管詠梅+朱衛(wèi)豐+管雪靜+廖正根+趙國(guó)巍+董偉+梁新麗

[摘要] 建立測(cè)定大鼠血漿中多烯紫杉醇LC-MS方法，并分別研究白芷中3個(gè)香豆素成分（歐前胡素、異歐前胡素及氧化前胡素）對(duì)多烯紫杉醇藥代動(dòng)力學(xué)的影響。以紫杉醇為內(nèi)標(biāo)，血漿樣品經(jīng)甲醇沉淀蛋白，LC-MS測(cè)定，方法經(jīng)特異性、線性范圍、準(zhǔn)確度、精密度、穩(wěn)定性等確證適合用于血漿中多烯紫杉醇的測(cè)定。試驗(yàn)采用每組6只大鼠，分別口服灌胃給予多烯紫杉醇（50 mg·kg-1）組、氧化前胡素（8 mg·kg-1）配伍多烯紫杉醇（50 mg·kg-1）組；歐前胡素（15 mg·kg-1）配伍多烯紫杉醇（50 mg·kg-1）組、異歐前胡素（15 mg·kg-1）配伍多烯紫杉醇（50 mg·kg-1）組。LC-MS測(cè)定給藥后血漿中多烯紫杉醇濃度，繪制血藥濃度-時(shí)間曲線，并用DAS 2.0軟件計(jì)算相關(guān)藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。結(jié)果顯示多烯紫杉醇與3個(gè)香豆素成分配伍前后其藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)有了明顯的變化。血藥濃度-時(shí)間曲線下面積（AUC）顯著性增加，藥峰濃度（Cmax）顯著提高。表明白芷香豆素類化合物能促進(jìn)多烯紫杉醇的口服生物利用度，三者對(duì)多烯紫杉醇口服生物利用度的影響作用氧化前胡素最強(qiáng)、異歐前胡素次之、歐前胡素最弱。

[關(guān)鍵詞] 多烯紫杉醇； 歐前胡素； 異歐前胡素； 氧化前胡素； 藥代動(dòng)力學(xué)

[Abstract] The study was aimed to establish a liquid chromatography-tandem mass spectrometric method for the determination of the docetaxel concentration in rat plasma， and study the effect of coumarin constituents （imperatorin， isoimperatorin and oxypeucedanin） in Angelica dahurica on pharmacokinetics of docetaxel.Plasma was precipitated with acetonitrile and determined by LC-MS method with Paclitaxel as an internal standard. The specificity， linearity， range， accuracy， precision and stability of the method were suitable for the determination of docetaxel in plasma.Six sprague-dawley rats in each group received intragastric administration of docetaxel （50 mg·kg-1）， oxypeucedanin （8 mg·kg-1） combined with docetaxel （50 mg·kg-1）， imperatorin （15 mg·kg-1） combined with docetaxel （50 mg·kg-1）， and isoimperatorin（15 mg·kg-1） combined with docetaxel （50 mg·kg-1）.Their drug plasma concentration was determined by LC-MS with Paclitaxel as an internal standard to draw plasma concentration-time curve， and the phamacokinetic parameters were calculated by DAS 2.0. The results showed that the phamacokinetic parameters of docetaxel all had notable changes when combined with imperatorin， isoimperatorin， and oxypeucedanin， respectively. The phamacokinetic parameters AUC and Cmax were significantly increased， indicating that coumarin constituents in Angelica dahurica could promote the oral bioavailability of docetaxel， and their effects were in the following order： oxypeucedanin>isoimperatorin>imperatorin.

[Key words] docetaxel； imperatorin； isoimperatorin； oxypeucedanin； phamacokinetic

