計(jì)德永+王虎+賈文娟+方立異+許克義

[摘要] 產(chǎn)前診斷（prenatal diagnosis）是指在出生前對(duì)胚胎或胎兒的發(fā)育狀態(tài)、是否患有疾病等方面進(jìn)行檢測(cè)診斷。通過(guò)遺傳咨詢(xún)，應(yīng)用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)，結(jié)合免疫遺傳學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)、分子遺傳學(xué)等學(xué)科，通過(guò)母體檢查或?qū)ε咛ィㄌ海┲苯訖z測(cè)，了解胎兒在子宮內(nèi)的生長(zhǎng)發(fā)育狀況，診斷胎兒是否有遺傳缺陷及先天畸形。本文就各種產(chǎn)前診斷方法、最新技術(shù)、存在的不足與困難及發(fā)展前景綜述如下。

[關(guān)鍵詞] 產(chǎn)前診斷；胎兒細(xì)胞；熒光原位雜交技術(shù)；光譜核型分析；胎兒游離DNA

[中圖分類(lèi)號(hào)] R714.5 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2017）35-0161-04

[Abstract] Prenatal diagnosis refers to the detection and diagnosis of embryonic or fetal developmental state， and whether the fetus is suffering from diseases before birth. Through genetic counseling， disciplines such as modern molecular biology techniques， integrated immune genetics， cytogenetics and molecular genetics are applied. Through maternal examination or direct detection of the embryo （fetus）， the growth and development status of the embryo in the uterus are understood， and whether the fetus has genetic defects and congenital malformations can be diagnosed. In this paper， a variety of prenatal diagnosis methods， the latest technology， existing shortcomings and difficulties， as well as development prospects are reviewed below.

[Key words] Prenatal diagnosis； Fetal cells； Fluorescence in situ hybridization； Spectrometric karyotyping； Fetal free DNA

我國(guó)是出生缺陷的高發(fā)國(guó)，據(jù)統(tǒng)計(jì)，每120～150個(gè)新生兒中就有一個(gè)染色體異常者，每年新增出生缺陷數(shù)約為90萬(wàn)例，染色體病是最為嚴(yán)重的出生缺陷之一[1]。21-三體綜合征、18-三體綜合征、13-三體綜合征這三種是發(fā)病率較高的常染色體病，以非整倍體異常多見(jiàn)。其中21-三體綜合征在新生兒的發(fā)病率最高，約占1.2‰～1.7‰，21-三體和18-三體約占圍生期出生缺陷的0.15%，占圍生期常染色體非整倍體的95%左右[2]。染色體病患者大多伴有嚴(yán)重的智力發(fā)育障礙和嚴(yán)重的某些組織畸形等，且目前尚無(wú)有效的治療措施，因此加強(qiáng)產(chǎn)前診斷以便降低先天缺陷患兒出生率成為學(xué)者們研究的熱點(diǎn)。

1 胎兒非整倍體的產(chǎn)前篩查方法

1.1 孕婦年齡篩查

孕婦妊娠唐氏綜合征胎兒的危險(xiǎn)度與年齡呈正相關(guān)，當(dāng)孕婦年齡超過(guò)30歲后，危險(xiǎn)度隨之升高，尤其是當(dāng)孕婦年齡超過(guò)35歲時(shí)則被列為妊娠唐氏綜合征胎兒的高危人群。不同年齡孕婦妊娠唐氏綜合征胎兒的個(gè)體危險(xiǎn)率可根據(jù)年齡相關(guān)危險(xiǎn)率（age-speciflc risk，ASK）=1/[0.000627+exp（-16.2395+0.286×age）]-1公式進(jìn)行計(jì)算。但是孕婦年齡篩查的陽(yáng)性率不高，約為30%左右，因?yàn)榧s80%的妊娠均發(fā)生在年齡較輕的女性中。但孕婦年齡相關(guān)的危險(xiǎn)度，仍被與多種血清指標(biāo)或超聲聯(lián)合進(jìn)行篩查[3]。

