劉丹丹 王莉彥 許爾屹 趙偉華

在肺癌患者中非小細(xì)胞肺癌約占85%～90%的比重[1]，因其具有較高發(fā)病率并具有較高生命風(fēng)險(xiǎn)，促使有關(guān)臨床研究不斷增多[2-3]。吉非替尼是非小細(xì)胞肺癌化療的常見(jiàn)分子靶向藥物，但其僅對(duì)部分患者能夠發(fā)揮良好效用，臨床應(yīng)用時(shí)常出現(xiàn)耐藥性等表現(xiàn)[4]。本研究分析肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)敏感非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞對(duì)吉非替尼的耐藥情況，分別選擇PC-9與H292敏感非小細(xì)胞肺癌作為試驗(yàn)對(duì)象，觀察細(xì)胞增殖、凋亡、細(xì)胞周期對(duì)吉非替尼耐藥情況，預(yù)期能夠明確肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)對(duì)腫瘤耐藥的影響，從而有效改善化療實(shí)施效果，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

選用上?；鄯f生物科技有限公司提供的PC-9人肺癌細(xì)胞與H292人肺癌細(xì)胞，上海博升生物科技有限公司提供的肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子，英國(guó)AstraZeneca UK Limited生產(chǎn)的吉非替尼片（產(chǎn)品批號(hào)為：LX767），福州邁新生物科技有限公司提供的鼠抗人p-EGFR、c-MET與p-MET試劑盒。

1.2 方法

提取2種不同類型非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞分別經(jīng)過(guò)PBS洗滌，再將其置入含10 ml胎牛血清的培養(yǎng)基中，以37℃、5%CO2環(huán)境下孵育，每隔72 h對(duì)其進(jìn)行換液傳代。將10 μg肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子稀釋至濃度為100 μg/ml的待檢液，采用DMSO溶液對(duì)吉非替尼藥物進(jìn)行稀釋處理，其濃度控制為50 μmol/ml。首先，開(kāi)展細(xì)胞活性與藥物半數(shù)抑制濃度的檢驗(yàn)，精稱100 ml細(xì)胞混懸液進(jìn)行接種，再滴入肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子母液100 μl與吉非替尼母液100 μl，培養(yǎng)3 d時(shí)分別在各孔中滴入蒙脫土（MTT） 20 μl，持續(xù)孵育4 h后行離心處理再滴入二甲基亞砜（DMSO） 200 μl使其充分混合、溶解。應(yīng)用酶標(biāo)儀測(cè)定其吸光度，并計(jì)算細(xì)胞存活率。提取肺癌細(xì)胞接種6孔板中，行2次PBS清洗后再滴入肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子母液與吉非替尼母液，持續(xù)培養(yǎng)2 d。收集培養(yǎng)液行離心處理再進(jìn)行2次PBS洗滌，給予固定120 min后行2次PBS洗滌，滴入標(biāo)記液500 μl，孵育30 min，再應(yīng)用流式細(xì)胞儀開(kāi)展細(xì)胞周期測(cè)定。采用相同方式處理肝細(xì)胞溶液，加入肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子母液與吉非替尼母液并行培養(yǎng)、離心、洗滌后再滴入Binging Buffer懸浮細(xì)胞500 μl與Annexin V-PE 5 μl，室溫放置5 min后以流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞凋亡測(cè)定。提取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)細(xì)胞進(jìn)行裂解處理，離心處理后采集蛋白裂解液，采取BCA蛋白定量法，并應(yīng)用Western blot法進(jìn)行細(xì)胞蛋白測(cè)定。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)處理應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，半數(shù)抑制濃度等計(jì)量資料采用（±s）表示，以t檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞活性與吉非替尼半數(shù)抑制濃度測(cè)定結(jié)果

PC-9細(xì)胞接受吉非替尼處理的半數(shù)抑制濃度為（0.05±0.02）μmol/L，H292細(xì)胞接受吉非替尼處理的半數(shù)抑制濃度為（0.18±0.04）μmol/L，組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5.18，P＜0.05）。吉非替尼濃度為0.01、0.04、0.1、0.4與1 μmol/L時(shí)，PC-9細(xì)胞存活率分別為80%、51%、42%、40%、39%，H292細(xì)胞存活率分別為84%、65%、50%、44%、42%，通過(guò)提高藥物濃度后細(xì)胞存活率不斷降低，表明兩種細(xì)胞接受藥物處理后的生長(zhǎng)抑制效果與藥物濃度呈負(fù)相關(guān)性。同時(shí)，兩種細(xì)胞接受肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子與吉非替尼處理后其半數(shù)抑制濃度有所上升。

2.2 肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)對(duì)吉非替尼耐藥的測(cè)定結(jié)果

