喬 羽,于 迪,邢曉瑩,范振宇,王如福*

(山西農業(yè)大學 食品科學與工程學院,山西 晉中 030801)

淀粉酶是催化淀粉、糖原、糊精中糖苷鍵水解的一類酶的統(tǒng)稱,廣泛用于食品加工、釀造、制藥、紡織、飼料等領域[1]。淀粉酶廣泛存在于自然界多種生物體中,其中微生物淀粉酶來源非常廣泛,如真菌中的米曲酶和黑曲霉,細菌中的枯草芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌等[2-3]。

山西老陳醋歷史悠久,是我國傳統(tǒng)的四大名醋之一,它以高粱為主要原料,以麩皮、谷糠和稻殼為輔料,利用大曲作為糖化發(fā)酵劑,經酒精發(fā)酵、醋酸發(fā)酵等工序釀制而成。其釀造過程從微生物的角度看,實質上是一個特定的微生物群體共代謝的過程[4]。除了起主要發(fā)酵作用的酵母菌、乳酸菌和醋酸菌,芽孢桿菌在大曲和整個發(fā)酵過程中始終存在。目前有研究報道,在大曲制作的最后階段,芽孢桿菌成為占主導地位的菌群之一,這可能是由于其極強的抗逆性[5-7]。此外有研究發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌在醋酸發(fā)酵階段芽抱桿菌的活動規(guī)律及其數(shù)量變化曲線同醋酸菌基本一致,呈現(xiàn)先增后減的趨勢,且它與醋酸菌協(xié)同參與發(fā)酵,對食醋酸度、風味形成具有一定的促進作用[8-9]。

芽孢桿菌代謝可產生淀粉酶,發(fā)酵過程中淀粉酶總活力的高低決定了老陳醋發(fā)酵過程中原輔料中淀粉的轉化效率,進而影響最終醋的產量。因此在老陳醋發(fā)酵過程中,如果能對產淀粉酶芽孢菌合理的應用,則可能提高對淀粉原料的分解利用,進而提高出醋率,同時也能在一定程度上改善產品風味。本研究跟蹤山西老陳醋的整個發(fā)酵過程,從不同發(fā)酵天數(shù)的酒醪和醋醅中篩選產淀粉酶的芽孢桿菌。通過對產淀粉酶芽孢桿菌的初篩、酶活力測定及耐受性分析,篩選高產淀粉酶且耐受性較好的優(yōu)勢芽孢桿菌,以期為后期高淀粉酶活力復合菌劑的研制提供菌種基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗樣品

樣品取自山西某醋廠。酒醪發(fā)酵時間為1 d、4 d、7 d、10 d；醋醅發(fā)酵時間為1 d、3 d、5 d、7 d、9 d。每個樣品3份,置于4℃冰箱保存,備用。

1.1.2 試驗試劑

細菌基因組DNA提取試劑盒:北京艾德萊生物科技有限公司；D2000 DNA Ladder、2×Taq聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction,PCR)Master Mix:中科瑞泰(北京)生物科技有限公司；碘、碘化鉀、蔗糖(分析純):天津光復科技發(fā)展有限公司；鹽酸四甲基對苯二胺:東京化成工業(yè)株式會社；無水葡萄糖(分析純):天津市凱通化學試劑有限公司；可溶性淀粉(分析純):天津市大茂化學試劑廠。

1.1.3 培養(yǎng)基

營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基:蛋白胨10 g、牛肉膏3 g、氯化鈉5 g、瓊脂15 g,定容至1 000 mL,121℃滅菌15 min,備用。

營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基:蛋白胨10 g、牛肉膏3 g、氯化鈉5 g,定容至1 000 mL,121℃滅菌15 min,備用。

初篩培養(yǎng)基[10]:可溶性淀粉2 g、牛肉膏5 g、蛋白胨10 g、瓊脂粉18g、氯化鈉5g,定容至1000mL,121℃滅菌20min,備用。

改良發(fā)酵培養(yǎng)基[11]:高粱粉5 g、可溶性淀粉5 g、酵母膏5 g、蛋白胨10 g、葡萄糖1 g、KH2PO42 g、MgSO4·7H2O 0.5g、CaCl2·2H2O0.2g,定容至1000mL,121℃滅菌20min,備用。

