鄭佳琳，黃小紅，饒子亮，梁艷齡，黃小瓊，劉盛來，曾素丹，鐘志勇，鄺少松

（廣東省醫(yī)學實驗動物中心比較醫(yī)學實驗室，廣東 佛山 528248）

放化療是各種腫瘤治療的主要手段，其臨床應用十分廣泛。骨髓抑制是腫瘤放、化療的主要毒副作用，表現(xiàn)為外周血單系或全系血細胞的減少，不僅限制化療用的藥劑量還延誤治療節(jié)奏，影響治療效果。臨床常出現(xiàn)嚴重的感染和出血，嚴重影響生命并威脅患者的生命。目前在西醫(yī)用來起預防骨髓抑制作用的藥物很少，且很難得到推廣應用，西醫(yī)藥副作用大。中醫(yī)學多將化療后骨髓抑制歸于脾腎兩虛、氣血不足[1,2]，但療效仍然還不盡理想，臨床多以補血為主。參芪顆粒主要作用以及適應癥為補益中氣，用于氣虛所致體弱，四肢無力，與骨髓抑制的病征相對應。本研究利用環(huán)磷酰胺藥物作用使小鼠骨髓造血功能受到抑制，觀察參芪顆粒對小鼠造血功能的影響，探究參芪顆粒對放、化療引起的骨髓造血抑制的預防、治療作用，并對其作用作初步探討。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及實驗環(huán)境

SPF級BALB/c小鼠，雄性，體重18～22g，購于廣東省醫(yī)學實驗動物中心〔SCXK（粵）

2013-0002 〕。動物飼養(yǎng)在廣東省醫(yī)學實驗動物中心SPF級動物房〔SYXK（粵）2013-0002〕。動物飼養(yǎng)條件：5只/箱，群養(yǎng)，飼養(yǎng)溫度與濕度：20～26℃，40～70%，采用10h：14h晝夜間斷照明；飼養(yǎng)室條件始終保持穩(wěn)定，以保證試驗結(jié)果的可靠性。自由進食飲水，飼料和飲用水均由廣東省醫(yī)學實驗動物中心提供。

1.2 主要試劑

參芪顆粒（批號：140801），江西保利制藥有限公司；環(huán)磷酰胺（CTX，批號：04131202），山西普德藥業(yè)股份有限公司；重組人粒細胞集落刺激因子注射液（rhG–CSF，批號：20140101），北京四環(huán)生物制藥有限公司；細胞周期試劑盒（批號：No.20131050）上海七海復泰生物科技有限公司。

1.3 主要儀器

JEA3001系列電子天平，精度0.1g，中山市衡新電子有限公司；Mek-7222k型全自動血球計數(shù)儀，日本光電。BD AccuriC6流式細胞儀，美國BD公司。

1.4 動物造模

將檢疫合格的40只BALB/c小鼠按照體重隨機分為空白對照組、模型組、陽性組、參芪顆粒組，每組10只。除空白對照組外，其余各組小鼠腹腔注射80mg·kg-1·d-1環(huán)磷酰胺溶液，正常對照組小鼠腹腔注射0.9%氯化鈉注射液，每天1次，連續(xù)3d；本實驗所有動物實驗操作均經(jīng)過廣東省醫(yī)學實驗動物中心實驗動物倫理委員會批準。

1.5 動物給藥

造模結(jié)束后，參芪顆粒組小鼠每日灌胃給予18.2g·kg-1·d-1參芪顆粒溶液，陽性組小鼠每日腹腔注射125μg·kg-1·d-1 rhG–CSF，每天1次，連續(xù)給藥7d?？瞻讓φ战M和模型組均灌胃給予0.9%氯化鈉注射液。

1.6 外周血細胞計數(shù)

末次給藥24h后，經(jīng)小鼠眼球后靜脈叢采血，用裝有EDTANa抗凝劑的采血管收集，使用Mek-7222k型全自動生化分析儀進行白細胞總數(shù) (WBC) ，紅細胞 (RBC) ，血小板(PLT) 計數(shù)。

1.7 骨髓有核細胞懸液的制備及有核細胞計數(shù)

末次給藥后24h，脫臼頸椎處死小鼠，取小鼠股骨，除凈軟組織，用6號針頭以1mL PBS沖出骨髓細胞，200目篩網(wǎng)過濾制成單個骨髓細胞懸液。將單個骨髓細胞懸液1000 rmp離心5min，去上清，用預冷PBS洗滌2 次，棄上清，用 PBS定容至5mL。按白細胞計數(shù)法進行骨髓有核細胞計數(shù)。并計算絕對數(shù)量。

