周 偏,蔡 坤,梁叢穎,劉四新,李從發(fā)*

(1.海南大學(xué) 食品學(xué)院,海南 ?？?570228；2.海南大學(xué) 材料與化工學(xué)院,海南 ?？?570228)

諾麗(Morinda citrifoliaLinn)又稱海巴戟、海巴戟天,屬茜草科海巴戟天屬藥用植物,主要分布在南太平洋諸島嶼、澳大利亞、東南亞以及我國的海南島、西沙群島和臺灣等地[1]。在波利尼西亞,諾麗作為保健食品和藥品已有2 000多年的歷史,其果實(shí)、葉片、種子、花、莖、根及樹皮也常被用來治療各種疾病,因此又被稱為“超級水果”[2]。諾麗含有豐富的功能活性成分,主要包括多種氨基酸、維生素、酚類化合物、多糖、有機(jī)酸、生物堿、蒽醌、莨菪亭、環(huán)烯醚萜類化合物等[3-4]。現(xiàn)代研究證實(shí),諾麗具有抗血栓、降血糖、抗癌、抗菌活性,以及清除自由基,調(diào)節(jié)膽固醇,刺激免疫系統(tǒng),調(diào)節(jié)細(xì)胞功能和凈化血液等多種功能,對癌癥、糖尿病、痛風(fēng)等多種疾病有較好的預(yù)防和治療作用[5-7]。目前投放市場的諾麗產(chǎn)品主要有:諾麗酵素、鮮榨汁、果粉以及果茶等,其中以諾麗酵素最為暢銷。酵素作為目前新興的功能性微生物發(fā)酵產(chǎn)品,市場潛力巨大,受到越來越多的關(guān)注。酚類物質(zhì)是諾麗發(fā)酵產(chǎn)品中的重要指標(biāo),它決定了產(chǎn)品的色澤和風(fēng)味,而且對產(chǎn)品的各種保健功效也有很大貢獻(xiàn)[8-9]。當(dāng)前國內(nèi)諾麗加工企業(yè)的諾麗酵素產(chǎn)品的生產(chǎn)工藝是基于傳統(tǒng)波利尼西亞人的處理方法[10-11]加以改良,以傳統(tǒng)自然發(fā)酵工藝為主(時間為2個月至1年不等),發(fā)酵周期不確定,產(chǎn)品品質(zhì)不穩(wěn)定。所以,闡明諾麗酵素在自然發(fā)酵過程中抗氧化活性的變化動態(tài)及其品質(zhì)是很有必要的。為此本實(shí)驗(yàn)以諾麗果為研究對象,采用福林酚法、硝酸鋁顯色法和四種評價體系對諾麗發(fā)酵過程中總酚、總黃酮的含量及抗氧化活性的變化進(jìn)行檢測分析,并對諾麗酵素的理化指標(biāo)及酶系進(jìn)行測定。以期探討諾麗果自然發(fā)酵過程中抗氧化活性動態(tài)的變化規(guī)律,科學(xué)評價諾麗酵素的抗氧化活性及其品質(zhì),為進(jìn)一步開展諾麗自然發(fā)酵功能性成分的動態(tài)研究及發(fā)酵工藝的改善提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

諾麗鮮果由溪地陽光(海南)生物科技有限公司提供,其產(chǎn)自海南省萬寧市,屬熱帶季風(fēng)氣候。于2016年11月采摘自然開花,自然成熟,生長良好,成熟一致的果實(shí),從中挑選出無病害、無機(jī)械損傷的成熟諾麗果經(jīng)人工清洗自然風(fēng)干備用。

福林酚:北京索萊寶科技有限公司；沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品(純度＞98%)、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(純度＞98%)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)、2,2’-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(2,2'-azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate,ABTS):美國Sigma公司；其他試劑均為市售國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

TU-1810紫外可見分光光度計(jì):北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；AL204電子天平:梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；DK-98-1電熱恒溫水浴鍋:天津泰斯特儀器有限公司；TG16-WS高速離心機(jī):長沙平凡儀器儀表有限公司；3B-5200-DTD超聲波清洗機(jī):寧波新芝生物科技股份有限公司；LRH-250A生化培養(yǎng)箱:韶關(guān)市泰宏醫(yī)療器械有限公司；SW-CJ-1FD潔凈工作臺:蘇州佳寶凈化工程設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 諾麗酵素發(fā)酵工藝流程

