）顯示3個DoInvInh蛋白都含有7個α-螺旋，不含β-折疊。在DoInvInh1、DoInvInh2和DoInvInh3 蛋白二級結(jié)構(gòu)中，α-螺旋分別占80%，79%和79%，無規(guī)則卷曲分別占23%、21%和20%，跨膜螺旋分別占9%、10%和9%，且3個跨膜螺旋都位于第7個α-螺旋上。利用Phyre2預(yù)測三級結(jié)構(gòu)，3個DoInvInh蛋白的具有相似的三級空間結(jié)構(gòu)。

表2 鐵皮石斛InvInh蛋白的分子特性和同源性

圖2 DoInvInh蛋白的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

2.4 不同物種間InvInh基因所編碼蛋白質(zhì)的同源性分析

運用Vector NTI Advance 11 軟件上的AlignX對10種（鐵皮石斛、擬南芥、甜瓜、黃瓜、馬鈴薯、大麥、水稻、高粱、甘蔗和玉米）植物的12個InvInh蛋白的氨基酸序列進行同源性比對分析（圖3）。InvInh蛋白的氨基酸序列在不同植物間保守性較差，不同物種間氨基酸序列的同源性在20%-50%之間。但所選的InvInh蛋白都具有10個保守的氨基酸，分別是1個丙氨酸Ala、1個絡(luò)氨酸Tyr、2個賴氨酸Leu、4個保守的半胱氨酸Cys位點和1個保守SP位點（絲氨酸Ser和脯氨酸Pro）。結(jié)合DoInvInh蛋白的二級結(jié)構(gòu)分析，4個Cys位點分別位于第2，第3，第5和第6個 α-螺旋上。

2.5 DoInvInh家族基因成員在鐵皮石斛不同部位中的表達分析

熒光定量PCR分析表明，DoInvInh1、DoInvInh2和DoInvInh3基因在鐵皮石斛根、莖、葉和花中均有表達，且具有一定的組織表達特異性（圖4）。DoInvInh1基因在莖中表達量最高，葉中次之，在花中最低，其中該基因在莖中表達量分別是葉和花中基因表達量的2.09倍和5.99倍。DoInvInh2和DoInvInh3基因在鐵皮石斛不同部位表達模式相似，都是在花中表達量最高，根中表達量最低。DoInvInh2和DoInvInh3在花中基因的表達量分別是根中基因表達量的3.97倍和4.07倍。DoInvInh2基因在莖中基因表達量高于葉中基因表達量，而DoInvInh3基因則相反。

2.6 不同生長年限鐵皮石斛莖中InvInh基因表達量、轉(zhuǎn)化酶和還原糖含量的變化分析

在3年生鐵皮石斛植株中，DoInvInh1和DoInvInh3基因在莖中的表達模式相同，其基因表達量都呈“1年生莖＞2年生莖＞3年生莖”（圖5），DoInvInh1和DoInvInh3基因在1年生莖中基因表達量分別是3年生莖中基因表達量的3.84和3.55倍。DoInvInh2基因在2年生莖中基因表達量最高，1年生莖中次之，3年生莖中最低。其中2年生莖中基因表達量分別是1年生莖和3年生莖中基因表達量的1.79倍和3.40倍。

1年生莖中可溶性糖含量顯著高于2年生和3年生莖中的可溶性糖含量（圖6），而2年生莖與3年生莖中可溶性糖含量差異不顯著。SAI酶活性在鐵皮石斛不同生長年限的莖中表達模式呈“ 1年生莖＞2年生莖＞3年生莖”（圖7），其中1年生莖中SAI酶活性是3年生莖中的1.43倍，達到差異顯著水平。而CIN酶活性則相反，呈“ 3年生莖＞2年生莖＞1年生莖”，CIN酶在3年生莖中的酶活性分別是1年生莖和2年生莖中酶活性的4.69和1.57倍，且酶活性均達到差異顯著水平（圖8）。相關(guān)性分析表明，莖中可溶性糖與SAI酶活性呈顯著正相關(guān)，其相關(guān)系數(shù)分別為0.944。CIN與SAI酶活性呈顯著負相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為-0.997。DoInvInh1和DoInvInh3基因表達量與CIN酶活性呈顯著負相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為-0.948和-0.946。