1.2孕婦血清學(xué)篩查方法

應(yīng)用于產(chǎn)前篩查的孕婦血清中的標(biāo)記物從最初的AFP、hCG等已經(jīng)發(fā)展到目前的10多種，并且新的標(biāo)記物在不斷的發(fā)現(xiàn)中[4]。單個(gè)的血清標(biāo)記物作為篩查指標(biāo)時(shí)存在準(zhǔn)確性低，假陰性和假陽(yáng)性的缺點(diǎn)，因此常采用多項(xiàng)指標(biāo)的聯(lián)合篩查，從二聯(lián)、三聯(lián)到六聯(lián)、七聯(lián)不等。臨床上孕中期常使用AFP、β-hCG、μE3的三聯(lián)組合，能夠篩查出65%～75%的Down綜合征胎兒。1997年美國(guó)使用AFP、hCG、CA-125（或Inhibin-A），使陽(yáng)性檢出率提高到90%。還有一些不斷探索中的血清標(biāo)記物，如SP-1、PIGF、SOD、URNAP等[5]。

1.3 超聲篩查

高分辨超聲技術(shù)在產(chǎn)前篩查和產(chǎn)前診斷中應(yīng)用也越來(lái)越廣泛，不僅可以篩查胎兒有無(wú)明顯外在肢體畸形、胎兒神經(jīng)管缺陷外，還可運(yùn)用超聲篩查唐氏綜合征[6]。常用的超聲篩查唐氏綜合征的指標(biāo)有胎兒頸項(xiàng)透明帶厚度（NT）、胎兒雙頂徑與股骨長(zhǎng)度之比、雙頂徑與肱骨長(zhǎng)度之比。超聲測(cè)量胎兒頸項(xiàng)透明帶厚度（異常標(biāo)準(zhǔn)≥3.0 mm）在孕早期篩查唐氏綜合征陽(yáng)性檢出率可達(dá)73%。有研究顯示若將超聲測(cè)量胎兒頸項(xiàng)透明帶厚度、妊娠相關(guān)血漿蛋白A（PAPP-A）、游離β-hCG和孕婦年齡4個(gè)參數(shù)聯(lián)合應(yīng)用，對(duì)孕10～14周唐氏綜合征的檢出率可達(dá)80%。此外，超聲發(fā)現(xiàn)羊水過(guò)多、十二指腸閉鎖、腎盂擴(kuò)張或心臟異常均提示唐氏綜合征的風(fēng)險(xiǎn)升高，且多項(xiàng)指標(biāo)異常提示患兒的風(fēng)險(xiǎn)更大[7]。

2 胎兒非整倍體的產(chǎn)前篩查最新方法

2.1 細(xì)胞遺傳學(xué)產(chǎn)前診斷方法

絨毛組織檢查孕早期絨毛組織檢查常在孕7～9周進(jìn)行，在超聲監(jiān)測(cè)下，從胎盤(pán)邊緣取少量絨毛組織做染色體核型分析，絨毛既可以培養(yǎng)后做也可直接做核型分析，此方法優(yōu)點(diǎn)是將產(chǎn)前診斷的時(shí)間提早到孕早期，缺點(diǎn)是診斷的可靠性不如羊水細(xì)胞，另外引起流產(chǎn)和感染的風(fēng)險(xiǎn)比較高[8]。endprint

羊水穿刺常規(guī)羊膜腔穿刺術(shù)通常在16～20周進(jìn)行，最佳穿刺時(shí)間為18～20周，此時(shí)子宮已出盆腔，羊水量達(dá)250 mL，穿刺不易傷及胎兒，且羊水中有活力的細(xì)胞比例最高，結(jié)果更可靠。缺點(diǎn)是產(chǎn)前診斷的時(shí)間比較晚，同樣是有創(chuàng)的，有引起感染和流產(chǎn)的風(fēng)險(xiǎn)。但羊水穿刺診斷染色體異常的可靠性超過(guò)99%[9]。