諾麗鮮果→清洗→消毒→瀝干→裝于發(fā)酵罐→自然發(fā)酵→過濾→殺菌→諾麗酵素

操作要點(diǎn):選取新鮮成熟、無腐爛變質(zhì)、無病蟲害的諾麗果,清洗其表面,經(jīng)無菌水洗滌多次后放置于無菌操作臺,待諾麗果干燥后,裝入發(fā)酵罐內(nèi)。發(fā)酵罐先經(jīng)高溫殺菌(121℃、15 min)處理使其保持無菌狀態(tài)。發(fā)酵罐放置暗處,室溫(22～28℃)自然發(fā)酵3個月,當(dāng)酚類物質(zhì)含量趨于穩(wěn)定時,酵素發(fā)酵結(jié)束,后經(jīng)過濾、殺菌得諾麗酵素成品。

取樣:每隔6 d取樣一次,樣品經(jīng)8 000 r/min低溫離心10 min后,取上清液用于測定。

1.3.2 總酚含量的測定

參照YANGJ等[12]所述Folin-Ciocalteu比色法測定。以沒食子酸質(zhì)量濃度(x)為橫坐標(biāo),波長765 nm處吸光度值(y)為縱坐標(biāo),繪制沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線。沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程為y=0.103 7x+0.015 2,相關(guān)系數(shù)R2=0.998 9。根據(jù)沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程計(jì)算樣品中總酚含量。

1.3.3 總黃酮含量的測定

參照程池等[13]所述NaNO2-Al(NO3)3比色法測定。以蘆丁質(zhì)量濃度(x)為橫坐標(biāo),波長510 nm處吸光度值(y)為縱坐標(biāo),繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)線性回歸方程為:y=0.0071x-0.025 5,相關(guān)系數(shù)為R2=0.998 6。根據(jù)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算樣品中總黃酮含量。

1.3.4 DPPH·清除能力測定

參考MISHRA K等[14]的方法測定:于試管中依次加入無水乙醇、DPPH、待測液、混勻,30 min后在波長517 nm處測吸光度值記為Ai；以無水乙醇代替DPPH,測吸光度值記為Aj；以蒸餾水代替待測液,測吸光度值記為Ac。每個試樣重復(fù)3次。DPPH自由基清除率計(jì)算公式如下:

1.3.5 ABTS·清除能力測定

參考RE R等[15]的方法測定:于試管中依次加入無水乙醇、ABTS、待測液、混勻,6 min后在波長734 nm處測吸光度值記為Ai；以無水乙醇代替ABTS,測吸光值記為Aj；以乙醇代替待測液,測吸光度值記為Ac。每個試樣重復(fù)3次。ABTS自由基清除率計(jì)算公式如下:

1.3.6 ·OH清除能力測定

參考張偉敏等[16]的方法測定:于試管中依次加入FeSO4、水楊酸-乙醇、H2O2、待測液、混勻,10 min后在波長510 nm處測吸光度值記為Ai；以蒸餾水代替H2O2,測吸光度值記為Aj；以蒸餾水代替待測液,測吸光度值記為Ac。每個試樣重復(fù)3次。羥基自由基清除率計(jì)算公式如下:

1.3.7 總還原力能力測定

參考OYAIZU M等[17]的方法測定:取待測液進(jìn)行試驗(yàn),以空白樣品調(diào)零,測定各樣品波長700 nm處的吸光度值。每個試樣重復(fù)3次。

1.3.8 理化指標(biāo)測定

pH值測定:取50 mL諾麗酵素,置于小燒杯中,用pH酸度計(jì)測定pH值；總酸含量測定:參照GB/T 12456—2008《食品中總酸的測定》,以乙酸計(jì)量；蛋白質(zhì)含量測定:采用考馬斯亮藍(lán)方法[18]測定,通過牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程(y=0.020 7x+0.054 2,相關(guān)系數(shù)R2=0.998 3)計(jì)算；還原糖含量測定:采用3,5-二硝基水楊酸(3,5-dinitrosalicylic acid,DNS)顯色法[19]測定,通過葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程(y=0.993 2x-0.008 7,相關(guān)系數(shù)R2=0.999 7)計(jì)算；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性測定:采用WST-1法[20]測定,按照SOD檢測試劑盒測定步驟在酶標(biāo)儀上進(jìn)行；淀粉酶活性測定:采用碘-淀粉比色法,按照淀粉酶測定試劑盒測定步驟進(jìn)行。

1.3.9 統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均是3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值,結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。應(yīng)用SPSS 24.0軟件進(jìn)行顯著性和相關(guān)性分析,采用Origin 8.5軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 諾麗酵素自然發(fā)酵過程中總酚含量的變化