1.2 儀器與設備

SPX-100B-Z生化培養(yǎng)箱:北京瑞科中儀科技有限公司；Neofuge 23R臺式高速冷凍離心機:上海力申科學儀器有限公司；2100型分光光度計:大尼科(上海)儀器有限公司；LEICA CM750生物顯微鏡:德國徠卡顯微系統(tǒng)有限公司；ZQPL-200立式全溫振蕩培養(yǎng)箱:天津萊玻特瑞設備有限公司；Centrifuge 5424R低速冷凍離心機:德國Eppendorf公司；DYY-6C型電泳儀:北京市六一儀器廠；凝膠成像分析系統(tǒng):美國UVP公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 產淀粉酶芽孢桿菌的菌落數(shù)量測定

稱取10g不同發(fā)酵天數(shù)的酒醪、醋醅樣品置于裝有90mL無菌水的三角瓶中,80℃水浴加熱10 min富集芽孢菌,對富集液進行10倍梯度稀釋；吸取100 μL不同稀釋倍數(shù)的菌懸液涂布至初篩培養(yǎng)基上,每個梯度做三個平行；30℃恒溫培養(yǎng)48 h后,加入一定量的盧氏碘液,染色5 min,選擇菌落數(shù)量在15～300的平板,記錄有明顯透明圈菌落的個數(shù)。

1.3.2 產淀粉酶芽孢桿菌的初篩

選擇有明顯透明圈單個菌落,采用分區(qū)劃線法連續(xù)純化3代后,固體斜面4℃保存?zhèn)溆?。將已純化的芽孢桿菌再次點接于初篩培養(yǎng)基上,30℃培養(yǎng)48 h后,滴加盧氏碘液,使其均勻覆蓋平板,用游標卡尺分別測量水解圈直徑(D1)和菌落直徑(D2),計算兩者比值(D1/D2)大小,初步確定淀粉酶活力的高低并挑選出比值較大的菌株。

1.3.3 菌株復篩

經初篩純化后的菌株挑取一環(huán)接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中,30℃搖床培養(yǎng)24h。按照2%接種量接種于裝有50mL發(fā)酵培養(yǎng)基的錐形瓶中,37℃、180 r/min搖床培養(yǎng)48 h。將發(fā)酵液置于50 mL的離心管中,8 000 r/min離心10 min,收集上清液為待測粗酶液。采用3,5-二硝基水楊酸法(3,5-dinitrosalicylic acid,DNS)測定待測粗酶液的淀粉酶活力,具體方法參考文獻[12-13]。酶活力單位定義:在40℃、pH值為3.7的條件下,每毫升酶液每分鐘水解可溶性淀粉產生1 μg葡萄糖為1個酶活力單位(U/mL)。

1.3.4 高產淀粉酶菌株的耐受性分析

耐乙醇能力分析:用接種環(huán)挑取一環(huán)菌接種于裝有10 mL營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基的試管中,37℃、220 r/min搖床培養(yǎng)18 h,然后按2%的接種量接種于裝有10 mL乙醇體積分數(shù)(V/V)分別為3%、6%、9%的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中,37℃、220 r/min搖床培養(yǎng)培養(yǎng)24 h,用分光光度計在波長600 nm條件下測定培養(yǎng)液的吸光度值。

耐酸能力分析:用接種環(huán)挑取一環(huán)菌接種于裝有10mL營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基的試管中,37℃、220 r/min搖床培養(yǎng)18 h,按2%的接種量分別接種于裝有10 mL用乙酸調節(jié)pH分別為3.5、4.5、5.5的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中,37 ℃、220 r/min搖床培養(yǎng)培養(yǎng)24 h,用分光光度計在波長600 nm處測定培養(yǎng)液的吸光度值。