臍血細(xì)胞檢查臍血穿刺常在孕早期沒(méi)有做絨毛膜抽吸術(shù)、孕中期沒(méi)有做羊水穿刺，在孕期稍晚時(shí)選用。此法可以直接檢測(cè)胎兒的染色體有無(wú)異常，準(zhǔn)確性高，但是反復(fù)的臍帶穿刺可致穿刺點(diǎn)出血造成胎兒急性貧血，嚴(yán)重者可致胎兒及新生兒死亡[10]。

細(xì)胞遺傳學(xué)檢查，隨著技術(shù)的發(fā)展，安全性較以前有所提高，但仍有出血、感染和流產(chǎn)的風(fēng)險(xiǎn)，作為侵入性的有創(chuàng)檢查手段，對(duì)母親和胎兒的危險(xiǎn)性約為1/500～1/1000，甚至可能造成胎兒的丟失，報(bào)告結(jié)果出來(lái)的時(shí)間比較長(zhǎng)，但是此類(lèi)檢查的精密度和準(zhǔn)確性高，目前仍為產(chǎn)前診斷的金標(biāo)準(zhǔn)[11]。

2.2 分子遺傳學(xué)產(chǎn)前診斷方法

熒光原位雜交（FISH）技術(shù)采用染色體區(qū)帶上特異性的DNA經(jīng)熒光標(biāo)記后作為探針，與分裂期或間期細(xì)胞原位雜交后，通過(guò)熒光顯微鏡來(lái)觀察染色體畸變的技術(shù)[12]。最常采用的13、18、21、X與Y染色體這5個(gè)探針，可篩查出約80%～90%的主要染色體病。FISH技術(shù)不受細(xì)胞周期的影響，間期細(xì)胞即可作為標(biāo)本，因此周期大大縮短，在24～48 h內(nèi)可完成快速診斷。但是FISH技術(shù)檢測(cè)成本較高，也更耗費(fèi)人力，無(wú)法一次性將所有染色體進(jìn)行分析，容易漏檢某些結(jié)構(gòu)性染色體重排。

定量熒光多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（QF-PCR）技術(shù)是將被檢測(cè)的標(biāo)本DNA采用熒光引物PCR方法，擴(kuò)增特異重復(fù)的DNA序列，即短串聯(lián)重復(fù)序列（STRs），應(yīng)用自動(dòng)化DNA測(cè)序儀和基因掃描軟件檢測(cè)額重復(fù)序列長(zhǎng)度得到峰面積值而實(shí)現(xiàn)定量。該技術(shù)近年來(lái)在歐洲的快速產(chǎn)前診斷中應(yīng)用的越來(lái)越廣泛[13]，具有快捷、方便、省時(shí)省力的優(yōu)點(diǎn)，檢測(cè)結(jié)果可在標(biāo)本收集的24～48 h內(nèi)得到，這一點(diǎn)對(duì)于早期妊娠異常的及時(shí)處理極為有利。但該方法檢測(cè)結(jié)果正常仍然不能排除染色體畸形的風(fēng)險(xiǎn)，并且無(wú)法檢測(cè)出染色體嵌合型和易位型[14]。

光譜核型分析技術(shù)（SKY）是應(yīng)用在多個(gè)光譜上有重疊的染色體涂染探針與中期染色體進(jìn)行原位雜交，對(duì)其發(fā)射光譜的所有信息進(jìn)行分析的一項(xiàng)技術(shù)。該技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是可以同時(shí)對(duì)24條染色體分別用不同的探針進(jìn)行涂染，然后在熒光顯微鏡下獲得不同顏色的24條染色體的圖像并進(jìn)行光譜分析[15]。但是該技術(shù)成本昂貴，無(wú)法在臨床大規(guī)模推廣。同時(shí)對(duì)于染色體的微小缺失、重復(fù)及插入依然容易漏診。