諾麗酵素自然發(fā)酵過程中總酚含量變化結(jié)果見圖1。由圖1可知,在整個諾麗發(fā)酵過程中,總酚含量總體呈先下降后上升再下降趨勢。在發(fā)酵前24 d,總酚含量顯著降低(P＜0.05),由最初的1.31 mg/mL下降至24 d的1.12 mg/mL,其減少的原因可能是在發(fā)酵初期,發(fā)酵液中的多酚類物質(zhì)不斷被氧化或沉淀,多酚類化合物可以與蛋白質(zhì)等結(jié)合或吸附,從而導(dǎo)致酚類物質(zhì)含量的降低[21]。隨著發(fā)酵時間的延長,發(fā)酵液中總酚含量則顯著升高(P＜0.05),并在60 d時達(dá)到最高,其含量為1.61 mg/mL。發(fā)酵至中期,隨著諾麗果汁液的滲出,導(dǎo)致果實(shí)大部分浸漬到發(fā)酵液中,有利于果肉中的多酚類化合物溶出,同時也可能隨著發(fā)酵的進(jìn)行,單體酚化合物的合成,多酚含量增加[22]。隨后總酚含量開始顯著下降(P＜0.05),有可能是發(fā)酵后期產(chǎn)生的有機(jī)酸與酚類反應(yīng),生產(chǎn)酚酸類化合物,導(dǎo)致酚類物質(zhì)快速減少[23],其次多酚化合物最重要的化學(xué)特征是可以通過疏水鍵和多元?dú)滏I與蛋白質(zhì)發(fā)生結(jié)合,也可以與生物堿、多糖等生物大分子發(fā)生相似的反應(yīng),另外還可以與金屬離子發(fā)生絡(luò)合反應(yīng),這些均可能導(dǎo)致發(fā)酵后期總酚含量下降[24]。

圖1 發(fā)酵過程中總酚含量的變化Fig.1 Changes of total phenols contents during fermentation process

2.2 諾麗酵素自然發(fā)酵過程中總黃酮含量的變化

諾麗酵素自然發(fā)酵過程中總黃酮含量變化結(jié)果見圖2。由圖2可知,在整個諾麗發(fā)酵過程中,總黃酮的含量呈現(xiàn)先下降后升高的趨勢。在發(fā)酵前30d,總黃酮含量顯著下降(P＜0.05),從最初的0.44 mg/mL下降至30 d的0.31 mg/mL,與發(fā)酵前期總酚含量的變化趨勢相類似,可能是在發(fā)酵前期,總黃酮類化合物有部分氧化或轉(zhuǎn)化為其他物質(zhì)。隨后總黃酮含量逐漸上升(P＜0.05),發(fā)酵至54 d時,總黃酮含量達(dá)到最高0.39 mg/mL,也可能是隨著果肉浸漬,總黃酮類化合物從果中滲出導(dǎo)致總黃酮含量上升。隨著發(fā)酵時間繼續(xù)延長,總黃酮含量有一定的下降,68d后基本維持穩(wěn)定。可能是由于發(fā)酵液中游離態(tài)的黃酮醇類物質(zhì)易與所存在的糖苷結(jié)合,從而形成配糖體,導(dǎo)致黃酮類物質(zhì)中的楊梅黃酮、毛地黃黃酮、槲皮素和山奈酚含量降低[25],同時黃酮醇配糖體隨著發(fā)酵繼續(xù)的進(jìn)行又不斷地發(fā)生水解[26],因此表現(xiàn)出總黃酮含量在發(fā)酵過程中呈現(xiàn)波動形變化。

圖2 發(fā)酵過程中總黃酮含量的變化Fig.2 Changes of total flavonoids contents during fermentation process

2.3 諾麗酵素自然發(fā)酵過程中抗氧化活性的變化

不同的抗氧化化合物可能通過不同的作用機(jī)制與氧化劑發(fā)生反應(yīng),一個孤立的方法很難全面評估抗氧化劑的抗氧化能力,因此通常使用多種測定方法體系來衡量抗氧化特征[27-28]。在本文中,通過比較DPPH自由基體系、ABTS自由基體系、羥自由基體系和總還原力體系4種抗氧化活性體系評價諾麗酵素自然發(fā)酵過程中抗氧化能力。諾麗酵素在自然發(fā)酵過程中抗氧化活性能力的變化結(jié)果如圖3所示。

由圖3可知,DPPH自由基清除率、ABTS自由基清除率、羥自由基清除率和總還原力能力四者較為一致地描述了發(fā)酵過程中抗氧化活性的變化規(guī)律。發(fā)酵過程中抗氧化能力大體上呈現(xiàn)先下降后上升再下降的趨勢。在發(fā)酵前12 d,ABTS自由基清除率、羥自由基清除率和總還原能力均迅速下降至最低,分別從66.87%、49.24%、0.583降低至60.78%、44.29%、0.520,DPPH自由基清除率在發(fā)酵前6 d從63.27%下降至最低60.12%,在隨后的40多天又開始逐步上升,DPPH自由基清除率和羥自由基清除率在54 d時達(dá)到峰值,清除率分別為71.22%、58.64%,ABTS自由基清除率在66 d時達(dá)到峰值76.21%,總還原能力在72 d時最高0.593。結(jié)果表明,發(fā)酵時間在54～72 d時,諾麗酵素的抗氧化活性較好。