不同溫度的生長情況分析:用接種環(huán)挑取一環(huán)菌于裝有10 mL營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基的試管中,37℃,220 r/min搖床培養(yǎng)18 h后,按2%的接種量接種于裝有10 mL營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中,分別在20℃、30℃、40℃、50℃培養(yǎng)溫度下,220 r/min搖床培養(yǎng)24 h,用分光光度計在波長600 nm處測定培養(yǎng)液的吸光度值。

1.3.5 高產淀粉酶菌株的鑒定

(1)形態(tài)學鑒定:將菌株劃線涂布于營養(yǎng)瓊脂平板上,于37℃培養(yǎng)24h,觀察菌落特征并描述。挑取單菌落進行革蘭氏染色對菌株的細胞形態(tài)進行觀察。

(2)生理生化鑒定:參照《伯杰細菌鑒定手冊》第8版中芽孢桿菌屬特征和《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[14-15]進行部分生理生化特性鑒定。

(3)分子生物學鑒定:采用16S rDNA鑒定,利用細菌基因組DNA提取試劑盒對菌株的基因組DNA進行提取,采用細菌16S rDNA通用引物27F和1492R為上下游引物,以菌株的DNA基因組為模板,PCR擴增菌株16S rDNA的部分基因序列。PCR擴增條件:94℃預變性5 min；94℃變性30 s,53℃退火30 s,72℃延伸1.2 min,30次循環(huán)；72℃延伸7min。取4μL的PCR產物于2%瓊脂糖凝膠中進行電泳,檢測是否擴增成功。將擴增成功的PCR產物送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序,測序結果在GenBank數(shù)據(jù)庫中進行BLAST比對,下載同源性高的序列,利用Mega 6.0軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結果與分析

2.1 山西老陳醋發(fā)酵過程中產淀粉酶芽孢桿菌的動態(tài)變化

圖1 發(fā)酵過程中產淀粉酶芽孢桿菌的菌落數(shù)量變化曲線Fig.1 Change curve of the colony number of amylase-producing Bacillusduring fermentation

由圖1可知,山西老陳醋發(fā)酵過程中產淀粉酶的芽孢桿菌的菌落數(shù)量呈現(xiàn)先下降后上升然后下降的趨勢。在酒化階段,隨著發(fā)酵時間的推移,由于酒醪中酒精度的增加以及后期相對無氧的發(fā)酵環(huán)境,抑制了芽孢桿菌的生長,所以產淀粉酶芽孢桿菌的數(shù)量呈現(xiàn)下降的趨勢,在酒化最后一天其數(shù)量達到最低為4.0×104CFU/g。在醋化階段,隨著輔料加入稀釋了醋醅中的酒精濃度,并且醋醅處在一個開放的環(huán)境,產淀粉酶芽孢桿菌的數(shù)量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢,在醋酸發(fā)酵第3天達到最大為1.1×105CFU/g。隨后由于隨著醋醅中酸的逐漸積累,芽孢桿菌的數(shù)量呈現(xiàn)下降的趨勢,在醋酸發(fā)酵最后一天降至最低為3.3×104CFU/g。

2.2 產淀粉酶的芽孢桿菌初篩

從醋廠采集的不同發(fā)酵天數(shù)的酒醪和醋醅9份樣品中,分離純化得到60株產淀粉酶的芽孢桿菌。水解圈直徑(D1)、菌落生長直徑(D2)及其比值是表征菌株產酶能力高低的一個指標[16]。通過計算透明圈和菌落生長直徑的比值,挑選出比值＞4.5的16株芽孢桿菌。由表1可知,菌株JT10-9、CT32-3、CT73-6的D1/D2值都超過了9。說明其產淀粉酶的能力相對較高。

表1 產淀粉酶菌株初步篩選Table 1 Preliminary screening of amylase-producing strains

2.3 淀粉酶活力的測定

對挑選出來的16株產淀粉酶芽孢桿菌進行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng),對菌株粗酶液的淀粉酶活力進行測定。經發(fā)酵復篩,用軟件Prism作柱形圖并進行顯著性差異分析。復篩結果如圖2所示,16株芽孢桿菌的粗酶液在40℃、pH值為3.7的條件下,均有一定分解淀粉的能力,說明所選菌株具有產淀粉酶的能力。利用Prism對菌株淀粉酶活力大小進行顯著性分析可知,菌株JT10-9、JT 10-8、JT1-3、JT4-4、CT32-3和CT73-6的淀粉酶活力都高于180 U/mL,并顯著高于大部分菌株(P＜0.05),其中菌株JT10-9的淀粉酶活力最高,達到228.73 U/mL。選取菌株JT10-9、JT 10-8、JT1-3、JT4-4、CT32-3和CT73-6進行下一步耐受性試驗分析。