1.8 骨髓有核細胞細胞周期的分析測定

取上述制備好的骨髓單核細胞懸液離心(1000rmp，5min)，棄上清，加入70%預冷乙醇固定打散細胞，4℃固定2h，1000rmp離心5min收集細胞，棄上清，用預冷PBS洗細胞兩次。1000rmp離心收集已固定的細胞，棄上清，加入1mL PBS室溫水合15min。離心收集細胞，棄上清，每管加入500μL碘化丙啶染色液，室溫避光孵育30min。以標準程序用流式細胞儀檢測，一般計數(shù)1～2萬個細胞，結(jié)果用軟件FlowJo7.6分析細胞周期。結(jié)果以細胞周期各時相細胞百分率表示，并按以下公式計算細胞增殖指數(shù)(proliferation index, PI)：PI=(S+G2/M) /(G0/G1+S+G2/M)×100%。

1.9 細胞凋亡率的測定

取上述制備好的骨髓單核細胞懸液離心(1000rmp，5min)，棄上清液，PBS洗滌后，PI染色上流式細胞儀進行分析，計算凋亡細胞百分率。

1.10 統(tǒng)計方法

實驗所得數(shù)據(jù)用 SPSS 21.0 軟件統(tǒng)計，結(jié)果用表示，各組數(shù)據(jù)進行方差齊性檢驗，同時進行單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 參芪顆粒對骨髓抑制小鼠外周血的影響

與空白對照組比較，模型組小鼠外周血中白細胞（WBC）、紅細胞（RBC）、血小板計數(shù)（PLT）的數(shù)量顯著減少(P＜0.01)，證明造模成功。參芪顆粒組、陽性組均能明顯改善骨髓抑制小鼠外周血中 WBC、PLT的數(shù)量，與模型組比較有顯著性差異（P＜0.05或P＜0.01）。結(jié)果見表1。

2.2 參芪顆粒對骨髓抑制小鼠骨髓有核細胞的影響

與空白對照組比較，模型組小鼠骨髓有核細胞（BMC）數(shù)量顯著低于空白對照組(P＜0.01) 。參芪顆粒組、陽性組均可以顯增加骨髓抑制小鼠的骨髓有核細胞數(shù)量，與模型組比較有顯著性差異(P＜0.05或P＜0.01)。結(jié)果見表1。

2.3 參芪顆粒對骨髓抑制小鼠骨髓細胞周期變化和細胞凋亡率的影響

與空白對照組比較，造模后骨髓細胞細胞周期出現(xiàn)了停滯的狀態(tài)，模型組小鼠G0/G1期細胞顯著增加，G2/M 期和 S 期細胞顯著減少(P＜0.05或P＜0.01)。參芪顆粒組和陽性組均能解除 G0/G1期細胞阻滯，促進 G0/G1期細胞進入增殖周期，使G2/M期和S期細胞增加，且兩組之間無顯著差異（P＞0.05）。結(jié)果見表2。

表1 參芪顆粒對骨髓抑制小鼠外周血象及骨髓有核細胞的影響（ ，n=10，♂）

表1 參芪顆粒對骨髓抑制小鼠外周血象及骨髓有核細胞的影響（ ，n=10，♂）

注：與空白對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

組別Group空白對照組Blank模型組Model陽性組Positive參芪顆粒組Shenqi Granule劑量Dosage WBC（×109/L）RBC（×1012/L）PLT（×109/L）BMC（×109/L）— —7.64±0.45 2.03±0.28**10.39±1.19 3.71±0.46**287.63±20.96 153.12±18.20**8.96±0.96 2.46±0.47**125μg·kg-1·d-15.63±0.49△△4.03±0.97242.14±26.71△△6.14±0.89△△18.2g·kg-1·d-14.58±0.72△△3.97±0.56211.86±23.17△△3.23±0.92△

表2 參芪顆粒對骨髓抑制小鼠骨髓細胞周期和細胞凋亡率的影響（ ，n=10，♂）

表2 參芪顆粒對骨髓抑制小鼠骨髓細胞周期和細胞凋亡率的影響（ ，n=10，♂）

注：與空白對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

組別Group空白對照組Blank模型組Model陽性組Positive參芪顆粒組Shenqi Granule劑量Dosage G0/G1（%）S（%）G2/M（%）PI（%）— —72.06±1.38 85.48±1.70**15.12±1.66 5.45±1.67**8.12±2.11 6.95±2.05*24.55±2.06 12.10±1.73**125μg·kg-1·d-177.36±3.99△△12.02±4.80△△9.54±1.06△△20.35±4.97△△凋亡率（%）Apoptosis rate 2.650.45 27.330.28**20.650.49△18.2g·kg-1·d-180.83±1.78△△7.38±1.36△△7.82±1.6017.98±1.35△22.340.72△

