彭映赫，唐 煒，袁 毅，藍(lán)芳榮，王繼智，陳永忠，陳隆升，楊繼敏，王 瑞

無(wú)性繁殖是林木繁殖的主要方式，有許多研究表明，林木穗條中由于存在生根抑制物質(zhì)，影響了林木生根效率，從而限制了部分難生根樹種的無(wú)性繁殖的進(jìn)程［1-12］。

油茶（Camellia oleifera）屬于山茶科（Theacae）山茶屬（Camellia）植物，與油棕（Elaeis guineensis Jacq.）、油橄欖（Olea europaea L.）和椰子（Cocos nucifera）并稱為世界四大木本食用油料植物［13-16］。目前，油茶主要采用無(wú)性繁殖方式，組織培養(yǎng)和扦插具有保持木本優(yōu)良性狀、成本低、繁殖速度快、簡(jiǎn)單易行等特點(diǎn)，備受推崇，但是由于油茶組培苗、扦插苗穗條中存在生根抑制物，導(dǎo)致其存在生根慢、生根率低等問(wèn)題，限制了無(wú)性繁殖的發(fā)展。本文以 4 個(gè)油茶新品種為材料，對(duì)不同類型穗條在不同季節(jié)穗條中生根抑制物進(jìn)行了研究，以期為油茶無(wú)性繁殖采樣季節(jié)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用的油茶優(yōu)良無(wú)性系穗條采自湖南省林業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)林場(chǎng)油茶采穗圃，所采用的優(yōu)良無(wú)性系為油茶新品種“朝霞”、“赤霞”、“秋霞”、“晚霞”，為 1997 年通過(guò)高接換冠技術(shù)造林。于 2014 年 4 月 15 日、5 月 12 日、6 月 12 日分三次采集當(dāng)年生春梢，樣品采集后帶回實(shí)驗(yàn)室處理。

表1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)Tab.1 Experimental design

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 提取液制備 穗條帶回實(shí)驗(yàn)室后先用洗潔劑洗凈，再用自來(lái)水沖凈，最后用去離子水沖洗，吸水紙吸干水分。用不銹鋼刀片切去穗條基部變色部分，然后將整個(gè)穗條切成碎片。稱取 10 g左右碎片，剪碎，研磨成漿，按每 1 克鮮材料加入 1 mL 甲醇溶液進(jìn)行提取。最后用蒸餾水稀釋，過(guò)濾，定容，待用。

1.2.2 提取液酸度測(cè)定 采用滴定法對(duì)提取液進(jìn)行總酸度滴定。以酚酞作指示劑，用 0.1 mol/L 氫氧化鈉滴定，然后根據(jù)消耗的堿液體積計(jì)算樣品總酸的含量。

1.2.3 酚類物質(zhì)含量測(cè)定 取 10 μL 待測(cè)液置于10 mL 刻度試管中，以蒸餾水為對(duì)照，加入 6 mL蒸餾水及 2.5 mL Folin-Denis 試劑，用力搖勻，3 min 后加入 1 mL 飽和碳酸鈉溶液，再加蒸餾水使終體積為 10 mL；搖勻后室溫下保持 1 h，于分光光度計(jì)中測(cè)定吸光度，測(cè)定波長(zhǎng) 725 nm。配制濃度為 0、1.1、2.2、3.3、4.4、5.5、6.6、7.7 μg/mL 的沒食子酸溶液，按上述測(cè)定方法測(cè)定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并擬合直線回歸方程，根據(jù)直線方程計(jì)算各樣品的總酚含量。

1.2.4 生物效應(yīng)鑒定 以白菜種子為試驗(yàn)材料，將白菜種子用紗布包好，分別放入不同濃度的提取液（原液、稀釋 5 倍）中浸泡 12 h，將浸泡后的種子置于培養(yǎng)皿中的濕濾紙上，放在光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行種子發(fā)芽試驗(yàn)，濾紙每天加 2 次提取液，保持濾紙濕潤(rùn)。其中，每個(gè)濃度設(shè) 3 個(gè)重復(fù)，每重復(fù) 50 粒種子。發(fā)芽試驗(yàn)結(jié)束后，通過(guò)統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率來(lái)進(jìn)行受試材料生物效應(yīng)的鑒定，以去離子水為對(duì)照。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用 Excel 2007 及 SPSS19.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 品種對(duì)穗條提取液中生根抑制物的影響

