鄭樂迎，黃東波，陳生明，劉北華

（深圳市寶安區(qū)動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，廣東 深圳 518101）

養(yǎng)豬行業(yè)目前飽受多種傳染病困擾，且許多疾病都有免疫抑制作用，如豬瘟、藍(lán)耳病、圓環(huán)病、支原體等。這類傳染病一旦在豬群中定植并流傳開來，危害巨大。倪嬌等[1]2010～2011年調(diào)查了幾種病毒性傳染病的流行情況，研究顯示：國內(nèi)圓環(huán)病毒的豬場陽性率已達(dá)89.69%(87/97)，豬瘟、藍(lán)耳等病的檢出率也居高不下。對于這些疾病的監(jiān)控刻不容緩。另一方面，我們的養(yǎng)豬業(yè)中還存在部分藥物濫用問題，許多臨床獸醫(yī)根據(jù)經(jīng)驗(yàn)隨意用藥，隨意增減劑量，造成細(xì)菌耐藥性和藥物殘留問題日益嚴(yán)重。不過，目前已有越來越多的規(guī)模化養(yǎng)殖場建立了自己的實(shí)驗(yàn)室檢測系統(tǒng)，檢測豬群抗體水平，監(jiān)控豬群中疾病的流行情況，以彌補(bǔ)臨床診斷的不足。

1 抗體檢測

抗體檢測對疫苗免疫效果評(píng)價(jià)、免疫程序制定、流行狀態(tài)監(jiān)測均具有重要意義。目前比較成熟的抗體檢測技術(shù)包括：血凝試驗(yàn)、中和試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）、膠體金技術(shù)等?？贵w檢測能夠幫助我們準(zhǔn)確掌握仔豬的母源抗體水平和疫苗免疫后的抗體水平，以選擇合適的首免日齡，及時(shí)發(fā)現(xiàn)免疫失敗現(xiàn)象，評(píng)價(jià)抗體均一度。對豬群進(jìn)行定期的抗體監(jiān)測可以做到防患于未然，及早發(fā)現(xiàn)問題，及早采取措施。

1.1 血凝試驗(yàn)

某些病毒具有凝集紅細(xì)胞的特性，比如，豬細(xì)小病毒可以凝集豚鼠紅細(xì)胞[2]?，F(xiàn)在常用的是豬瘟病毒的正向間接血凝試驗(yàn)來監(jiān)測豬瘟病毒的抗體[3]，操作簡便，價(jià)格低廉，具有快速、敏感、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)。

1.2 中和試驗(yàn)

中和試驗(yàn)的原理就是病毒與樣本中的抗體結(jié)合以后失去感染細(xì)胞的能力，試驗(yàn)方法主要有簡單定性試驗(yàn)、固定血清稀釋病毒法、固定病毒稀釋血清法、空斑減少法等。中和試驗(yàn)檢測結(jié)果確實(shí)，但是中和試驗(yàn)需要涉及細(xì)胞培養(yǎng)等，操作成本和技術(shù)水平要求都比較高，檢測周期也較長，故用之較少[4]。

1.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）

ELISA的基本方法就是將已知的抗原吸附在反應(yīng)板上，加待測樣品、底物和酶標(biāo)抗體（或酶標(biāo)二抗），測定酶與底物反應(yīng)產(chǎn)物顯色的深淺，可以對待測樣品的抗體水平進(jìn)行定量[5]。ELISA方法除上述外還可用于豬抗體檢測的是斑點(diǎn)ELISA[6]。還可以用已知抗體包被反應(yīng)板，檢測樣本中的病毒含量。ELISA方法的優(yōu)點(diǎn)是操作簡單、時(shí)間短、可同時(shí)檢測大量樣本，敏感性和特異性都比較強(qiáng)，目前已開發(fā)有多種商品化ELISA試劑盒。雖然該方法成本相對較高，但在臨床檢測中是抗體監(jiān)測最為常用、準(zhǔn)確的方法。