與空白對照組比較，模型組小鼠骨髓細胞的凋亡率極顯著上升（P＜0.01）；與模型組比較，陽性組和參芪顆粒組的骨髓細胞的凋亡率顯著下降（P＜0.05）。提示∶參芪顆粒具有抑制骨髓細胞凋亡的作用。結(jié)果見表2。

3 討論

參芪顆粒具有補中益氣，健脾益肺的功效，藥效與骨髓抑制的病癥相類似。中藥配方顆?？蓾M足臨床辨證論治，隨癥加減的需要，同時服用方便，保持和發(fā)揚了傳統(tǒng)中醫(yī)藥的特點和優(yōu)勢，既有利于中藥質(zhì)量的規(guī)范化，亦有利于中藥的標準化和國際化。

化學治療、放射治療以及許多其它抗腫瘤治療方法，都是針對快速分裂的細胞來抑制癌細胞，因而常常導致正常骨髓細胞受抑。小鼠骨髓抑制模型的造模方法中輻照方法和環(huán)磷酰胺法比較簡便。輻照方法和環(huán)磷酰胺注射法對比，射線輻射復制的骨髓抑制模型較接近臨床上的再生障礙性貧血，但特殊設備，輻射劑量、時間難以控制，造模條件、成本高[3]。環(huán)磷酰胺是一種臨床常見的抗腫瘤藥物，廣泛應用于各種血液系統(tǒng)和實體腫瘤的治療，具有誘導腫瘤細胞凋亡和抑制細胞增殖的作用[4]。注射用環(huán)磷酰胺在體外無活性，與DNA發(fā)生交叉聯(lián)結(jié)，抑制DNA的合成，也可干擾RNA的功能。抑制骨髓細胞的生成，干擾細胞的造血活動，劑量容易控制，故選用環(huán)磷酰胺法制備小鼠骨髓抑制模型。本研究采用80mg·kg-1·d-1環(huán)磷酰胺連續(xù)腹腔注射三d，其外周血中白細胞（WBC）、紅細胞（RBC）、血小板計數(shù)（PLT）、BMC的數(shù)量顯著減少(P＜0.05或P＜0.01)，并且重復性高。

骨髓細胞周期是評判其造血系統(tǒng)造血功能好壞的重要指標之一，細胞周期各個時相的分布情況可以反映骨髓細胞受損和恢復的程度[5]。在細胞周期調(diào)控機制中有兩個重要的檢查點，分別位于G1期與S期、G2期與M期之間[6]。目前研究認為，機體受到輻射等外界刺激后，會發(fā)生保護性反應，出現(xiàn)G1期阻滯、G2期阻滯或S期的延遲，使受損DNA有充足時間來進行修復，損傷嚴重者通過G1期的永久性阻滯或發(fā)生凋亡而清除有損傷DNA的細胞，從而降低基因組的不穩(wěn)定性[7]。解除骨髓細胞G1期阻滯，使G1期細胞進入S期，S期細胞向G2/M期細胞轉(zhuǎn)化是拮抗放、化療藥物造成的骨髓抑制的一個重要機制[8,9]。

本研究顯示模型組和空白對照組比較，其骨髓有核細胞G0/G1期，S期細胞比例明顯升高，G2/M期細胞下降，細胞凋亡率也有顯著升高。數(shù)據(jù)提示，放化療不僅引起G1期阻滯，還會造成S期阻滯，即細胞的蛋白質(zhì)和RNA、DNA不能很好地合成，受到抑制，并且會通過促進細胞凋亡，抑制新細胞的增殖，而導致骨髓抑制。陽性組和參芪顆粒和模型組對比，G0/G1比例降低，S期、G2/M期細胞比例升高，細胞增殖指數(shù)升高，凋亡率也有下降。以上實驗結(jié)果提示，參芪顆粒以通過促進G0/G1期的造血細胞修復受損的DNA，加速通過G1/S和S期監(jiān)測點；抑制造血細胞的凋亡；調(diào)節(jié)造血細胞增殖與凋亡之間的平衡等機制來促進放、化療骨髓抑制的小鼠造血功能恢復，提高外周血象，有利于緩解骨髓抑制病征。

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[3]嚴蘇純,祝彼得,韓英光,郭巍.當歸補血湯不同劑型及配伍對骨髓抑制小鼠造血調(diào)控的實驗研究[J].中國藥學雜志,2008,9(43):18.

[4]鄧震亭.環(huán)磷酰胺藥理與毒理研究現(xiàn)狀[J].天津藥學,2009,21(4):42.

[5]趙菊花,祝彼得.圣愈湯不同劑型對骨髓抑制小鼠骨髓細胞周期和凋亡影響的研究[J].中藥藥理與臨床,2011,27(2).

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