袁玉娟，尼菲拉·甫拉緹，張艷君，穆葉賽·尼加提

心血管疾病的發(fā)病率在逐年升高，2015年中國心血管病報告[1]中指出，心血管病死亡率仍居各病種之首，高于腫瘤及其他疾病，近年來由于我國對心血管疾病防控的加強，心血管病的總死亡率上升趨勢有所減緩，但缺血性心臟病在總死亡中所占的比列仍持續(xù)增加，從2004年的71.2/10萬上升至2010年的92.0/10萬，年均上升幅度為5.05%[2]。缺血性心臟病中致死性最強的急性冠狀動脈綜合征（ACS），近幾年來發(fā)病率逐年升高。ACS是以冠狀動脈粥樣硬化斑塊不穩(wěn)定為基本病理生理特點，以急性心肌缺血為共同特征的一組臨床綜合征，包括急性ST段抬高型心肌梗死（STEMI）、非ST段抬高型心肌梗死（Non-STEMI）和不穩(wěn)定性心絞痛（UAP）。ACS發(fā)病急、病情重，往往導致患者因急性心肌缺血而死亡，1/2的心血管死亡原因歸結(jié)為ACS。

近幾年的研究發(fā)現(xiàn)，動脈粥樣硬化病灶局部及斑塊發(fā)生破裂的冠狀動脈局部血液中存在促凝血活性的微粒。微粒是細胞膜磷脂酰絲氨酸由細胞內(nèi)層進入細胞外層，以出芽的方式形成小泡狀結(jié)構(gòu)從細胞膜脫落，從而形成的磷脂囊泡，其直徑在0.1～1 μm之間，微粒的分類取決于其來源細胞，包括紅細胞源微粒、血小板源微粒和內(nèi)皮細胞源微粒等[3]，數(shù)量完全取決于各種刺激比如細胞的激活或者凋亡。在正常人中我們也可以檢測到微粒，視為生理性水平，相反在許多疾病狀態(tài)下，比如高血壓、糖尿病、腫瘤性等疾病微粒水平成病理性升高[4]。Leroyer等[5]從頸動脈內(nèi)膜切除術(shù)患者的頸動脈斑塊和血漿中提取微粒后發(fā)現(xiàn)，動脈粥樣硬化斑塊中有源于紅細胞的微粒，提示斑塊內(nèi)部有小血管破裂。我們假設(shè)ACS冠狀動脈局部斑塊中存在小血管的破裂后產(chǎn)生源于紅細胞的微粒，參與ACS發(fā)生、發(fā)展的過程。本研究旨在分析ACS患者與非冠心病患者外周血紅細胞源微粒的水平差異同時，分析ACS三類患者之間的差異，進一步探討紅細胞來源微粒與ACS發(fā)生的相關(guān)性。

1 資料與方法

研究對象：從2015-01至2016-09在我院心內(nèi)科住院的1 215例患者中篩選出150例患者納入我們的研究。所有患者入院時簽署知情同意書。研究對象分為：非冠心病（Non-CAD）組（n=45），其中男性26例，女性19例；高血壓病25例，糖尿病7例，吸煙11例；ACS組（n=105），其中男性75例，女性30例；高血壓病46例，糖尿病24例，吸煙41例。ACS組患者包括三類即急性STEMI亞組（n=37）、Non-STEMI亞組（n=31）和 UAP亞組（n=37）。為了收集研究對象的一般資料和心血管疾病相關(guān)危險因素，制定了詳細的調(diào)查問卷。該調(diào)查由問卷和體格檢查組成。調(diào)查問卷主要包括一般個人信息、職業(yè)、家族歷史、吸煙狀況和飲酒。體格檢查包含血壓、心率、心電圖、身高、體重、腰圍、腹圍和臀圍測量，同時完善患者臨床相關(guān)生化指標。

納入標準：所有入選患者均經(jīng)冠狀動脈造影證實冠狀動脈病變情況，冠狀動脈造影未見異常者視為Non-CAD患者，納入Non-CAD組。診斷標準：（1）UAP診斷標準是基于以前的研究：最近的一個月內(nèi)新發(fā)生的心絞痛，或一個月內(nèi)心絞痛惡化（心絞痛的分級增加了至少一級，或者達到三級，根據(jù)CCS評分，或在休息時出現(xiàn)心絞痛）。心電圖顯示出至少兩個相鄰導聯(lián)出現(xiàn)新的或動態(tài)變化的ST段或T波，而心肌肌鈣蛋白（cTn）T的檢查結(jié)果是正常。（2）急性心肌梗死（AMI）為胸痛持續(xù)時間＞20 min，AMI患者的心電圖顯示，在24 h內(nèi)至少兩個相鄰導聯(lián)出現(xiàn)ST段的抬高或壓低，其抬高者為急性STEMI，未抬高者為Non-STEMI，同時cTnT＞0.1 μg/L（正常價值 ＜0.05 μg/L）。