1.4 膠體金技術(shù)

膠體金技術(shù)是在酶聯(lián)免疫吸附法的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種固相標(biāo)記免疫測定新技術(shù)。 其檢測原理是以硝酸纖維素膜為載體，標(biāo)記已知抗原，待檢樣本血清經(jīng)膜的毛細(xì)管作用， 樣本中的抗體與膠體金上的抗原相結(jié)合，膜上標(biāo)記物顯色而達(dá)到檢測目的[7]。此種技術(shù)快速，操作簡單，主要應(yīng)用于豬病現(xiàn)場檢測。現(xiàn)已有豬瘟、口蹄疫、藍(lán)耳等數(shù)種商品化膠體金試紙。

2 病原檢測

鑒于當(dāng)前疫病流行的復(fù)雜性，單純通過臨床癥狀或解剖眼觀病理變化是很難做出準(zhǔn)確的診斷的。可以采集部分病豬或死豬相關(guān)組織作為病料，送實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行病原檢測，只有查明病原才能更好地、有針對性地采取相應(yīng)的防治措施，減少臨床工作盲目性。

2.1 細(xì)菌性疾病

細(xì)菌性疾病在豬病臨床中占有重要地位，如，仔豬黃白痢、豬丹毒、支原體、副豬、胸膜肺炎、豬肺疫、梭菌性腸炎等，都在養(yǎng)豬生產(chǎn)中造成嚴(yán)重危害，帶來巨大經(jīng)濟(jì)損失。

2.1.1 分離細(xì)菌

無菌采集病死豬肝臟、肺臟或者其他病變嚴(yán)重的臟器（腹瀉性疾病可以采集腸道菌樣分離培養(yǎng)），以滅菌接種環(huán)接種到營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，35～37℃培養(yǎng)24～48h。懷疑某些特定細(xì)菌病時(shí)可以用特殊的培養(yǎng)基分離培養(yǎng)。如，麥康凱培養(yǎng)基可以鑒別大腸桿菌，副豬嗜血桿菌需要在培養(yǎng)基中添加輔酶等，產(chǎn)氣莢膜梭菌的分離培養(yǎng)最好使用厭氧肉肝湯進(jìn)行厭氧培養(yǎng)。取培養(yǎng)物染色鏡檢，根據(jù)細(xì)菌鏡下形態(tài)及染色特性，即可初步鑒別部分細(xì)菌。亦可直接由病料觸片染色鏡檢，但檢出率相對低一些。進(jìn)一步鑒定可以通過生化試驗(yàn)、血清學(xué)試驗(yàn)、PCR等方法途徑。

2.1.2 藥敏試驗(yàn)

分離細(xì)菌一個(gè)重要的目的就是進(jìn)行抗菌藥物的敏感性試驗(yàn)，在培養(yǎng)基上均勻涂布菌液，把帶有一定量藥物的藥敏紙片均勻貼附在平板上，恒溫培養(yǎng)?？梢酝ㄟ^測量紙片周圍抑菌圈的直徑來分析藥物對該細(xì)菌的敏感性（如圖1）。我們對一株分離自腹瀉哺乳仔豬的大腸桿菌做了藥敏試驗(yàn)，做了兩個(gè)平行樣，結(jié)果顯示：該菌對阿米卡星、恩諾沙星、大觀霉素高敏，對頭孢噻呋、鏈霉素中敏，對阿莫西林、林可霉素、氟苯尼考耐藥。

藥敏試驗(yàn)在于豬病治療臨床上具有重要意義，特別是如今細(xì)菌耐藥性日益嚴(yán)重，而新型抗菌藥物研發(fā)進(jìn)展緩慢的形勢之下，我們獸醫(yī)臨床更應(yīng)該拒絕盲目用藥和經(jīng)驗(yàn)用藥，在抗菌藥物的使用上必須慎重，要根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果來指導(dǎo)臨床用藥選擇。