圖2 分離菌株的淀粉酶活力Fig.2 Amylase activity of the isolated strains

2.4 產淀粉酶菌株的耐受性分析

2.4.1 耐乙醇能力分析

圖3 產淀粉酶菌株的在不同乙醇體積分數(shù)培養(yǎng)基中的生長情況Fig.3 Growth status of amylase-producing strains at mediums with different ethanol concentrations

根據(jù)山西老陳醋實際生產情況可知,山西老陳醋酒化階段初期(0～2d)酒醪的乙醇體積分數(shù)能夠由0快速升高到6%左右,酒化結束時酒醪的乙醇體積分數(shù)能夠達到9%[17]。通過測定菌株培養(yǎng)液的光密度值,可反映菌株在不同乙醇體積分數(shù)的環(huán)境中的生長情況,進而可推斷菌株是否能應用在實際的生產環(huán)境中。由圖3可知,菌株JT10-9、JT10-8、JT1-3、JT4-4、CT32-3、CT73-6在乙醇體積分數(shù)為3%的培養(yǎng)基中生長良好。當乙醇體積分數(shù)升高至6%時,所有菌株培養(yǎng)液的OD600nm值都有所下降。當乙醇體積分數(shù)升高至9%,所有菌株培養(yǎng)液的OD600nm值下降明顯,但是菌株在乙醇體積分數(shù)為9%的環(huán)境中都能有所生長。因此,分離得到的6株產淀粉酶菌株均可耐受體積分數(shù)9%的乙醇,其中菌株JT10-9耐乙醇能力較強。

2.4.2 耐酸能力分析

圖4 產淀粉酶菌株在不同pH培養(yǎng)基中的生長情況Fig.4 Growth status of amylase-producing strains at mediums with different pH

根據(jù)山西老陳醋實際生產情況及本實驗室前期對發(fā)酵過程中pH變化測定結果,調節(jié)培養(yǎng)基的pH,考察菌株在pH 3.5～5.5環(huán)境中的生長狀況,結果見圖4。由圖4可知,各菌株在pH5.5的環(huán)境中生長較好。隨著pH的降低至3.5時,產淀粉酶菌株的生長情況受到不同程度的抑制。菌株JT10-8和菌株JT1-3的OD600nm值降到了0.1以下,幾乎停止生長。菌株JT10-9、CT32-3、CT73-6的生長雖然受到抑制,但均能在pH3.5的環(huán)境中生長。說明菌株JT10-9、CT32-3和CT73-6的耐酸能力較好。

2.4.3 溫度耐受能力分析

圖5 產淀粉酶菌株不同培養(yǎng)溫度下的生長情況Fig.5 Growth status of amylase-producing strains at different culture temperatures

根據(jù)山西老陳醋實際生產情況,選取在20℃、30℃、40℃和50℃溫度下培養(yǎng)高產淀粉酶的菌株,考察溫度對產淀粉酶菌株生長狀況的影響,結果見圖5。由圖5可知,高產淀粉酶菌株均在30℃條件下生長良好,在此溫度下所有菌株的OD600nm值達到最大,30℃條件下各菌株的生長量遠高于其它培養(yǎng)溫度下的生長量。在40℃條件下,各菌株的OD600nm值高于20℃條件下的OD600nm值,并且顯著高于50℃條件下的OD600nm值。說明菌株在30～40℃環(huán)境中可以較好的生長。在50℃條件下,菌株CT73-6幾乎停止生長,說明其耐高溫能力較差。其他5株菌都可在50℃條件下的環(huán)境中生長,說明菌株JT10-9、JT10-8、JT1-3、JT4-4、CT32-3能夠適應大曲制作及山西老陳醋生產的環(huán)境。