2.1.1 酸度 從圖 1 可以看出，4 個(gè)油茶新品種在 4-6 月份穗條提取液的酸度基本呈現(xiàn)“先上升后下降”的趨勢(shì)，只有“晚霞”呈直線上升趨勢(shì)。月平均酸度比較為：5 月份（9.78%）＞6 月份（7.42%）＞4 月份（4.42%），除“晚霞”外，其余 3 個(gè)新品種的酸度最高值均出現(xiàn)在 5 月份，其中以“秋霞”最高，達(dá)到 10.83%；最低值均出現(xiàn)在 4 月份，“赤霞”最低，為 3.00%。

圖1 不同品種、不同季節(jié)穗條提取液的酸度變化曲線Fig.1Acidity changes in scions extracts of different varieties in different season

2.1.2 酚類物質(zhì)含量 由圖 2 可知，4 個(gè)油茶新品種在 4-6 月份穗條提取液中酚類物質(zhì)含量變化趨勢(shì)一致，均呈現(xiàn)“先上升后下降”的趨勢(shì)。月平均酚類物質(zhì)含量比較為：5 月份（179 μg/g）＞4 月份（123 μg/g）＞6 月份（122 μg/g），5 月份月平均酚類物質(zhì)含量最高。除“赤霞”外，其余 3 個(gè)新品種的最高值均出現(xiàn)在 5 月份，最低值均出現(xiàn)在 6 月份，而“赤霞”的酚類物質(zhì)含量也在 5 月份達(dá)到最高值，且在 4 個(gè)品種中達(dá)到最高值，為 195.67 μg/g，最低值出現(xiàn)在 4 月份，為 65.02 μg/g。

圖2 不同品種、不同季節(jié)穗條提取液中酚類物質(zhì)含量變化曲線Fig.2Phenols content changes in scions extracts of different varieties in different season

2.1.3 種子發(fā)芽率 圖 3 結(jié)果表明，4 個(gè)油茶新品種在 4-6 月份穗條提取液原液中種子發(fā)芽率變化趨勢(shì)基本一致，呈“V”型變化，即先降低后上升，“晚霞”呈直線下降的趨勢(shì)。月平均發(fā)芽率比較為：4 月份（36.7%）＞6 月份（27.3%）＞5月份（14.5%），5 月份，月平均發(fā)芽率達(dá)到最低值。在 4 月份、6 月份，“赤霞”的發(fā)芽率均達(dá)到最大值，分別為 69.0%、38.0%，而 5 月份“晚霞”的發(fā)芽率達(dá)到最大值，為 31.0%。

圖3 不同品種、不同季節(jié)的穗條提取液原液中種子發(fā)芽率變化曲線Fig.3Seed germination rate changes in scions extracts of different varieties in different season

圖 4 數(shù)據(jù)顯示，4 個(gè)油茶新品種在 4-6 月份穗條提取液 5 倍稀釋液中種子發(fā)芽率變化趨勢(shì)基本一致，呈“V”型變化，即先降低后上升，“秋霞”呈直線上升的趨勢(shì)。月平均酸度比較為：6 月份（83.0%）＞4 月份（70.0%）＞5 月份（55.5%），5 月份，月平均發(fā)芽率達(dá)到最低值，除“秋霞”外，其余 3 個(gè)新品種的種子發(fā)芽率均在 5 月份達(dá)到最低值，其中以“朝霞”種子發(fā)芽率最低，為 31.0%。

圖4 不同品種、不同季節(jié)穗條提取液的5倍稀釋液中種子發(fā)芽率變化曲線Fig.4Seed germination rate changes in 5 times dilution of different varieties in different season