白芷為我國(guó)大宗常用中藥材品種之一，其收載于2015年版《中國(guó)藥典》一部[1]，具有祛風(fēng)散寒、燥濕排膿、止痛等功效[2]，其活性組份主要為白芷香豆素和揮發(fā)油，前期研究結(jié)果表明白芷香豆素可促進(jìn)配伍對(duì)藥活性成分如葛根素、黃苓苷等的腸道轉(zhuǎn)運(yùn)[3-4]，同時(shí)發(fā)現(xiàn)白芷香豆素有規(guī)律的促進(jìn)P-gp介導(dǎo)的藥物的腸道轉(zhuǎn)運(yùn)，而且對(duì)P-gp的表達(dá)具有一定的抑制作用[5]。進(jìn)一步采用體外Caco-2細(xì)胞模型考察了白芷中香豆素單一成分對(duì)P-gp介導(dǎo)藥物腸道轉(zhuǎn)運(yùn)的影響[6]，研究結(jié)果表明白芷中歐前胡素、異歐前胡素及氧化前胡素可促進(jìn)此類藥物的腸道轉(zhuǎn)運(yùn)。P-gp是一種重要的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，與藥物結(jié)合后，在其核苷酸結(jié)合位點(diǎn)上結(jié)合ATP，ATP水解后所釋放的能量使藥物泵出細(xì)胞外，導(dǎo)致藥物濃度下降，進(jìn)而影響藥物吸收[7-8]。在腫瘤細(xì)胞中P-gp一般表達(dá)較高，其可降低細(xì)胞內(nèi)的藥物濃度，導(dǎo)致腫瘤的多藥耐藥的發(fā)生。許多臨床一線廣泛使用的藥物均能引起腫瘤的多藥耐藥作用，如長(zhǎng)春花生物堿類、紫衫烷類、多柔比星等。多烯紫杉醇是紫杉烷類的抗腫瘤藥物，是現(xiàn)有藥物中治療轉(zhuǎn)移乳腺癌和非小細(xì)胞癌最有效的單劑化療藥物。但其水溶性低[9]、口服生物利用度低[10]，進(jìn)因而阻礙了其在口服制劑的應(yīng)用。因此本文在此前研究基礎(chǔ)上，建立血漿中多烯紫杉醇LC-MS測(cè)定方法，進(jìn)一步研究白芷香豆素中歐前胡素、異歐前胡素和氧化前胡素對(duì)多烯紫杉醇藥代動(dòng)力學(xué)的影響。endprint

1 材料

1.1 藥品與試劑

多烯紫杉醇（西安昊軒生物科技有限公司，批號(hào)DXZSC-141229）；氧化前胡素對(duì)照品（上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司，批號(hào)100420）；歐前胡素對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)110826-200712）；異歐前胡素對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)110827-200407）。

1.2 儀器

AB 4500 QTRAP液質(zhì)聯(lián)用儀（美國(guó)AB公司）；XW-80A渦旋混合器（上海青浦滬西儀器廠）；3-18K型高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Sigma公司）；微量移液槍（美國(guó)Thermo公司）。

1.3 動(dòng)物

SD大鼠，雄性，體質(zhì)量180～200 g，湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，許可證號(hào)SCXK（湘）2011-0003。

2 方法

2.1 大鼠血漿中多烯紫杉醇LC-MS/MS分析方法的建立

2.1.1 多烯紫杉醇色譜條件 色譜柱Agilent ZORBAXExtend-C18（2.1 mm×100 mm，3.5 μm），流動(dòng)相A為乙腈，B為0.1%乙酸，梯度洗脫：0～1 min，30%～52% A；1～3 min，52% A；3～3.1 min，52%～70% A；3.1～5 min，70% A。柱溫25 ℃，體積流量為0.4 mL·min-1，進(jìn)樣量為10 μL。

2.1.2 質(zhì)譜條件 ESI離子源；正離子模式；多反應(yīng)檢測(cè)方式（MRM）；測(cè)定多烯紫杉醇檢測(cè)離子為 m/z 802.4→527.2，紫杉醇檢測(cè)離子為 m/z 854.2→569.2；氣簾氣壓35 psi （1 pis=6.895 kPa）；噴霧電壓5 500 V；去簇電壓：多烯紫杉醇50 V，紫杉醇100 V；碰撞能量15 V；霧化器45 psi，平衡器45 psi。

2.1.3 血漿樣品的處理 室溫下水浴融化血漿，混勻，精密吸取100 μL，置于1.5 mL Eppendorf管中，依次加入20 μL空白甲醇，20 μL內(nèi)標(biāo)溶液，渦旋60 s，加入360 μL甲醇，渦旋3 min，16 000 r·min-1離心10 min，吸取上清液，按照2.1.2項(xiàng)質(zhì)譜條件進(jìn)樣檢測(cè)。

2.1.4 多烯紫杉醇儲(chǔ)備液與紫杉醇儲(chǔ)備液的配制 精密稱取定量的多烯紫杉醇對(duì)照品，甲醇超聲溶解定容到25 mL量瓶，作為儲(chǔ)備液。采用倍數(shù)稀釋法，分別得到質(zhì)量濃度0.025 5，0.051 0，0.255，0.510，2.55，5.10，10.2 mg·L-1的系列工作液。精密稱取一定量的紫杉醇對(duì)照品，甲醇超聲溶解定容至25 mL。臨用時(shí)取出適量稀釋至質(zhì)量濃度為200 μg·L-1。