2.1.3 水源及環(huán)境監(jiān)測

定期監(jiān)測豬場周圍水源和環(huán)境中細(xì)菌分布情況，對于把握細(xì)菌病的流行情況具有積極意義。從源頭上切斷傳染病的傳播途徑。

圖1 藥敏試驗(yàn)

2.2 病毒性疾病

2.2.1 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）

PCR技術(shù)是從基因水平上檢測病原，其原理就是大量擴(kuò)增目的條帶，擴(kuò)增到我們能夠看到它們。即，我們懷疑某種疾病，就可以根據(jù)該病原的DNA序列設(shè)計(jì)一條引物，假如我們的病料中含有該病原，那么就一定存在該病原的基因，也就可以與引物按照堿基互補(bǔ)的原則特異性結(jié)合，在經(jīng)過大量的擴(kuò)增之后就可以通過凝膠電泳觀察到目的條帶，證明樣品陽性[8]。如無，則可說明該病料呈陰性。圖二是運(yùn)用PCR技術(shù)檢測病料樣本中有無豬瘟病毒，經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳后成像，就可以直觀顯示結(jié)果。我們可以看到，這些樣本中豬瘟病毒的陽性率為6.7%（1/15），PCR技術(shù)應(yīng)用于豬病診斷，具有敏感性高、特異性強(qiáng)、快速簡單等優(yōu)點(diǎn)，缺點(diǎn)是儀器成本投入較大、不能準(zhǔn)確定量。

圖2

2.2.2 熒光定量PCR

實(shí)時(shí)熒光定量PCR即在PCR體系中加入熒光探針，通過熒光實(shí)時(shí)監(jiān)測PCR進(jìn)程，與常規(guī)PCR相比，熒光定量PCR具有特異性更強(qiáng)，能夠有效解決PCR產(chǎn)物污染、自動(dòng)化程度高，其最為突出的優(yōu)點(diǎn)是能夠?qū)颖具M(jìn)行快速、定量分析[9]。但該技術(shù)同樣也受設(shè)備成本限制，故不如PCR普遍。

2.2.3 動(dòng)物回歸實(shí)驗(yàn)

我們還可以將病料接種到易感實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，輔助診斷，衡量毒力。如果成功在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中復(fù)制出相應(yīng)病例，則可以確診。如偽狂犬病毒接種到實(shí)驗(yàn)兔可出現(xiàn)特異性奇癢、抓撓癥狀[10]。但該方法所需周期較長，臨床診療中可能缺乏時(shí)效性。

此外，我們還可以將病料接種到細(xì)胞上，觀察細(xì)胞病變。

3 豬病綜合防治

在目前的豬病臨床診療過程中，由于技術(shù)水平、成本限制等因素，不可避免地存在一些病原診斷困難或者不精確的情況。同時(shí)，在養(yǎng)豬生產(chǎn)實(shí)踐中，濫用藥物、消毒意識(shí)差、疫苗管理應(yīng)用不當(dāng)、飼養(yǎng)管理不科學(xué)、缺乏有效的疫情監(jiān)測手段等情況也是時(shí)有發(fā)生。筆者拙見，認(rèn)為豬病控制必須從養(yǎng)豬生產(chǎn)的各個(gè)環(huán)節(jié)出發(fā)，綜合控制，即提高飼養(yǎng)管理水平與實(shí)驗(yàn)室檢測相結(jié)合。

首先，豬場應(yīng)該堅(jiān)持自繁自養(yǎng)，全進(jìn)全出，這個(gè)概念已經(jīng)不是新詞了，遺憾的是，目前只有規(guī)?；筘i場有條件做到。如有引種需要，應(yīng)當(dāng)確認(rèn)引種豬場是否存在本豬場沒有的疾病，引進(jìn)豬只需隔離，采樣做實(shí)驗(yàn)室檢測，防治疫病傳入。其次就是建立完善的消毒制度，批次間應(yīng)當(dāng)徹底清理、消毒，平時(shí)堅(jiān)持使用兩種或兩種以上不同消毒機(jī)制的消毒藥物輪換使用，定期消毒，當(dāng)發(fā)生傳染性疾病時(shí)，應(yīng)該做到隔天消毒甚至每天消毒。