2.4 諾麗酵素自然發(fā)酵過程中總酚、總黃酮含量和抗氧化能力的相關(guān)性

對諾麗酵素自然發(fā)酵過程中總酚、總黃酮含量與DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力、羥自由基清除能力和總還原力能力,進(jìn)行了Pearson法相關(guān)性分析,結(jié)果如表1所示。由表1可知,DPPH、ABTS自由基清除能力分別和羥自由基清除能力呈極顯著正相關(guān)性(P＜0.01),同時DPPH自由基清除能力和ABTS自由基清除能力呈顯著正相關(guān)性(P＜0.05),這和以往的報道是一致的[29-32]。在發(fā)酵過程中,總酚含量與DPPH自由基、羥自由基清除能力呈極顯著正相關(guān)(P＜0.01,DPPH:R=0.842；·OH:R=0.800),與ABTS自由基清除能力及總還原能力呈顯著正相關(guān)(P＜0.05,ABTS:R=0.778；還原力:R=0.509)；但總黃酮含量與自由基清除能力及總還原能力相關(guān)性較弱,兩者無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。這些研究結(jié)果表明,酚類化合物是諾麗酵素中抗氧化能力的主要來源。

表1 諾麗酵素中總酚、總黃酮含量和抗氧化能力的相關(guān)性分析Table 1 Correlation analysis of total phenols,total flavonoidscontents and antioxidant activity of Noni ferment

2.5 諾麗酵素理化品質(zhì)分析

對發(fā)酵三個月后的諾麗酵素產(chǎn)品進(jìn)行相關(guān)的理化品質(zhì)分析結(jié)果如表2所示。由表2可知,諾麗酵素的pH值、總酸、蛋白質(zhì)和還原糖含量分別為3.65、2.475g/L、0.161mg/mL和29.351 mg/mL。適宜的酸度會增添諾麗酵素的口感和風(fēng)味,伴有濃郁的典型的諾麗果香。蛋白質(zhì)和還原糖一方面是諾麗酵素重要的營養(yǎng)物質(zhì),同時除了提供相應(yīng)的口感風(fēng)味,還可作為非酶褐變、酶褐變反應(yīng)的底物之一,參與色素的合成。同時諾麗酵素中SOD活性達(dá)到376.426 U/mL,淀粉酶活性為17.645U/mL。相對比報道的其他水果酵素[33-34],可看出諾麗酵素具有更強(qiáng)的SOD活性和一定的淀粉酶活性,這從側(cè)面也顯示諾麗酵素具有更優(yōu)的清除自由基能力和抗氧化活性,以及一定的助消化功效。表明了諾麗酵素具有良好的食用特性。

表2 諾麗酵素理化指標(biāo)分析Table 2 Physical and chemical indicators analysis of Noni ferment

3 結(jié)論

通過對諾麗酵素在自然發(fā)酵過程中總酚、總黃酮含量以及抗氧化活性的動態(tài)變化和產(chǎn)品品質(zhì)進(jìn)行研究,結(jié)果表明,諾麗酵素在自然發(fā)酵過程中,總酚、總黃酮含量和抗氧化能力總體呈先下降后升高再逐漸下降趨勢?？偡雍吭谧匀话l(fā)酵至60 d時達(dá)到最高1.61 mg/mL,總黃酮含量在54 d時達(dá)到最高0.39 mg/mL；DPPH、ABTS、羥基自由基清除能力和總還原能力在54～72 d時達(dá)到最高(71.22%、76.21%、58.64%、0.59)。同時,在自然發(fā)酵過程中自由基清除能力和總還原力與總酚含量均具有顯著的正相關(guān)性(P＜0.05)。此外,諾麗酵素發(fā)酵三個月后的pH值、總酸、蛋白質(zhì)和還原糖含量分別為3.65、2.48 g/L、0.16 mg/mL和29.35 mg/mL,超氧化物歧化酶(SOD)活性和淀粉酶活性分別達(dá)到376.43 U/mL和17.65 U/mL。綜合表明諾麗酵素自然發(fā)酵至54～72 d時,其抗氧化能力最強(qiáng),同時具有營養(yǎng)補(bǔ)給、抗衰老、助消化等功能,可預(yù)見其在美容、保健和醫(yī)藥行業(yè)有較好的應(yīng)用前景。

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