2.1.5 特異性 取大鼠空白血漿100 μL，按2.1.3項(xiàng)下方法操作，大鼠空白血漿不加內(nèi)標(biāo)（紫杉醇）樣本、空白血漿加入內(nèi)標(biāo)樣本、空白血漿加入多烯紫杉醇樣本、給藥后大鼠血漿加入內(nèi)標(biāo)（紫杉醇）樣本，并記錄相應(yīng)的色譜圖。

2.1.6 標(biāo)準(zhǔn)系列樣品和質(zhì)控樣品的制備 精密移取SD大鼠空白血漿100 μL于1.5 mL離心管中，依次加入20 μL系列工作溶液，20 μL內(nèi)標(biāo)溶液，渦旋60 s，加入360 μL甲醇，渦旋3 min，16 000 r·min-1離心10 min，吸取上清液，備用。即得質(zhì)量濃度為1.02，2.04，10.2，20.4，102，204，408 μg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)系列樣品和1.02（LLOQ），2.04（QCL），20.4（QCM），204 μg·L-1（QCH）系列質(zhì)控樣品。

2.1.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍 取大鼠標(biāo)準(zhǔn)血漿系列樣品，采用2.1.1項(xiàng)LC-MS/MS條件進(jìn)樣。以多烯紫杉醇的加入濃度C為橫坐標(biāo)，以待測(cè)物As與內(nèi)標(biāo)Ai的峰面積比值（f=As/Ai）為縱坐標(biāo)進(jìn)行權(quán)重回歸（權(quán)重系數(shù)為1/C2）.

2.1.8 最低定量限與精密度和準(zhǔn)確度 取多烯紫杉醇血漿質(zhì)控系列樣品（LLOQ，QCL，QCM，QCH）每種質(zhì)量濃度5份，按2.1.3項(xiàng)下操作，連續(xù)測(cè)定3 d，以隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算最低定量限與質(zhì)控樣品的濃度，將同一濃度3 d共18個(gè)樣品的實(shí)測(cè)濃度進(jìn)行單因素方差分析，計(jì)算日內(nèi)、日間精密度（RSD）和準(zhǔn)確度（RE）。

2.1.9 提取回收率 取多烯紫杉醇血漿質(zhì)控系列樣品（QCL，QCM，QCH）每種質(zhì)量濃度6份，按2.1.3項(xiàng)下操作，用其進(jìn)樣得到的峰面積除以未經(jīng)提取處理的低、中、高3種相應(yīng)質(zhì)量濃度的多烯紫杉醇質(zhì)控工作液及內(nèi)標(biāo)工作液后進(jìn)樣得到的峰面積，計(jì)算血漿中多烯紫杉醇的提取回收率。

2.1.10 穩(wěn)定性 考察多烯紫杉醇低、中、高3個(gè)質(zhì)量控制濃度的血漿樣品在室溫放置6 h，-20 ℃下放置7 d以及-20 ℃下反復(fù)凍融3次的穩(wěn)定性。

2.2 白芷香豆素對(duì)多烯紫杉醇在大鼠體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)的影響

2.2.1 藥代動(dòng)力學(xué)給藥方案 雄性SD大鼠隨機(jī)分成6組，實(shí)驗(yàn)分3 d完成，每次實(shí)驗(yàn)前至少12 h禁食不禁水。分別灌胃給予50 mg·kg-1多烯紫杉醇、多烯紫杉醇（50 mg·kg-1）配伍氧化前胡素（8 mg·kg-1）；50 mg·kg-1多烯紫杉醇、多烯紫杉醇（50 mg·kg-1）配伍歐前胡素（15 mg·kg-1）；50 mg·kg-1多烯紫杉醇、多烯紫杉醇（50 mg·kg-1） 配伍異歐前胡素（15 mg·kg-1）。分別于給藥后0.083，0.166，0.25，0.5，1，1.5，2，4，6，8，10，12 h眼眶靜脈叢取血0.5 mL，并置于1.5 mL肝素抗凝管中，4 000 r·min-1離心10 min，精密吸取上清液至1.5 mL EP管中，立即儲(chǔ)存于-20 ℃冰箱，備用。

2.2.2 數(shù)據(jù)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用DAS 2.0藥代動(dòng)力學(xué)軟件處理，非房室方法計(jì)算藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)是由平均血藥濃度數(shù)據(jù)計(jì)算得到，Cmax和AUC的方差由軟件自帶的稀疏數(shù)據(jù)計(jì)算方法得到。endprint