2.5 菌株個體及菌落形態(tài)觀察結果

綜合所篩選菌株的耐受性分析可知,菌株JT10-9可完全適應山西老陳醋的發(fā)酵環(huán)境,所以對菌株JT10-9進行了個體形態(tài)和菌落形態(tài)的觀察,結果見圖6。由圖6可知,菌株JT10-9的菌體形態(tài)為桿狀,革蘭氏染色陽性,芽孢中生,孢囊不膨大。菌落直徑為2.20～3.10 mm,呈乳白色,不透明,隆起,邊緣不規(guī)則。

圖6 菌株JT10-9的細胞形態(tài)(A)及菌落特征(B)Fig.6 Cell morphology(A)and colony characteristics(B)of strain JT10-9

2.6 生理生化特性鑒定

菌株JT10-9菌株的生理生化鑒定結果見表2。由表2可知,菌株JT10-9的生理生化特征與《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》中芽孢桿菌屬特征相符,進一步確定菌株JT10-9屬于芽孢桿菌屬(Bacillussp.)。

表2 菌株JT10-9的生理生化鑒定結果Table 2 Physiological and biochemical identification results of strain JT10-9

2.7 菌株16SrDNA鑒定結果

以菌株JT10-9基因組DNA為模板,進行PCR擴增,如圖7所示,菌株的PCR擴增產物經2%瓊脂糖凝膠電泳檢測出在大約1500bp處存在一條特異性條帶。獲得的PCR產物經測序為1416 bp長度的序列。測序結果輸入到GenBank數(shù)據(jù)庫中通過Blast比對進行同源性比較。利用Mega 6.0軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹,結果如圖8所示。由圖8可知,菌株JT10-9在系統(tǒng)發(fā)育樹上與Bacillus amyloliquefaciens同屬于一個分支,通過Blast比對該菌株序列與已知多株Bacillus amyloliquefaciens16S rDNA的同源性高達99%以上。因此,結合菌株JT10-9的菌落形態(tài)、細胞形態(tài)、生理生化鑒定結果,初步確定菌株JT10-9為解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)。

圖7 菌株JT10-9基因的16S rDNA擴增PCR電泳結果Fig.7 Electrophoretic results of PCR amplification of 16S rDNA of strain JT10-9 gene

圖8 菌株JT10-9的系統(tǒng)發(fā)育進化樹Fig.8 Phylogenetic tree of strain JT10-9

2.8 討論

本試驗從山西老陳醋的不同發(fā)酵天數(shù)的酒醪和醋醅中分離產淀粉酶的芽孢桿菌,初篩采用的水解圈法,雖易于直觀的分離出淀粉酶產生菌,但初篩結果可能會受到平板pH、平板厚度不均一等因素的影響,水解圈法不能準確判斷菌株的淀粉酶活力的大小,所以采用DNS法對菌株的淀粉酶活力進一步的測定。本研究是在40℃,pH 3.7條件下測得菌株JT10-9的淀粉酶酶活力為228.73 U/mL,其作為野生土著細菌菌株,在酸性的條件下表現(xiàn)出的淀粉酶活力還是比較高的,而且芽孢桿菌能克服霉菌發(fā)酵中產生帶顏色的菌絲和孢子的缺點[13]。接下來可針對該菌株的酶學特性做進一步的研究分析。

3 結論

本試驗對山西老陳醋酒化階段和醋化階段產淀粉酶芽孢桿菌進行了分離篩選,得一株淀粉酶活力較高且耐受性較好的菌株JT10-9。對菌株JT10-9的菌落形態(tài)、細胞形態(tài)、生理生化鑒定以及16S rDNA鑒定,最后鑒定出菌株JT10-9為解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)。后期可采用生物技術手段對BacillusamyloliquefaciensJT10-9進行定向改造,以提高其在酸性條件下的淀粉酶活力。從而將其用于強化酒化發(fā)酵和醋化發(fā)酵以及酶制劑的研制,這對提高淀粉質原料的分解利用及耐酸型淀粉酶制劑的開發(fā)具有良好的應用前景。

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