2.3孕婦外周血中胎兒有核紅細(xì)胞用于檢測(cè)染色體非整倍體疾病

1960年在孕婦外周血中發(fā)現(xiàn)男胎的細(xì)胞分裂相，提出了母血中可能存在胎兒細(xì)胞的假說(shuō)。隨著在1979年首次從孕婦血中分離出胎兒細(xì)胞，此后的研究主要針對(duì)胎兒的有核紅細(xì)胞的分離，因?yàn)樗鼣y帶了胎兒基因組DNA的全部遺傳信息。但是胎兒細(xì)胞在孕婦外周血中含量非常稀少，且富集技術(shù)價(jià)格昂貴、效率低、靈敏度也不高，在一定程度上限制了它的應(yīng)用和發(fā)展[17]。

2.4 孕婦外周血中胎兒游離DNA在無(wú)創(chuàng)性產(chǎn)前診斷染色體非整倍體疾病

1997年，Lo M等[8]在懷有男胎的孕婦外周血中檢測(cè)出胎兒Y染色體特異性的DNA序列，這對(duì)無(wú)創(chuàng)性產(chǎn)前診斷方法的改進(jìn)產(chǎn)生了巨大的影響。胎兒游離DNA最早可能在懷孕5周后的母血中測(cè)出，母血中胎兒游離DNA可能來(lái)源于進(jìn)入母體的胎兒細(xì)胞受到母體免疫系統(tǒng)的攻擊而發(fā)生溶解后釋放所得，或是胎兒發(fā)育過(guò)程中細(xì)胞凋亡后DNA釋放出來(lái)而進(jìn)入母血中[18]。研究發(fā)現(xiàn)，懷有染色體非整倍體胎兒的孕婦，其外周血中胎兒游離DNA的濃度高于懷有正常胎兒的孕婦，但在孕11～17周，母體的游離DNA占絕大多數(shù)，胎兒的游離DNA含量只占母血漿DNA總含量的3.4%（0.39%～11.9%）左右[19]。如何提取胎兒DNA和減少母源性的DNA的干擾，就需要增加提取的胎兒DNA濃度或抑制母體DNA濃度，減少背景DNA[20]。有研究顯示[21]，母血中胎兒DNA分子一般比母體DNA分子要短，絕大多數(shù)不超過(guò)313bp，而母體的DNA分子長(zhǎng)度一般在1000bp以上。另外，母親與胎兒的DNA的甲基化存在差異性[22]，如18號(hào)染色體上的mapsin基因、3號(hào)染色體上的rassfla基因、21號(hào)染色體上的aire、erg和hlcs基因及DSCR4基因可以區(qū)分母體核酸，排除其干擾。

3 存在的困難和不足

產(chǎn)前診斷是我國(guó)母嬰保健工程的重要組成部分，可以有效降低先天缺陷患兒的出生率。產(chǎn)前基因診斷是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的一個(gè)新分支，與臨床各科室都有密切的聯(lián)系，產(chǎn)前診斷的技術(shù)發(fā)展也是日新月異[23]。目前我國(guó)產(chǎn)前診斷還面臨著一些困難和不足：①缺乏完善的科室配置。目前，除了一些較大的綜合醫(yī)院和專(zhuān)科醫(yī)院外，大部分醫(yī)院都沒(méi)有開(kāi)展產(chǎn)前診斷的實(shí)驗(yàn)室。有的實(shí)驗(yàn)室設(shè)在科研院所，造成了臨床和實(shí)驗(yàn)室難以協(xié)調(diào)。②缺乏合格的專(zhuān)業(yè)人員。產(chǎn)前診斷橫跨很多學(xué)科，涉及的技術(shù)多樣，需要特殊的技術(shù)培訓(xùn)，一般的臨床醫(yī)生很難通過(guò)短期培訓(xùn)達(dá)到預(yù)期目的。③產(chǎn)前診斷是高風(fēng)險(xiǎn)的項(xiàng)目。不同于一般的檢驗(yàn)項(xiàng)目，國(guó)內(nèi)也缺乏相應(yīng)的保護(hù)機(jī)制。④產(chǎn)前診斷的收費(fèi)定價(jià)太低。⑤缺乏資金的支持。產(chǎn)前診斷最主要的任務(wù)是減少出生缺陷，提高全民族素質(zhì)。它是一項(xiàng)科技含量高、投入高的項(xiàng)目，且?guī)в泄嫘缘奶攸c(diǎn)，由于管理部門(mén)對(duì)其重要性認(rèn)識(shí)不足，導(dǎo)致資金投入不足。⑥宣傳教育不足。一方面患者對(duì)產(chǎn)前診斷缺乏了解，仍然有盲目生育的現(xiàn)象，另一方面，許多臨床醫(yī)生缺乏對(duì)產(chǎn)前診斷相關(guān)技術(shù)的了解，不能正確的進(jìn)行遺傳咨詢(xún)。