排除標準：（1）嚴重肝腎功能不全；（2）腫瘤以及其他消耗性疾??；（3）造血系統(tǒng)疾?。唬?）感染未控制；（5）其他部位梗死，如腦梗死、肺栓塞等。

樣本收集：為避免冠狀動脈造影及相關(guān)介入治療影響外周血微粒的水平，所有患者均在冠狀動脈造影前進行外周血采集用來檢測微粒水平。標本為入院24 h之內(nèi)患者的外周血，獲得知情同意書后，采集患者肘靜脈血2 ml，血常規(guī)、血脂等檢測均在清晨空腹靜息狀態(tài)下抽取外周血送檢。用檸檬酸鈉抗凝管（美國BD公司）收集。在血液取樣時保證止血帶不保持太長時間，從而避免誘導細胞的激活或凋亡。

一般項目和生化指標：（1）收集所有研究對象的一般資料，包括姓名、性別、年齡、吸煙（其中吸煙詳細記載吸煙年數(shù)；吸煙定義為每天吸煙1支以上且時間≥半年）、心血管病家族史（父母或兄弟姐妹患高血壓、腦卒中、冠心病情況）、服藥史等。（2）生化指標，包括總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C ）、脂蛋白a、超敏C-反應蛋白、D-二聚體、糖化血紅蛋白、紅細胞計數(shù)。

紅細胞源微粒的分離：外周血標本收集于帶有3.28%檸檬酸鈉（1:9）的抗凝管，混勻后離心。（1）血標本以3 500 g、室溫下離心10 min離出血細胞，以便獲取富血小板血漿（PRP）。用一次性吸管將1 ml上清液移入無菌的1.5 ml小試管中。（2）PRP經(jīng)過2 000 g、10℃離心15 min離心出大量血小板，上清液即為貧血小板血漿（PPP）。PPP用一次性吸管移入無菌的1.5 ml小試管中。（3）PPP在23 000 g、4℃離心45 min后，棄掉上清液，每管加入1 ml PBS緩沖液，連續(xù)吹打5 min，樣本與PBS緩沖液充分融。（4）在23 000 g、4℃離心30 min后，棄掉上清液，每管加入1 ml PBS緩沖液，連續(xù)吹打5 min。（5）在23 000 g、4℃離心20 min后，棄掉上清液，沉淀物為無血小板（PFP）的微粒，每管加入200 μl PBS緩沖液，連續(xù)吹打5 min，樣本與PBS緩沖液充分融合樣本標明收集日期以及患者入組編號于-80℃保存以便將來使用。

紅細胞源微粒進行定性、定量分析：用流式細胞儀測定紅細胞源微粒數(shù)量，對紅細胞源微粒進行定性、定量分析。將已提取的PFP在室溫下快速溶解，取2.5 μl標本后加入鈣離子載體A23187 100 μl， 加 入 Binding Buffer 100 μl和 annexin V（BD Biosciences，SanJose，美國 ）5 μl，充分混勻室溫暗處孵育20 min，加入紅細胞特異性抗體 Glycophorine A（BD Biosciences，SanJose，美國）CD235a 2.5 μl，充分混勻室溫暗處孵育20 min，最后加入PBS緩沖液175 μl。流式細胞儀專用試管編號，運行流式細胞儀（美國BD公司，F(xiàn)ACSAriaIITM），校準程序FACSCOMP，使用微球（0.1μm和2.0 μm）校正流式細胞儀，再Cell Quest配套軟件環(huán)境中，將流式細胞儀的前向光散射（FSC）和側(cè)向光散射（SSC）三色熒光（FL1-FL3）的檢測信號均設(shè)置為對數(shù)放大（LOG），分別檢測測定管和對照管中紅細胞源微粒的光散射和三色熒光強度，每次收集門內(nèi)細胞數(shù)10 000，以35 μl/min的流速讀30 s，計門內(nèi)紅細胞源微粒的數(shù)量同時分析特異性抗體標記的紅細胞的熒光百分率以進一步定性紅細胞源微粒，總共收集到10 000微球，利用BD FACSAriaIITM流式細胞分析儀和平均熒光強度分析，在第一個熒光通道的記錄的表明紅細胞源微粒的水平，最終紅細胞源微粒用百分比結(jié)果表示（圖1）。

圖1 流式細胞儀定性定量測定紅細胞源微粒結(jié)果

統(tǒng)計學分析方法：用SPSS 21.0軟件進行統(tǒng)計學分析。定量資料進行正態(tài)檢驗，正態(tài)分布資料采用統(tǒng)計描述為均值±標準差，各組之間進行方差齊性檢驗，方差齊時兩組之間連續(xù)變量差異分析采用t檢驗；定量資料若不滿足參數(shù)條件時以中位數(shù)和四分位數(shù)間距來表示，采用秩和檢驗；定性數(shù)據(jù)統(tǒng)計描述為計數(shù)個數(shù)，兩組之間采用χ2檢驗；紅細胞源微粒與心血管疾病危險性因素相關(guān)性檢驗采用多重線性回歸分析；檢驗水準0.05，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

