吳　艷，潘愛鑾，杜金平，皮勁松，梁振華，申　杰，張　昊，蒲躍進(jìn)，孫　靜

(1. 湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所 湖北省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新中心，武漢　430064；2. 動物胚胎工程與分子育種湖北省重點實驗室，武漢　430064)

環(huán)狀RNA(circular RNA，circRNA)是一類新發(fā)現(xiàn)的內(nèi)源性非編碼RNA(non-coding RNA，ncRNA)，最早于1976年在某些高等植物中被發(fā)現(xiàn)[1]。與傳統(tǒng)的線性RNA(linear RNA，含5′和3′末端)相比，circRNA的不同在于其5′和3′端以共價鍵連接在一起呈封閉環(huán)狀結(jié)構(gòu)，不受RNA外切酶影響，表達(dá)更穩(wěn)定、不易降解[2]。近幾年的研究結(jié)果顯示circRNA在調(diào)控人類基因中展現(xiàn)出巨大的潛能[3]，使其成為RNA領(lǐng)域最新的研究熱點。早期的研究認(rèn)為，circRNA是正常的編碼RNA剪接發(fā)生錯誤而導(dǎo)致的產(chǎn)物[4]，但隨著研究的深入，這種觀點已經(jīng)發(fā)生改變。已有研究表明，circRNA主要通過稱之為反式剪接的過程產(chǎn)生，在此過程中，下游的外顯子同上游的外顯子發(fā)生反向剪接，即一個剪接受體與主轉(zhuǎn)錄本上游的剪接供體相結(jié)合，形成一個環(huán)形的副本；在各種不同類型的動物和植物細(xì)胞中，circRNA來源于蛋白質(zhì)編碼基因和非編碼基因[5]。在哺乳動物中的研究證明，circRNA來源于蛋白質(zhì)編碼基因的外顯子并且發(fā)揮miRNA(microRNA)海綿的作用[6]。最新研究發(fā)現(xiàn)，在動物體內(nèi)RNA的環(huán)化與前體mRNA的剪接存在競爭抑制關(guān)系，以此來保持組織特異性基因的表達(dá)[7]。然而circRNA的主要作用仍不清楚。本文主要綜述circRNAs的來源、特征、形成機制、主要功能、研究方法及其在畜禽中的研究進(jìn)展，并對circRNA在畜禽中的研究前景進(jìn)行展望，為進(jìn)一步研究circRNAs提供一定的理論基礎(chǔ)與技術(shù)支撐。

1　circRNA的形成機制

circRNA在真核生物中主要通過一種反向可變剪接，使基因的外顯子序列反向首尾連接形成環(huán)狀RNA。其形成方式包括外顯子來源的circRNA(exonic circular RNA)、內(nèi)含子來源的circRNA(intronic circular RNA)及由外顯子和內(nèi)含子共同組成的circRNA(exonic -intronic circular RNA, ElciRNA)。

1.1　外顯子來源circRNA和ElciRNA的形成機制

關(guān)于exonic circRNA 和ElciRNA的形成機制主要有3種：直接反式剪接、外顯子跳躍和內(nèi)含子配對驅(qū)動的環(huán)化。直接反式剪接是由同一個外顯子下游的3′端和上游的5′端相結(jié)合，使下游的供體與上游的配體配對，從而使外顯子環(huán)化形成circRNAs；外顯子跳躍需要通過內(nèi)含子跳讀產(chǎn)生一個包含外顯子的套索，套索內(nèi)部通過拼接將內(nèi)含子切除從而產(chǎn)生circRNAs[8]；內(nèi)含子配對驅(qū)動的環(huán)化是位于兩個外顯子側(cè)翼的內(nèi)含子之間存在互補序列，其可直接通過堿基配對誘導(dǎo)環(huán)化形成circRNA。此外，有研究表明，RNA通過側(cè)翼內(nèi)含子與個體內(nèi)含子形成配對競爭，以保證外顯子環(huán)化的效率[9]；環(huán)化剪接和線性剪接之間存在競爭，從而使circRNAs具有基因調(diào)控的功能[10]。

