徐 雪, 張思然, 趙建波, 王艷芳, 張麗慧

(1. 杭州師范大學醫(yī)學院 藥理學教研室，醫(yī)學神經(jīng)生物學市級重點實驗室，浙江 杭州 310036；2. 浙江醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，浙江 杭州 310013)

小膠質(zhì)細胞是腦內(nèi)重要的神經(jīng)免疫細胞，維持神經(jīng)元微環(huán)境的動態(tài)平衡，參與腦組織多種生理及病理過程。自噬指真核細胞通過溶酶體降解細胞內(nèi)受損、變性和衰老的蛋白質(zhì)和細胞器，實現(xiàn)細胞穩(wěn)態(tài)以及自身物質(zhì)代謝更新和循環(huán)再利用的重要調(diào)控機制。最近研究表明，自噬異常誘導小膠質(zhì)激活及其神經(jīng)炎癥反應在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病機制中起關(guān)鍵作用[1-2]。本文主要介紹當前神經(jīng)炎癥與腦損傷的關(guān)系以及自噬參與腦損傷后炎癥反應的研究進展，在此基礎上，進一步討論自噬對炎癥反應的調(diào)節(jié)作用及機制。

1 神經(jīng)炎癥與腦損傷

神經(jīng)炎癥反應是腦缺血損傷以及帕金森病(Parkinson’s disease, PD)和阿爾茨海默病(Alzheimer's disease, AD) 等中樞退行性疾病發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素。大鼠局灶性腦缺血以及體外缺糖缺氧誘導的缺血樣損傷研究表明，小膠質(zhì)細胞激活及炎癥反應在缺血性腦損傷及神經(jīng)元死亡中起重要作用[3-4]。PD和AD研究顯示，腦內(nèi)小膠質(zhì)細胞大量激活，腦組織和腦脊液中炎癥細胞因子(包括IL-1β、IL-6 和TNF-α)明顯增高并與疾病進展相關(guān)[5]。在PD小鼠模型，PD 神經(jīng)毒素l-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(1-methyl-4- phenyl-1,2,3,6 tetrahydropyridine, MPTP)誘導黑質(zhì)紋狀體小膠質(zhì)細胞炎癥激活與多巴胺(dopamine, DA)神經(jīng)元變性死亡一致[6]。在體外細胞培養(yǎng)，1-甲基-4-苯基吡啶離子(1-methyl-4-phenylpyridinium，MPP+)激活的小膠質(zhì)細胞釋放前炎癥細胞因子和氧化應激產(chǎn)物進一步促進神經(jīng)元損傷[7]。在AD研究的多種動物模型中，表達突變的淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein, APP)基因和早老素1(presenilin-1, PS1)基因的雙轉(zhuǎn)基因小鼠能較好地模擬人類AD患者腦內(nèi)病理改變，是AD研究的重要動物模型[8]。應用APP/PS1小鼠研究發(fā)現(xiàn)，皮層小膠質(zhì)細胞激活及炎癥基因IL-1β、IL-6 和NLRP3表達水平與AD樣病理和認知障礙密切相關(guān)[8]。脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)是經(jīng)典的小膠質(zhì)細胞激活劑，黑質(zhì)注射LPS刺激小膠質(zhì)細胞激活及DA 神經(jīng)元變性死亡[9]。LPS 還誘導原代小膠質(zhì)細胞和小鼠BV2小膠質(zhì)細胞激活并釋放炎癥介質(zhì)TNF-α、IL-1β，IL-6和活性氧(reactive oxygen species，ROS)；LPS 處理的BV2小膠質(zhì)細胞條件培養(yǎng)液促進培養(yǎng)的PC12神經(jīng)元死亡[9-10]。因此，充分理解腦損傷發(fā)病過程中小膠質(zhì)細胞介導的神經(jīng)炎癥的作用，可能為防止腦損傷的進行性發(fā)展提供潛在靶點。