兩組患者臨床基本信息及生化指標比較（表1）：兩組患者在年齡、是否合并糖尿病、是否合并高血壓、是否吸煙方面以及各項生化指標比較差異均無統(tǒng)計學意義（P均＞0.05）。

外周血紅細胞源微粒水平分析（圖2、3和表2）：對ACS組和Non-CAD組外周血紅細胞源微粒水平的正態(tài)性檢驗，兩組不滿足參數(shù)檢驗條件，以中位數(shù)和四分位數(shù)間距來表示，采用秩和檢驗。統(tǒng)計軟件分析得出ACS和Non-CAD兩組外周血紅細胞源微粒的水平（圖2）。ACS組中三類患者的紅細胞源微粒水平詳見圖3。兩組之間比較紅細胞源微粒水平的差異得出ACS組高于Non-CAD組（P＜0.05），同時比較分析ACS組三類患者紅細胞源微粒的水平，結(jié)果顯示差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，表2）。

維、漢兩民族外周血紅細胞源微粒水平差異性分析（表3）：兩組患者中維、漢兩民族外周血紅細胞源微粒水平分析顯示差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。 外周血紅細源微粒水平與心血管疾病危險因素的相關(guān)性：將所有研究對象根據(jù)有無糖尿病、有無高血壓病、有無吸煙史進行分組。經(jīng)過比較得出：吸煙者與非吸煙者，高血壓者與非高血壓病者，糖尿病者與非糖尿病者的外周血紅細胞源微粒水平差異均無統(tǒng)計學意義（P均＞0.05）。在全部研究對象中，以有關(guān)生化指標為X，包含血清TC水平、TG水平、LDL-C水平、HDL-C水平、脂蛋白a水平、糖化血紅蛋白水平、紅細胞計數(shù)，外周血紅細胞源微粒水平為Y，做X對Y的多重線性回歸分析，顯示血清LDL-C水平與紅細胞源微粒水平之間呈負相關(guān)（P＜0.05，表4）。

表1 兩組患者臨床基本信息及生化指標比較（例）

圖2 兩組患者外周血紅細胞源微粒水平

圖3 急性冠狀動脈綜合征組三類患者和非冠心病組患者外周血紅細胞源微粒水平

表2 冠狀動脈綜合征組三類患者和非冠心病組患者外周血紅細胞源微粒水平差異性分析結(jié)果

表3 兩組維吾爾族和漢族外周血紅細胞源微粒水平差異性分析結(jié)果（±s）

表3 兩組維吾爾族和漢族外周血紅細胞源微粒水平差異性分析結(jié)果（±s）

注：*計量資料不滿足參數(shù)條件時以中位數(shù)（四分位數(shù)間距）來表示

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表4 外周血紅細胞源微粒與低密度脂蛋白膽固醇多重線性回歸分析

3 討論

冠狀動脈疾病是涉及到動脈的病理過程，以往大量研究證實，血液中的很多成份，如抗凝物質(zhì)、纖維因素、炎癥細胞都在冠心病的發(fā)生發(fā)展中有著很重要的意義[6，7]，近年來，不同細胞來源的微粒作為一種評估心血管疾病的生物標志物得到很多的關(guān)注。

微粒是磷脂酰絲氨酸由細胞外層到內(nèi)層的過程，磷脂的丟失導致原來的中性細胞膜變成負性，其釋放取決細胞的凋亡及激活，微粒內(nèi)包含來源細胞的物質(zhì)，包括蛋白質(zhì)、微小RNA和脂蛋白。目前有醫(yī)學研究證明微粒與多種生物活動有關(guān)，比如血栓和止血、炎癥反應、血管功能和免疫功能，凋亡，甚至是通過微粒表面蛋白的傳遞來完成細胞之間的交流，微粒具有促進炎癥反應和激活凝血系統(tǒng)的作用，是導致動脈粥樣硬化基礎(chǔ)上缺血的重要原因[8]?，F(xiàn)在越來越多的證據(jù)證明微?？勺鳛槎鄠€系統(tǒng)疾病診斷及治療的生物標志物，包括心血管系統(tǒng)疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病和腫瘤疾病[9-12]。