此外豬場另一個(gè)不可忽視的重要因素就是糞污處理問題，豬場每天產(chǎn)生大量糞污，糞污本身就是傳染病重要的傳播途徑。豬場應(yīng)該建立有效的生物安全體系，采用蓄糞池對糞便進(jìn)行集中堆積發(fā)酵處理，從而阻斷細(xì)菌、病毒的擴(kuò)散。

豬病防治最為有效、不可缺少的環(huán)節(jié)，就是防疫。正確使用生物制品，加強(qiáng)疫苗管理，確保冷鏈安全運(yùn)輸，杜絕使用假冒偽劣疫苗。為了達(dá)到科學(xué)、合理地免疫接種，預(yù)防接種應(yīng)有周密的計(jì)劃，根據(jù)當(dāng)?shù)馗鞣N傳染病的發(fā)生和流行情況，擬定每年的預(yù)防接種計(jì)劃。通過抗體監(jiān)測，確定合適的首免日齡，以降低母源抗體的干擾，定期檢測抗體水平，抗體不合格及時(shí)補(bǔ)免。有條件的豬場還應(yīng)進(jìn)行豬瘟、偽狂犬等抗原監(jiān)測，及時(shí)淘汰抗原陽性豬，以防止種豬帶毒，污染豬場。

針對藥物使用的混亂情況，應(yīng)當(dāng)使用細(xì)菌培養(yǎng)初步區(qū)分細(xì)菌性或病毒性疾病，并開展藥敏試驗(yàn)。選用高效藥物，有效控制病情，提高治愈率。同時(shí)可以避免耐藥性的產(chǎn)生。如確診為病毒病，則應(yīng)及時(shí)進(jìn)行相應(yīng)疫苗的緊急免疫，以避免更大的損失。

[1]倪嬌,隋軍鋒,焦連國,侯高偉,劉天倫,呂帥陽,趙亞榮.4種病毒性豬病流行病學(xué)調(diào)查與分析[J].中國獸藥雜志，2012,46(06):8-10.

[2]蔣玉雯,黃安國,馮軍,鄭儒標(biāo),關(guān)大沛,滕永毅.用微量血細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)檢測豬細(xì)小病毒血凝抑制抗體[J].中國獸醫(yī)雜志，1986,(05):9-11.

[3]呂曉娟,郭偉,趙佳,畢敏.正向間接血凝試驗(yàn)檢測豬瘟免疫抗體的應(yīng)用[J].畜牧與獸醫(yī),2015,47(11):138.

[4]李嬌,王金良,沈志強(qiáng). 豬瘟抗體的幾種常用檢測方法概述[J]. 養(yǎng)豬,2013,(06):126-128.

[5]羅毅.用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)對豬瘟免疫及抗體效價(jià)監(jiān)測的效果分析[J].畜牧市場,2005,(08):139-141.

[6]洪云平,曹三杰,文心田. 斑點(diǎn)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測豬瘟血清抗體最佳條件的研究[J]. 畜禽業(yè),2006,(09):6-9.

[7]任娟.膠體金免疫層析技術(shù)研究現(xiàn)狀及進(jìn)展[J]. 新疆畜牧業(yè),2011,(12):22-24.

[8]李玥瑩. DNA體外擴(kuò)增技術(shù)——聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)[J]. 沈陽師范學(xué)院學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2000,(04):40-44.

[9]武昱孜,熊祺琰,劉蓓蓓,張珍珍,王佳,華利忠,韋艷娜,邵國青. 豬肺炎支原體和豬鼻支原體雙重?zé)晒舛縋CR檢測方法的建立[J]. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào),2017,48(08):1491-1498.

[10]郝建偉. 規(guī)?；i場豬瘟、豬偽狂犬病綜合防控及凈化[D].中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院,2009.