PC-9細(xì)胞對(duì)照標(biāo)本存活率為100%，單用吉非替尼處理后其細(xì)胞存活率為52%，采用肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)與吉非替尼處理后其細(xì)胞存活率為61%；H292細(xì)胞對(duì)照標(biāo)本存活率為100%，單用吉非替尼處理后其細(xì)胞存活率為51%，采用肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)與吉非替尼處理后其細(xì)胞存活率為72%，表明肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子在兩種細(xì)胞對(duì)吉非替尼耐藥方面有誘導(dǎo)作用。

2.3 肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)對(duì)細(xì)胞凋亡與細(xì)胞周期的影響

單純應(yīng)用吉非替尼處理后H292細(xì)胞未見(jiàn)明顯細(xì)胞凋亡，處理前細(xì)胞凋亡率為8.4%，處理后細(xì)胞凋亡率為8.1%；PC-9細(xì)胞凋亡有促進(jìn)表現(xiàn)，處理前細(xì)胞凋亡率為13.2%，處理后凋亡率為16.7%；觀察PC-9細(xì)胞接受肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)與吉非替尼處理后其凋亡率有所降低，處理后凋亡率為8.3%。經(jīng)肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)對(duì)PC-9細(xì)胞與H292細(xì)胞周期無(wú)明顯影響。

2.4 細(xì)胞蛋白測(cè)定結(jié)果

Western Blot檢驗(yàn)表示肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子對(duì)兩種肺癌細(xì)胞c-MET磷酸化均有刺激作用。肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)前H292細(xì) 胞 c-MET表 達(dá) 為（0.122±0.013）， 磷 酸 化 c-MET表達(dá)為（0.135±0.024）；誘導(dǎo)后H292細(xì)胞c-MET表達(dá)為（0.147±0.019），磷酸化c-MET表達(dá)為（0.203±0.029），誘導(dǎo)前后H292細(xì)胞c-MET表達(dá)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但誘導(dǎo)前后磷酸化c-MET表達(dá)比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)前PC-9細(xì)胞c-MET表達(dá)為（0.142±0.021），磷酸化c-MET表達(dá)為（0.165±0.029）；誘導(dǎo)后PC-9細(xì)胞c-MET表達(dá)為（0.146±0.031），磷酸化c-MET表達(dá)為（0.219±0.018），誘導(dǎo)前后PC-9細(xì)胞c-MET表達(dá)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但誘導(dǎo)前后磷酸化c-MET表達(dá)比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。研究結(jié)果表現(xiàn)經(jīng)肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)后兩種細(xì)胞的磷酸化c-MET表達(dá)明顯提高。

3 討論

目前，國(guó)內(nèi)臨床已將吉非替尼作為非小細(xì)胞肺癌的常用化療藥物[5-6]，但部分患者存在耐藥情況[7]，而臨床對(duì)其形成機(jī)制尚不明確[8]。肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子是當(dāng)前腫瘤學(xué)科研究熱點(diǎn)內(nèi)容[9]，報(bào)道表示癌癥患者通常存在肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子表達(dá)上升表現(xiàn)[10]，并同其侵襲情況具有緊密關(guān)聯(lián)[11-12]。本次研究分別選取了兩種吉非替尼敏感的肺癌細(xì)胞，PC-9與H292細(xì)胞均排除了其藥物耐藥影響因素。試驗(yàn)結(jié)果表現(xiàn)兩種細(xì)胞接受吉非替尼處理的半數(shù)抑制度分別為（0.05±0.02）μmol/L與（0.18±0.04）μmol/L，在增加用藥濃度后兩種細(xì)胞存活率均出現(xiàn)明顯下降表現(xiàn)，體現(xiàn)其藥物濃度越高細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用越強(qiáng)，并且應(yīng)用肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)后兩種細(xì)胞半數(shù)抑制濃度均明顯升高。同時(shí)，應(yīng)用肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)后兩種細(xì)胞存活率均有所下降，提示肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子在兩種細(xì)胞對(duì)吉非替尼耐藥方面有誘導(dǎo)作用。但肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子僅對(duì)PC-9細(xì)胞凋亡有所影響，對(duì)H292細(xì)胞凋亡及兩種細(xì)胞周期均無(wú)顯著影響。而Western Blot檢驗(yàn)表示肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子對(duì)兩種肺癌細(xì)胞c-MET磷酸化均有刺激作用，在肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)后，H292與PC-9細(xì)胞的c-MET表達(dá)未發(fā)生顯著改變，但誘導(dǎo)后兩種細(xì)胞的磷酸化c-MET表達(dá)分別為（0.203±0.029）與（0.219±0.018），同誘導(dǎo)前相比較均明顯升高，進(jìn)而可推斷其耐藥作用機(jī)制或?yàn)榇碳ぜ?xì)胞c-MET磷酸化表達(dá)增強(qiáng)。