紅細胞在經(jīng)歷有害刺激比如細胞膜氧化、損傷以胞吐的形式形成微粒。研究發(fā)現(xiàn)，在心血管疾病的進程中紅細胞源微粒的水平顯著提高，它可以間接反映細胞凋亡或激活的狀態(tài)，從而反映血管損傷，從病理生理的角度解釋微粒在急性心血管事件中所起作用[13，14]。Giannopoulos等[13]比較 51 例接受經(jīng)皮冠狀動脈介入治療術(shù)后急性STEMI患者和50名健康者體內(nèi)紅細胞源微粒、血小板微粒的數(shù)量，結(jié)果提示急性STEMI患者紅細胞源微粒數(shù)量較健康人群顯著增加，并且與心肌梗死后的臨床事件息息相關(guān)，與之相反，血小板微粒在兩組受試者中并無明顯差異，且與臨床終點事件并無相關(guān)性。

新疆維吾爾自治區(qū)是以維吾爾族為主的多民族居住區(qū)，肉類為主的高脂、高蛋白、高鹽飲食使該地區(qū)人們高血脂、高血壓患病率明顯升高，ACS發(fā)生率遠遠超過其他地域。對新疆地區(qū)ACS患者外周血中紅細胞源微粒的致血栓活性測定具有理論依據(jù)和重要意義。本研究通過對新疆維吾爾自治區(qū)ACS患者外周血紅細胞源微粒水平的檢測，了解ACS組外周血紅細胞源微粒水平是否高于Non-CAD組，揭示外周血紅細胞源微粒的水平與冠心病急性心血管事件的相關(guān)性。

新疆維吾爾自治區(qū)是多民族居住地區(qū)，其中維吾爾族人口為1 127.19萬，占新疆總?cè)丝?8.53%，該項研究同時分析漢族與維吾爾族ACS患者外周血紅細胞源微粒的差異性，結(jié)果提示兩民族之間并無明顯差異，可能與同一地區(qū)不同民族之間生活習慣之間的同化、也可能與民族之間的分析樣本量小有關(guān)，尚需大規(guī)模多民族的臨床研究進一步揭示差異性。

本研究以有關(guān)生化指標對外周血紅細胞源微粒水平進行多重線性回歸分析，提示血清LDL-C與紅細胞源微粒水平之間呈負相關(guān)。TG和膽固醇水平受研究對象近期飲食水平影響較大，LDL-C受藥物影響較大，疾病的急性期對其水平的影響較小。本研究中臨床病例資料收集過程無法明確其口服降脂藥物時間及種類，無法判斷降脂藥物對血脂水平的影響。我們納入的研究對象本次入院前可能長期口服降脂藥物，因而造成LDL-C水平偏低。外周血紅細胞源微粒水平在ACS患者發(fā)病時開始升高，達峰時間需后續(xù)不同階段抽血進一步做相關(guān)研究。本次研究樣本量相對較少，藥物影響目前無法判斷，其相關(guān)性需后續(xù)進一步完善樣本資料和擴大樣本量分析。

因研究對象臨床基本資料來源于醫(yī)院病歷書寫系統(tǒng)，而病歷中大多數(shù)患者的住院前用藥種類和用藥時間未仔細記錄，所以無法獲取抗血小板聚集藥、降脂藥、β受體阻滯劑和血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑/血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑等冠心病二級預防藥物的具體服藥情況，因而無法判斷藥物對ACS患者外周血紅細胞源微粒水平的影響。

本研究結(jié)果提示，紅細胞源微粒水平的表達在Non-CAD組和ACS組患者外周血中存在差異性，ACS組高于Non-CAD組；ACS組的三類患者之間差異性結(jié)果分析無統(tǒng)計學意義，分析其原因：（1）三類患者發(fā)病機制不同;（2）三類患者樣本量少，需要進一步的擴大樣本量的研究進一步證明ACS亞型之間的差異性。

在健康人群中也能檢測到微粒，其普遍存在于人群的外周血中，說明微粒是由于細胞的凋亡或激活后產(chǎn)生，疾病狀態(tài)下微粒水平會急劇增加。本研究結(jié)果提示，微粒的數(shù)量在ACS 患者體內(nèi)高于正常人群，這與我們以往的研究結(jié)果一致[15-18]。我們的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ACS組患者外周血紅細胞源微粒水平高于Non-CAD組，提示紅細胞源微?？赡軈⑴cACS的發(fā)病過程，本研究未納入穩(wěn)定性冠心病患者，無法明確ACS和穩(wěn)定性冠心病患者外周血紅細胞源微粒水平的差異，后期擴大樣本量，同時加入穩(wěn)定性冠心病患者可進一步明確紅細胞源微粒與急性冠狀動脈血栓形成的相關(guān)性。紅細胞源微粒參與ACS患者急性血栓事件的具體機制目前尚不清楚，我們的研究結(jié)果初步提示，ACS發(fā)病過程與紅細胞源微粒相關(guān)，尚需更多的隨機對照試驗、分子生物學研究和動物模型證明紅細胞源微粒在ACS發(fā)生急性血栓事件的具體作用機制和作用途徑。

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