4 發(fā)展前景

產(chǎn)前診斷的方法眾多，不同的診斷方法各具特點(diǎn)[24]。目前多數(shù)的產(chǎn)前診斷需做侵入性的檢查，對(duì)孕婦和胎兒有一定的創(chuàng)傷和風(fēng)險(xiǎn)。隨著產(chǎn)前診斷技術(shù)的不斷發(fā)展，人們對(duì)產(chǎn)前診斷的認(rèn)識(shí)也在不斷提高，同時(shí)新的診斷技術(shù)也不斷應(yīng)用于臨床。相對(duì)于侵入性的產(chǎn)前診斷技術(shù)，分子遺傳診斷技術(shù)是在基因水平進(jìn)行的[25]，樣本量少、非特異，敏感性高，可在孕早中期進(jìn)行診斷。相信隨著分子生物學(xué)技術(shù)和分子遺傳學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展和創(chuàng)新，高精確度、低成本、省時(shí)省力的檢測(cè)手段在不久的將來(lái)將服務(wù)于臨床。endprint

[參考文獻(xiàn)]

[1] zcan HC，Uur M G，Sucu S，et al. Summary of 2185 prenatal invasive procedures in a single center： A retrospective analysis[J]. Turk J Obstet Gynecol，2017，14（2）：114-120.

[2] Fl？觟ck A，Tu NC，Rüland A，et al. Non-invasive prenatal testing（NIPT）：Europes first multicenter post-market clinical follow-up study validating the quality in clinical routine[J]. Archives of Gynecology & Obstetrics，2017，（2）：1-6.

[3] Vestergaard EM，Singh R，Schelde P，et al.On the road to replacing invasive testing with cell-based NIPT： five clinical cases with aneuploidies，microduplication，unbalanced structural rearrangement or mosaicism[J]. Prenat Diagn，2017，2（8）：1-4.

[4] Yang Y，He P，Li DZ. Clinical outcome of pregnancies with the prenatal double bubble sign-a five-year experience from one single centre in mainland China[J]. J Obstet Gynaecol，2017，1（12）：1-4.

[5] Kornman L，Palma-Dias R，Nisbet D，et al. Non-invasive prenatal testing for sex chromosome aneuploidy in routine clinical practice[J]. Fetal Diagn Ther，2017，20（5）：1128-1132.

[6] Ngan OMY，Yi H，Wong SYS，et al.Obstetric professionals' perceptions of non-invasive prenatal testing for Down syndrome：Clinical usefulness compared with existing tests and ethical implications[J].BMC Pregnancy Childbirth，2017，17（1）：285-289.

[7] Vialard F，Simoni G，Aboura A，et al.Prenatal BACs-on Beads7：a new technology for rapid detection of aneuploidies and microdeletions in prenatal diagnosis[J].Prenat Diagn，2011，31（5）：500-508.

[8] Lo YM，Corbetta N，Chamberlain PF，et al.Presence of fetal DNA in maternal plasma and serum[J]. Lancet，1997，11（3）：485-487.

[9] Shi X，Li L，Huang X，et al.Fetal Aneuploidy：A comparison of dichorionic twins and monochorionic twins[J]. Fetal Diagn Ther，2017，5（60）：82-85.