1.2　內(nèi)含子來源circRNA的形成機制

根據(jù)內(nèi)含子剪接機制的不同，可將內(nèi)含子分為自我剪接內(nèi)含子、酶促剪接內(nèi)含子及核mRNA前體內(nèi)含子。其中，自我剪接內(nèi)含子可分為Ⅰ類內(nèi)含子、Ⅱ類內(nèi)含子，機體內(nèi)的內(nèi)含子circRNAs主要由這兩類內(nèi)含子剪接而成。Ⅰ類內(nèi)含子參與常規(guī)剪接：結(jié)合在內(nèi)含子上的一個外源鳥苷作為親核體與5′剪接位點相作用，從而形成環(huán)狀RNA；Ⅱ類內(nèi)含子介導(dǎo)的circRNA的形成：環(huán)狀的形成需要3′端外顯子釋放，內(nèi)含子末端的3′-OH攻擊5′堿基位點，2′-5′磷酸二酯鍵形成從而產(chǎn)生一個環(huán)狀RNA[11]。

2　環(huán)狀RNA的特征與主要功能

2.1　環(huán)狀RNA的特征

由于早期研究技術(shù)限制，只有少數(shù)環(huán)狀RNA被發(fā)現(xiàn)，豐富性較低。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，在多種生物細(xì)胞和組織中，有超過10%的表達(dá)基因能夠產(chǎn)生circRNA[12]，表明circRNA是一類古老、在真核基因中保守的分子[13]。此外，circRNA還具有以下特征：大部分屬于非編碼RNA[14]；主要由外顯子衍生而來[15]；同一基因位點或許可通過選擇性環(huán)化產(chǎn)生多種circRNAs[16]；比線性RNA穩(wěn)定，不易降解[17]。circRNA的這些特性表明其具有重要的生物功能。

2.2　circRNA的主要功能

近年來的研究表明circRNA具有較高的豐富性，但是其生物學(xué)功能仍需不斷研究。目前，circRNA的功能主要包括以下幾個方面：

2.2.1miRNA海綿作用miRNA是一類長度在21 nt左右的RNA，它們可以通過堿基互補配對直接與mRNA靶標(biāo)相結(jié)合，從而起到抑制mRNA翻譯的作用[18]。由于circRNA擁有miRNA結(jié)合位點，其可以通過吸附特定的miRNA，競爭性抑制miRNA與靶標(biāo)結(jié)合的能力[19]。已有的研究證明，大多數(shù)circRNA具有多個miRNA結(jié)合位點[3,20]，但circRNA是否普遍具有miRNA海綿作用還有待進(jìn)一步驗證。

2.2.2調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄、參與蛋白合成circRNA除能夠調(diào)控miRNA外，還可與RNA結(jié)合蛋白相結(jié)合形成 RNA蛋白復(fù)合物，對RNA結(jié)合蛋白和miRNA起調(diào)節(jié)作用或者通過部分堿基互補配對直接作用于靶基因[21]。Chen等[22]研究證明circRNA具有編碼蛋白質(zhì)的功能。由于circRNA沒有ploy(A)尾的結(jié)構(gòu)，不易從尾端被降解，從而證明circRNA在調(diào)控RNA轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)合成上可能具有關(guān)鍵性的作用[23]。此外，有研究表明circRNA還具有存儲、定位RNA結(jié)合蛋白的功能[24]。

3　circRNA的研究方法

對circRNA 的研究主要包括circRNA 的鑒定、circRNA 的表達(dá)和生物學(xué)功能研究。circRNA 的鑒定依賴于多種檢測工具，目前已有的circRNA 檢測工具和算法包括MapSplice[25]、PredcircRNA[26]、UROBORUS[27]、NCLscan[28]、circRNA_finder、find_circ、CIRC explorer和CircSeq等[20,29]。上述工具對circRNA 檢測的精確度和靈敏度各不相同，聯(lián)合使用可有效預(yù)測circRNA。