3 結(jié)果

3.1 大鼠血漿中多烯紫杉醇LC-MS方法學(xué)考察

3.1.1 特異性 多烯紫杉醇及內(nèi)標(biāo)的峰形良好，保留時(shí)間分別為 2.85，3.19 min，大鼠空白血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾測(cè)定，見圖1。

3.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍 多烯紫杉醇在大鼠血漿中標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.005 46x+0.013 4，R2=0.993 3，線性范圍2.040～408.0 μg·L-1。

3.1.3 最低定量限與精密度和準(zhǔn)確度 多烯紫杉醇日內(nèi)精密度RSD為4.1%～8.3%，日間精密度RSD為5.9%～10%，RSD均小于15%，重復(fù)性好，符合要求。準(zhǔn)確度91.20%～97.80%。最低定量限（LLOQ）為1.02 μg·L-1（S/N>10），表明該方法靈敏度高，可用于多烯紫杉醇的微量分析。

3.1.4 回收率 多烯紫杉醇方法回收率為80.10%～92.90%，RSD為2.9%～9.4%，小于15%；內(nèi)標(biāo)的提取回收率83.50%～96.70%，RSD為5.2%。

3.1.5 樣品穩(wěn)定性 多烯紫杉醇低、中、高3個(gè)濃度樣品室溫放置6 h后相對(duì)偏差RE為-10%～-1.7%，RSD≤8.9%。-20 ℃放置7 d后相對(duì)偏差RE為-7.3%～-2.6%，RSD≤9.3%。凍融3次后相對(duì)偏差RE為-0.40%～5.0%，RSD≤8.8%。表明多烯紫杉醇血漿樣品在上述條件下穩(wěn)定。

3.2 白芷香豆素對(duì)多烯紫杉醇在大鼠體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)的影響

多烯紫杉醇及多烯紫杉醇分別配伍歐前胡素、異歐前胡素及氧化前胡素后的大鼠體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)見表1，血藥濃度-時(shí)間曲線見圖2～4。結(jié)果提示多烯紫杉醇配伍歐前胡素后AUC，Cmax及藥時(shí)曲線下面積均有所提高；多烯紫杉醇配伍異歐前胡素后AUC，Cmax及藥時(shí)曲線下面積顯著提高，其中AUC，Cmax分別為配伍前的1.3，1.5倍；多烯紫杉醇配伍氧化前胡素后AUC，Cmax及藥時(shí)曲線下面積顯著提高，其中AUC，Cmax分別為配伍前的1.7，1.5倍。

4 討論

目前許多藥物和活性成分因P-gp外排而使其口服生物利用度差，使得該類藥物難以開發(fā)成有效的口服制劑，甚至難以成藥，如具有較強(qiáng)藥理活性的柔比星、紫杉醇、長(zhǎng)春新堿、芍藥苷等[11-12]。前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明白芷中歐前胡素、異歐前胡素及氧化前胡素對(duì)多烯紫杉醇的吸收促進(jìn)作用。但上述研究是在體外細(xì)胞模型開展，本實(shí)驗(yàn)基于體外細(xì)胞模型結(jié)果的可信度，采用體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)分別驗(yàn)證該3種成分對(duì)多烯紫杉醇體內(nèi)過程的影響，結(jié)果證實(shí)白芷中香豆素對(duì)多烯紫杉醇P-gp介導(dǎo)的藥物有顯著促進(jìn)作用。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，多烯紫杉醇單獨(dú)給藥和分別配伍白芷中歐前胡素、異歐前胡素及氧化前胡素后，藥代動(dòng)力學(xué)行為有明顯差異，差異主要表現(xiàn)在聯(lián)合給藥后的AUC，Cmax等參數(shù)上，聯(lián)合給藥后AUC，Cmax均較單獨(dú)給藥組顯著提高，歐前胡素、異歐前胡素對(duì)多烯紫杉醇t1/2無顯著影響，而氧化前胡素配伍多烯紫衫醇后t1/2下降，表明3種成分增加多烯紫杉醇生物利用度的原因與對(duì)消除率影響無關(guān)，可能是三者對(duì)介導(dǎo)多烯紫杉醇在體內(nèi)外排作用的P-gp具有影響，或三者抑制了P-gp蛋白表達(dá)或其他原因?qū)е疗渫馀殴δ苁艿揭种疲瑥亩黾恿硕嘞┳仙即伎诜锢枚取?/p>

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[責(zé)任編輯 張燕]endprint