2.2 穗條類型對(duì)其提取液中生根抑制物的影響

2.2.1 酸度 由圖 5 可知，不同類型穗條提取液中不同月份間酸度變化趨勢(shì)一致，均呈上升趨勢(shì)，即 6 月份酸度均大于 4 月份。在 4 月份，3 種類型穗條提取液中酸度相差不大，以嫁接大樹最高，為 4.67%，家系苗最低，為 3.87%；6 月份，家系苗穗條提取液中酸度急劇上升，達(dá)到 9.20%，遠(yuǎn)高于組培苗（5.00%）和嫁接大樹（5.00%）。

圖5 不同類型、不同季節(jié)穗條提取液的酸度變化曲Fig.5 Acidity changes in scions extracts of different types in different season

2.2.2 酚類物質(zhì)含量 從圖 6 可以看出，不同類型穗條提取液中不同月份間酚類物質(zhì)含量變化趨勢(shì)一致，均呈下降趨勢(shì)，即 4 月份酚類物質(zhì)含量均大于 4 月份。在 3 中不同類型穗條間，以嫁接大樹穗條提取液中酚類物質(zhì)含量最高，在 4 月份和 6 月份均高于其他 2 種穗條，酚類物質(zhì)含量分別為 150.80 μg/g和 97.98 μg/g。

圖6 不同類型、不同季節(jié)穗條提取液中酚類物質(zhì)含量變化曲線Fig.6Phenols content changes in scions extracts of different types in different season

2.2.3 種子發(fā)芽率 圖 7 數(shù)據(jù)顯示，不同類型穗條提取液原液中不同月份間種子發(fā)芽率變化規(guī)律不一致，其中嫁接大樹與組培苗穗條提取液原液中種子發(fā)芽率呈上升趨勢(shì)，即 6 月份種子發(fā)芽率高于 4 月份，而家系苗變化趨勢(shì)相反，呈下降趨勢(shì)，即 4 月份種子發(fā)芽率高于 6 月份。4 月份，家系苗提取液原液中種子發(fā)芽率最高，為 28%，6 月份，組培苗提取液原液中種子發(fā)芽率最高，為47%。

圖7 不同類型、不同季節(jié)穗條提取液原液中種子發(fā)芽率變化曲線Fig.7Seed germination rate changes in scions extracts of different types in different season

圖 8 數(shù)據(jù)顯示，不同類型穗條提取液 5 倍稀釋液中不同月份間種子發(fā)芽率變化規(guī)律一致，均呈上升趨勢(shì)，即 6 月份種子發(fā)芽率均高于 4 月份。家系苗提取液原液中種子發(fā)芽率在 4 月份及 6月份均為最高值，分別為 73% 和 90%。

圖8 不同類型、不同季節(jié)穗條提取液的5倍稀釋液中種子發(fā)芽率變化曲線Fig.8Seed germination rate changes in 5 times dilution of different types in different season

3 結(jié)論與討論

（1）不同品種穗條提取液中不同季節(jié)生根抑制物質(zhì)的酸度和酚類物質(zhì)含量的變化趨勢(shì)一致，均為“先上升后下降”，而種子發(fā)芽率的變化趨勢(shì)與酸度和酚類物質(zhì)含量的變化趨勢(shì)相反，即“先下降后上升”。在 5 月份，酸度和酚類物質(zhì)含量達(dá)到最高值，而種子發(fā)芽率在 5 月份最低，說(shuō)明酸度和酚類物質(zhì)含量對(duì)種子發(fā)芽率影響較大，屬于生根抑制物質(zhì)。這與穗條生長(zhǎng)的物候期是相吻合的，說(shuō)明在穗條成熟過(guò)程中，穗條提取液的生根抑制物隨著穗條的成熟逐漸升高，待穗條成熟后（6 月份），生根抑制物逐漸轉(zhuǎn)移或轉(zhuǎn)化，生根抑制物含量減少并趨于穩(wěn)定。

（2）不同品種穗條提取液中不同季節(jié)生根抑制物質(zhì)的酸度呈“上升”趨勢(shì)，酚類物質(zhì)含量呈“下降”趨勢(shì)，發(fā)芽率呈“上升”趨勢(shì)，即 6 月份種子發(fā)芽率高于 4 月份，也說(shuō)明在不同類型的穗條中，6 月份穗條中酚類物質(zhì)含量較低，適合扦插等無(wú)性繁殖。