[10] Zhang L，Zhu Q，Wang H，et al.Count-based size-correction analysis of maternal plasma DNA for improved noninvasive prenatal detection of fetal trisomies 13，18，and 21[J]. Am J Transl Res，2017，9（7）：3469-3473.

[11] Kremer V，Girard F，Gasser B，et a1.Prenatal diagnosis of a 12q22q23.2 interstitial deletion by array CGH in a malformed fetus[J]. Eur J Med Genet，2012，55（10）：269-273.

[12] Hung CC，Lin CH，Lin SY，et al.Prenatal diagnosis of a fetus with a de novo trisomy 12p by array—comparative genomic hybridization（array-CGH）[J]. Gene，2012，495：178-182.

[13] Abdelhedi F，Corcos J，Cuisset L，et al. First reported case of interstitial 15 q15.3-q21.3 deletion diagnosed prenatally and characterized with array CGH in a fetus with an isolated short femur[J]. Am J Med Genet A，2012，158A：617-621.endprint

[14] Gmchy N，Decamp M，Richard N，et al.Array CGH analysis in high-risk pregnancies：Comparing DNA from cultured ceUs and cell-free fetal DNA[J]. Prenat Diagn，2012，32：383-388.

[15] Chen P，Jin C，Shan Q，et al.Application of BACs-on-Beads and karyotyping for the prenatal diagnosis of 1371 pregnant women with a high risk[J]. Zhonghua Yi Xue Yi Chuan Xue Za Zhi，2017，34（4）：542-545.

[16] Opsjn BE，Nordb S A，Vogt C. Unrecognized viral infections and chromosome abnormalities as a cause of fetal death-examination with fluorescence in situ hybridization， immunohistochemistry and polymerase chain reaction[J]. Apmis，2017，125（9）：826.

[17] Basbu D，Basbu A，Gülerman C. Is unexplained elevated maternal serum alpha-fetoprotein still important predictor for adverse pregnancy outcome？[J]. Ginekologia Polska，2017，88（6）：325.

[18] Socolov D，Socolov R，Gorduza VE，et al.Increased nuchal translucency in fetuses with a normal karyotype-diagnosis and management：An observational study [J].Medicine（Baltimore），2017，96（29）：360-368.

[19] 陳熙，熊禮寬.無(wú)創(chuàng)性產(chǎn)前診斷研究進(jìn)展及甲基化技術(shù)的應(yīng)用[J].國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2012，33：1084-1086.

[20] Patel N，Narasimhan E，Kennedy A.Fetal cardiac US：techniques and normal anatomy correlated with adult CT and MR imaging[J]. Radiographics，2017，37（4）：1290-1303.

[21] Liao C，Yin AH，Peng CF，et al.Noninvasive prenatal diagnosis of common aneuploidies by semiconductor sequencing[J]. Proc Natl Acad Sci USA，2014，111（20）：7415-7420.

[22] Suzui I，Masuyama H，Hirano Y，et al.Prenatal diagnosis of umbilical arteriovenous malformation[J]. J Matern Fetal Neonatal Med，2017，30（1）：85-87.

[23] Eris Yalcin S，Akkurt MO，Yavuz A，et al.Prenatal sonographic diagnosis of cephalopagus conjoined twins at 14 weeks of pregnancy[J]. J Clin Ultrasound，2017，24（10）. 553-557.

[24] Jiang YL，Qi QW，Zhou XY，et al.Prenatal diagnosis of 17q12 microdeletion syndrome in fetal renal abnormalities[J]. Zhonghua Fu Chan Ke Za Zhi，2017，52（10）：662- 668.

[25] Dore Reyes M，Triana Junco P，Encinas Hernández JL，et al.Mesenteric edema as a prenatal ultrasound sign of poor prognosis in gastroschisis[J]. Cir Pediatr，2017，30（3）：131- 137.

（收稿日期：2017-11-12）endprint