目前已有大量的circRNAs 被檢測出來，并建立多個circRNA 數(shù)據(jù)庫，包括circBase (http://www.circbase.org/)[30]、circRNABase (http://starbase.sysu.edu.cn/mir-CircRNA.php)[31]、Circ2Traits (http://gyanxet- beta.com/circdb)[32]、circ-Net (http://circnet.mbc.nctu.edu.tw/)[33]、deepBasev2.0 (http://deepbase.sysu.edu.cn/)[34]、Circ Interactome (http://circinteractome.nia.nih.gov/)[35]等。上述數(shù)據(jù)庫收錄了已發(fā)表的circRNA 數(shù)據(jù)，并對新的circRNAs及circRNA 與miRNA的潛在結(jié)合位點和相互作用關(guān)系進(jìn)行預(yù)測，構(gòu)建circRNA 表達(dá)圖譜和miRNA-circRNA、circRNA-RNA結(jié)合蛋白(RBP)互作網(wǎng)絡(luò)，為開展circRNA的功能研究提供有用的工具。

circRNA 表達(dá)及生物學(xué)功能研究利用常規(guī)生物學(xué)技術(shù)，如實時熒光定量PCR (Quantitative Real-time PCR)、載體構(gòu)建、蛋白印記(Western blot)、免疫組化(Immunohistochemistry staining)、RNA 印跡(Northern blot)等結(jié)合生物信息學(xué)軟件，分析circRNA 在不同組織中的表達(dá)差異，預(yù)測circRNA 與miRNA 的潛在結(jié)合位點，探究circRNA 在疾病或某些生理過程中的作用機制，為更深入了解circRNA的功能提供技術(shù)支持。

4　circRNA在畜禽中的研究進(jìn)展

目前，有關(guān)circRNA的研究主要集中于疾病(尤其是癌癥)方面[36-42]，關(guān)于動物尤其是畜禽的相關(guān)研究報道相對較少。在家畜方面，Ven等[43]研究發(fā)現(xiàn)circRNA在胚胎期豬的腦發(fā)育過程中具有重要的調(diào)控作用。Zhang等[44]研究產(chǎn)后90 和250 d的奶牛乳腺組織中差異表達(dá)的circRNA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)來源于酪蛋白的差異circRNA在奶牛乳腺組織中高表達(dá)，提示其可能參與酪蛋白的表達(dá)調(diào)控。Sun等[45]研究藍(lán)塘豬和長白豬肌肉組織中差異表達(dá)的編碼基因、LncRNA、circRNA及miRNA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)的circRNA其236個來源基因中有93個是與肌肉發(fā)育相關(guān)的主要功能基因。Tao等[46]研究發(fā)現(xiàn)麻城黑山羊和布爾山羊排卵前的卵泡組織中共有37個差異表達(dá)的circRNA，其中chi_circ_0008219可與3個卵泡相關(guān)的miRNA相結(jié)合，提示circRNA對母羊卵巢卵泡有潛在的影響。Li等[47]研究產(chǎn)前和產(chǎn)后綿羊腦垂體中差異表達(dá)的circRNA，結(jié)果表明大量的circRNA與垂體特異性的miRNA相互作用并參與腦垂體的生物學(xué)功能。Wei等[48]分析胚胎期和成年牛的背最長肌中差異表達(dá)的circRNA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)過表達(dá)circLMO7抑制初生牛的成肌細(xì)胞分化，其通過競爭性結(jié)合miR-378a-3p發(fā)揮作用。Li等[49]利用RNA-seq方法研究胚胎期和生產(chǎn)后綿羊背最長肌組織中的circRNA，分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)的circRNA其來源基因主要富集于肌肉生長和發(fā)育相關(guān)的信號通路。而在家禽方面，關(guān)于circRNA的相關(guān)研究報道僅見Zhang等[50]發(fā)現(xiàn)circRNA的改變參與雞禽白血病J亞型引起的腫瘤形成過程，其他方面的研究還未見報道。

5　展 望

目前對于circRNA 的研究尚處起步階段，有大量問題需要被進(jìn)一步闡明。隨著高通量測序技術(shù)和生物信息學(xué)的快速發(fā)展，越來越多的circRNA被鑒定，circRNA的功能研究越來越深入。近年來研究發(fā)現(xiàn)circRNA與疫病發(fā)生密切相關(guān)，可以作為未來癌癥等疾病檢測的新型標(biāo)志物[51-52]。在畜禽方面，近年來對circRNA的研究主要集中在與經(jīng)濟性狀相關(guān)的circRNA的研究上。鑒于circRNA在基因表達(dá)調(diào)控中的重要作用，深入開展與畜禽經(jīng)濟性狀(包括肌肉發(fā)育、肉質(zhì)、繁殖、脂肪沉積等)相關(guān)的circRNA的鑒定與功能研究，為更好地了解和開展畜禽分子育種提供理論依據(jù)和技術(shù)指導(dǎo)。

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