2 自噬異常參與腦損傷后炎癥反應

自噬是繼細胞凋亡之后當前神經(jīng)科學研究的熱點和前沿領(lǐng)域之一。根據(jù)底物的種類、轉(zhuǎn)運方式以及調(diào)控機制的不同，細胞自噬主要分為三種類型：分子伴侶介導的自噬，微自噬和巨自噬。目前，對自噬的研究主要集中在巨自噬即通常所稱的自噬。細胞自噬發(fā)生過程主要包括吞噬泡(phagophore)的形成，自噬體(autophagosome)的形成，后者與溶酶體融合形成自噬溶酶體(autolysosome)，并進一步通過溶酶體內(nèi)的酶降解底物[11]。自噬調(diào)節(jié)信號的改變有助于自噬活性的檢測。自噬相關(guān)蛋白Beclin1和LC3II表達增加提示自噬活化[12]，另一方面，自噬底物p62/SQSTM1(以下簡稱p62)蛋白水平升高通常被認為是自噬活性受抑制的標志[12]。正常生理狀態(tài)下細胞自噬維持在一定的基礎水平，自噬異常(自噬過度活化或不足)在中樞疾病的發(fā)病過程中具有重要作用。

已有研究報告，自噬參與腦缺血和中樞退行性疾病的神經(jīng)炎癥過程[13-14]。在小鼠永久性大腦中動脈結(jié)扎模型，腦組織缺血缺氧誘導小膠質(zhì)細胞自噬和前炎癥細胞因子TNF-α, IL-1β和 IL-6增加。自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤通過抑制自噬，預防缺血后的炎癥反應，減輕腦梗死、腦水腫和神經(jīng)功能障礙[13]。但是，相反的研究結(jié)果表明，自噬激活能減輕腦缺血后炎癥反應。在整體動物實驗，糖原合成激酶3β抑制劑SB216763通過誘導LC3II水平上調(diào)，減少永久性局灶性腦缺血大鼠皮層IL-1β，TNF-α和誘導型一氧化氮合酶水平。在培養(yǎng)的原代小膠質(zhì)細胞，SB216763也增加小膠質(zhì)細胞自噬活性，抑制炎癥反應；應用小干擾RNA(small interfering RNA, siRNA)技術(shù)誘導自噬標志蛋白Beclin1基因沉默，減弱SB216763在小膠質(zhì)細胞的抗炎效應[14]。雖然仍不清楚自噬對小膠質(zhì)細胞炎癥是正性或負性調(diào)節(jié)，上述結(jié)果提示自噬是調(diào)控腦缺血后小膠質(zhì)細胞激活和炎癥效應的重要因素[1]。在SD大鼠PD實驗研究中，黑質(zhì)注射PD神經(jīng)毒素MPP誘導α-突觸核蛋白聚集、小膠質(zhì)細胞激活及小膠質(zhì)CASP1/IL-1β表達，抗炎藥物黃芩苷增加LC3II水平，抑制MPP誘導的上述效應[15]。另一個小鼠的PD研究也表明，降血糖藥二甲雙胍通過誘導自噬活化(增加LC3Ⅱ和減少p62)，抑制小膠質(zhì)細胞過度激活上調(diào)的NLRP3炎癥小體和前炎癥細胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α水平，增加抗炎細胞因子IL-10水平，減輕MPTP加丙磺舒誘導的DA神經(jīng)元損傷和運動障礙[16]。在自噬相關(guān)基因(autophagy-related gene 7, Atg7)條件敲除小鼠和LC3或Atg 7基因沉默的小膠質(zhì)細胞，AD神經(jīng)毒素Aβ誘導小膠質(zhì)細胞激活、CASP1表達和IL-1β釋放增加；以Aβ處理LC3基因沉默小膠質(zhì)細胞的條件培養(yǎng)液培養(yǎng)神經(jīng)元，促進神經(jīng)元損傷；而藥物激活自噬可有效預防小膠質(zhì)細胞炎癥和小膠質(zhì)細胞介導的神經(jīng)毒性[17]。這些結(jié)果提示，自噬異常參與中樞疾病的神經(jīng)炎癥病理過程，調(diào)控小膠質(zhì)細胞自噬水平對炎癥相關(guān)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的防治具有重要意義。此外，細胞自噬是一個連續(xù)的高度動態(tài)變化的生物過程，自噬標志蛋白LC3Ⅱ增加可能是由于自噬活化早期自噬體形成增多，也可能是自噬后期自噬體與溶酶體融合障礙導致自噬體堆積的結(jié)果。自噬過程中任一環(huán)節(jié)的障礙將無法完成其生物學功能。因此，在自噬實驗中，應用自噬流檢測技術(shù)以準確評估細胞自噬活性變化，可進一步闡明自噬在腦損傷炎癥中的作用[12]。