（3）“晚霞”酸度變化及在提取液原液中種子發(fā)芽率的變化與其他品種不一致，呈“直線”上升趨勢(shì)。在 6 月份達(dá)到最高值，而其余 3 個(gè)新品種均在 5 月份達(dá)到最高值，這可能與“晚霞”物候期比其它 3 個(gè)品種晚有關(guān)。

（4）嫁接大樹的酸度及酚類物質(zhì)含量高于組培苗和家系苗，而種子發(fā)芽率最低，說(shuō)明在不同類型穗條中，8 年生嫁接大樹穗條的生根抑制物質(zhì)含量最高，高于 3 年生的組培苗和家系苗穗條，這與 Paton D M 等關(guān)于“莖和葉子越成熟，抑制物的含量越高”的結(jié)論是一致的［17］。

［1］吳嘯峰．紅豆杉種子抑制物質(zhì)的初步研究［J］．植物生理學(xué)通訊，1985（4）：23-26.

［2］劉衛(wèi)東，周 瑩，孫漢洲．桉樹扦插生根過(guò)程中抑制物的研究［J］．經(jīng)濟(jì)林研究，1998，16（4）：16-19.

［3］黃卓烈，林韶湘，譚紹滿．桉樹體內(nèi)的生根抑制物質(zhì)研究綜述［J］．林業(yè)科學(xué)研究，1994，7（3）：319-324.

［4］詹福建，巫光宏，黃卓烈，等．桉樹 LH22、U6 無(wú)性系莖提取液對(duì)綠豆插條發(fā)根和種子萌發(fā)的影響［J］．植物研究，2003，23（2）：172-177.

［5］朱 鵬，徐建民．鄧恩桉組織材料生根抑制物研究［J］．安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，35（32）：10236-10238，10560.

［6］季孔庶，王章榮，陳天華，等．馬尾松插穗內(nèi)源抑制物質(zhì)的研究［J］．林業(yè)科學(xué)，1997，33（2）：142-151.

［7］季孔庶，王章榮，陳天華，等．馬尾松種源與內(nèi)源生根抑制物的相關(guān)性［J］．南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2002，26（2）：24-28.

［8］梁小春，項(xiàng)東云，姚瑞玲，等．鄧恩桉插穗生根抑制物初步研究［J］．廣西林業(yè)科學(xué)，2010，39（1）：14-16.

［9］徐程揚(yáng)，張忠輝，李紹臣．核桃楸枝條、插穗中生根抑制物質(zhì)的含量［J］．吉林林學(xué)院學(xué)報(bào)，1998，14（4）：212-215.

［10］程廣有．紫杉插穗中生根抑制物的鑒定［J］．北華大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2000，1（2）：163-166.

［11］黃卓烈，林韶湘，譚紹滿，等．尾葉桉等植物葉提取液對(duì)幾種植物插條生根和種子萌發(fā)的影響［J］．林業(yè)科學(xué)研究，1997，10（5）：546-550.

［12］巫光宏，詹福建，黃卓烈，等．桉樹無(wú)性系生根抑制物初步研究［J］．亞熱帶植物科學(xué)，2002，31（3）：1-5.

［13］莊瑞林．中國(guó)油茶［M］．北京：中國(guó)林業(yè)出版社，1988.

［14］陳永忠．天賜之華［M］．廣州：世界圖書出版公司，2014.

［15］王 瑞，陳永忠．湖南省油茶產(chǎn)業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化建設(shè)展望［J］．湖南林業(yè)科技，2011，38（2）：59-61.

［16］王 瑞，陳永忠，陳隆升．油茶產(chǎn)業(yè)發(fā)展中科技支撐的形式與對(duì)策［J］．湖南林業(yè)科技，2012，39（5）：139-141.

［17］Paton D M，Willing R R．Inhibitor transport and ontogenetic age in Eucalyptus grandis［M］//.Plant Growth Substance.Tokyo：Hirokawa Publishing Company，1973，126-132.