3 討論

隨著核苷酸測序技術(shù)的不斷發(fā)展，植物轉(zhuǎn)錄組成為一個新的研究熱點?；诟咄哭D(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的分析研究，將有助于獲得新的功能基因，為種質(zhì)資源鑒定、保存、擴大與優(yōu)良種質(zhì)選育奠定分子基礎(chǔ)。本研究在鐵皮石斛葉片轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析的基礎(chǔ)上，采用PCR技術(shù)首次從鐵皮石斛中克隆出3個DoInvInh基因，它們所編碼蛋白都具有保守的PMEI結(jié)構(gòu)域，都屬于INV/PMEI家族基因成員。3個DoInvInh蛋白N端都具有4個不對稱的α-螺旋結(jié)構(gòu)和4個保守的Cys位點，它們在穩(wěn)定InvInh蛋白構(gòu)型和功能中起作用。4個α-螺旋在維持InvInh蛋白結(jié)構(gòu)的完整性中起重要作用，而4個α-螺旋結(jié)合區(qū)是與酸性轉(zhuǎn)化酶結(jié)合的重要區(qū)域［13］。不同物種InvInh蛋白的氨基酸序列差異較大，即使在同一物種內(nèi)其氨基酸序列也不保守，但都包含4個保守的Cys［14］。3個DoInvInh蛋白推測的三級結(jié)構(gòu)相似，其中第1和第2個Cys形成分子內(nèi)第1個二硫鍵，第3和第4個Cys形成分子內(nèi)第2個二硫鍵。二硫蘇糖醇（DTT）能破壞分子內(nèi)二硫鍵，使InvInh失去抑制作用。煙草抑制子在高溫和低pH值下能保持穩(wěn)定，就是由于Cys間形成了分子內(nèi)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的二硫橋的緣故［15］。

圖3 DoInvInh蛋白與其他植物InvInh蛋白的多序列比對

圖4 三個DoInvInh基因在鐵皮石斛不同部位中的表達分析

圖5 鐵皮石不同生長年限莖中InvInh基因的表達分析

圖6 鐵皮石斛不同生長年限莖中可溶性糖含量分析

圖7 鐵皮石不同生長年限莖中SAI酶活性分析

圖8 鐵皮石不同生長年限莖中CIN酶活性分析

基因的表達模式分析可為基因功能的揭示提供重要線索。通過RNAi沉默大豆GmCIF基因的表達，能提高CIN酶活性，增加種子重量，同時能提高成熟種子中己糖、淀粉和蛋白質(zhì)的含量［16］。番茄（SiVIF）通過與液泡轉(zhuǎn)化酶（SiVI）相互作用，來調(diào)節(jié)蔗糖代謝過程，進而影響果實成熟。采用RNAi技術(shù)沉默番茄SlVIF基因的表達，番茄果實成熟延遲，而過表達SlVIF可以加速番茄果實成熟［17］。擬南芥AtCIF1基因定位于非原質(zhì)體，在CIF缺少的突變體中，種子萌發(fā)后的24 h內(nèi)CIN酶活性和己糖含量都顯著升高。而在過表達AtCIF1的擬南芥植株中，CIN酶活性受到抑制，能推遲種子萌發(fā)。AtCIF1在翻譯后水平調(diào)節(jié)CIN酶活性，通過調(diào)節(jié)蔗糖水解和糖信號，促進擬南芥種子萌發(fā)和早期生長［18］。本研究結(jié)果也表明，鐵皮石斛莖中DoInvInh1和DoInvInh3基因表達量與CIN酶活性呈顯著負相關(guān)，說明這2個基因可能具有抑制CIN酶活性的作用。而通過上述轉(zhuǎn)基因?qū)嶒炓沧C明過量表達InvInh基因，能抑制轉(zhuǎn)化酶活性，進而調(diào)節(jié)蔗糖代謝和庫強。

在擬南芥保衛(wèi)細胞中過量表達煙草CIF基因，與野生型相比保衛(wèi)細胞液泡轉(zhuǎn)化酶酶活性、氣孔和電導(dǎo)度都降低了，但抗旱能力提高了［19］。同時，RNAi抑制煙草CIN酶活性，能促進碳水化合物的消耗，降低合成次級代謝產(chǎn)物的能力［20］。以上實驗均表明InvInh在對轉(zhuǎn)化酶酶活性調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用，因此從分子水平上對InvInh基因研究的不斷深入，能使人們逐漸從本質(zhì)上了解該基因的組成、結(jié)構(gòu)及調(diào)控機理，為更好的調(diào)節(jié)其在植物中的表達和酶活性，改變庫組織的蔗糖輸入速率及同化物的分配和改善品質(zhì)提供依據(jù)和技術(shù)支持。

4 結(jié)論

本研究從鐵皮石斛中克隆到3個InvInh基因，它們編碼的蛋白都具有1個信號肽、2個跨膜結(jié)構(gòu)和PMEI蛋白的保守結(jié)構(gòu)域。DoInvInh蛋白都具有4個保守的Cys位點和SP位點，氨基酸序列同源性較低。3個DoInvInh基因在根、莖、葉和花均有表達，且表達模式不同。鐵皮石斛不同生長年限莖中DoInvInh1和DoInvInh3基因的表達模式相似，在1年生莖中表達量最高，2年生莖中次之，3年生莖中最低。DoInvInh1和DoInvInh3基因表達量與CIN酶活性都呈顯著負相關(guān)，推測這2個基因可能在調(diào)節(jié)莖中CIN酶活性中起作用。

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