3 自噬對炎癥反應的調(diào)節(jié)機制

近年研究發(fā)現(xiàn)，自噬與LPS誘導的小膠質(zhì)細胞炎癥激活存在復雜的關(guān)系。在LPS誘導的B6C3F1小鼠慢性炎癥模型，皮層和海馬炎癥細胞因子IL-1β增加，伴有自噬標志蛋白Beclin 1、p62和LC3改變[18]。在C57BL/6小鼠，LPS腹腔注射誘導腦內(nèi)p62持續(xù)堆積，LC3早期增加后期下降[19]。在體外研究，LPS處理的BV2細胞時間依賴性的增加聚集體樣LC3陽性斑點表達不被經(jīng)典的自噬抑制劑渥曼青霉素和Atg5 siRNA所抑制；在LPS和經(jīng)典的自噬誘導劑雷帕霉素共處理細胞，兩者獨立增加GFP-LC3標志點，Atg5 siRNA抑制雷帕霉素誘導的細胞自噬，但不抑制LPS的作用[20]。這些結(jié)果提示，LPS誘導BV2細胞非經(jīng)典型LC3陽性斑點[20]。LPS在BV2細胞誘導的聚集體樣LC3陽性斑點可能類似于巨噬細胞的聚集體樣誘導結(jié)構(gòu)(aggresome-like induced structures, ALIS)[21]及樹狀突細胞ALIS[22]。在巨噬細胞的研究已經(jīng)證明，LPS通過激活Toll樣受體4(toll like receptor 4，TLR4)誘導p62依賴性ALIS選擇性自噬[21,23]。與巨噬細胞ALIS形成相似，LPS也增加BV2細胞p62表達[20-21]。最近的兩個研究發(fā)現(xiàn)，LPS誘導BV2細胞NLRP3炎癥小體激活和IL1-β增加，伴有自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ、Beclin1增加和大量聚集的p62水平，提示自噬溶酶體降解功能障礙可能是炎癥細胞因子產(chǎn)生和釋放的原因。自噬抑制劑巴佛洛霉素A1和Atg5 siRNA不抑制LPS誘導的炎癥效應[24-25]。應用mRFP-GFP-LC3檢測細胞自噬流發(fā)現(xiàn)，LPS增加黃色自噬體和紅色自噬溶酶體數(shù)量，而α7-煙堿乙酰膽堿受體激動劑PNU282987促進自噬體向自噬溶酶體轉(zhuǎn)變，誘導高水平的自噬流。巴佛洛霉素A1或Atg5 siRNA阻斷自噬，抑制PNU282987在LPS刺激的BV2細胞的抗炎作用[25]。進一步研究顯示，mTOR依賴性自噬誘導劑雷帕霉素和非mTOR依賴性自噬誘導劑海藻糖誘導BV2細胞自噬活化，抑制LPS誘導BV2小膠質(zhì)前炎癥細胞因子IL1-β , IL-6, TNFα和氧化應激產(chǎn)物水平，減少細胞死亡；相反，Atg5 siRNA和3-甲基腺嘌呤抑制自噬，促進LPS誘導的小膠質(zhì)細胞激活和炎癥效應[20,26]。上述結(jié)果表明，LPS誘導小膠質(zhì)細胞炎癥激活和非經(jīng)典型LC3陽性斑點，藥物和基因沉默方法抑制經(jīng)典型自噬不能抑制LPS誘導的小膠質(zhì)細胞效應，自噬誘導劑誘導經(jīng)典型自噬激活可抑制LPS誘導的小膠質(zhì)細胞炎癥激活和細胞死亡。

炎癥小體是由細胞內(nèi)多蛋白組成的復合物。目前已發(fā)現(xiàn)的炎癥小體主要有4種：NLRP1、NLRP2、NLRP3和AIM2。幾乎所有的炎性體之中都含有炎性蛋白(NOD-like receptor，NLR)，統(tǒng)稱NOD樣受體家族。在小膠質(zhì)細胞/巨噬細胞中的炎癥小體主要是NLRP3，當細胞受到各種病理刺激時，NLRP3炎癥小體激活，通過產(chǎn)生活性的CASP1，進一步促進重要炎癥細胞因子IL-1β的成熟和釋放[27]。2011年，Tschopp研究組[28]在Nature期刊報道，THP1細胞和巨噬細胞中損傷線粒體釋放的ROS是調(diào)控NLRP3炎癥小體激活的關(guān)鍵信號。激活自噬減少損傷線粒體數(shù)量，可預防ROS促進的NLRP3炎癥小體激活，反之，自噬不足則加劇NLRP3炎癥小體激活。另一文獻表明相似的觀點，自噬抑制或不足導致TLR配體介導的IL-1α, IL-1β和IL-18分泌增加，這是TRIF和線粒體ROS/DNA依賴的，而激活自噬減少LPS誘導的pro-IL-1β和IL-1β水平，提示自噬作為IL-1家族的關(guān)鍵調(diào)節(jié)者，負性調(diào)節(jié)炎癥反應[29]。進一步對巨噬細胞自噬調(diào)節(jié)炎癥反應的作用機制研究表明，自噬對炎癥小體/IL-1β通路存在三個重要的作用環(huán)節(jié)：首先，自噬通過消化機能障礙的線粒體，預防線粒體釋放ROS對NLRP3炎癥小體的激活作用，提示自噬可能通過維持線粒體穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)炎性反應。其次，自噬通過降解炎癥小體復合物，防止pro-IL-1β裂解成活性的細胞因子產(chǎn)物。最后，自噬通過包裹并降解pro-IL-1β蛋白，調(diào)控IL-1β的成熟和釋放[30-31]。與巨噬細胞相似，最近實驗結(jié)果表明自噬調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細胞NLRP3炎癥小體激活[1,17]。另一方面，NLRP3炎癥小體和IL-1家族能誘導自噬激活，提示存在炎癥和自噬的相互作用[27,29,32]。

4 結(jié)語

大量的實驗數(shù)據(jù)證明，神經(jīng)炎癥反應在腦缺血和中樞神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，自噬通過影響小膠質(zhì)細胞炎癥激活參與腦損傷后炎癥病理過程。本文綜述了近年來神經(jīng)炎癥和自噬在腦損傷病理過程中的作用研究進展，為尋找神經(jīng)炎癥的重要治療靶點提供依據(jù)。隨著神經(jīng)科學實驗技術(shù)和方法的不斷發(fā)展和更新，小膠質(zhì)細胞自噬和神經(jīng)炎癥與腦損傷的關(guān)系研究也正在不斷進展。因此，深入了解神經(jīng)炎癥和自噬在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)病過程中的調(diào)控作用及機制，將有助于闡明炎癥相關(guān)的中樞疾病的病理生理特點，并進一步為相關(guān)中樞疾病的防治和藥物研發(fā)提供新策略。

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