艾靈，朱彬，王俊忠，陸蒙吉，楊東亮，王寶菊*

(1. 華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院感染性疾病科，武漢 430022； 2. 德國(guó)Duisburg-Essen大學(xué)醫(yī)院病毒研究所，德國(guó)埃森 D-45122)

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染所致的乙型病毒性肝炎是嚴(yán)重影響人民身體健康的傳染性疾病。全世界約有20億人曾感染HBV，其中至少2.4億患者為慢性HBV感染者，每年約有65萬(wàn)人死于HBV感染所致的肝衰竭、肝硬化和原發(fā)性肝細(xì)胞癌。我國(guó)是HBV感染的高發(fā)區(qū)，雖然乙肝疫苗計(jì)劃接種成功地將五歲以下幼兒的HBsAg攜帶率降至1%以下，但HBsAg的整體攜帶率仍高達(dá)7.18%，據(jù)此推算我國(guó)現(xiàn)有的慢性HBV感染者約9300萬(wàn)人，其中慢性乙型肝炎患者約2000萬(wàn)例。雖然慢性乙型肝炎及其引發(fā)的肝衰竭、肝硬化、肝癌問(wèn)題仍十分嚴(yán)重，但因其發(fā)病機(jī)制不明且現(xiàn)有的抗病毒藥物如干擾素和核苷類似物的治療效果不佳，乙型肝炎的防控形勢(shì)仍非常嚴(yán)峻。HBV相關(guān)科研機(jī)構(gòu)及藥物研發(fā)企業(yè)仍在不斷探索以期找到更好的HBV防控藥物或生物制劑，而這些藥物、生物制劑以及一些聯(lián)合治療策略的臨床前評(píng)價(jià)均離不開(kāi)合適的細(xì)胞和動(dòng)物模型。HBV具有嚴(yán)格的種屬特異性，僅能感染人、黑猩猩和樹(shù)鼩，因此與HBV同屬嗜肝DNA病毒家族的土撥鼠肝炎病毒(woodchuck hepatitis virus, WHV)以及鴨乙肝病毒(duck hepatitis B virus, DHBV)感染的土撥鼠和鴨乙肝模型在乙型肝炎相關(guān)研究中應(yīng)用廣泛[1]。本文主要綜述了WHV感染土撥鼠模型的免疫學(xué)特征，以及該模型在抗乙肝病毒藥物評(píng)價(jià)和免疫調(diào)節(jié)治療中的應(yīng)用。

1 土撥鼠/旱獺WHV感染模型

WHV的發(fā)現(xiàn)可追溯到19世紀(jì)80年代，它在美國(guó)費(fèi)城動(dòng)物園患肝癌的東方土撥鼠(以下均簡(jiǎn)稱土撥鼠)中首次被發(fā)現(xiàn)[2]。WHV與HBV同屬嗜肝DNA病毒科正嗜肝DNA病毒屬，兩者基因結(jié)構(gòu)非常相似，并在核酸序列和氨基酸水平上具有高度同源性，其生物學(xué)特性和復(fù)制過(guò)程實(shí)際上是基本相同的[3]。此外土撥鼠WHV感染后的血清學(xué)和病理學(xué)特征類似于人類HBV感染，例如其血清中除檢測(cè)到完整病毒顆粒外，也可檢測(cè)到由WHV表面蛋白組成的桿狀和小球形顆粒[4]。不僅如此，WHV感染土撥鼠后的自然經(jīng)過(guò)也與人感染HBV高度類似。人HBV感染后的結(jié)局與感染時(shí)的年齡明顯相關(guān)，成人感染后僅5% ～10%發(fā)生慢性化，而90%的圍產(chǎn)期感染后發(fā)展為慢性感染。成年土撥鼠WHV感染后慢性化率低于5%，而幼年土撥鼠WHV感染的慢性化率可達(dá)60% ～75%[5]。此外，土撥鼠急性WHV感染被清除后，其肝臟內(nèi)仍能檢出痕量的WHV DNA及殘存的炎癥反應(yīng)，這可能是急性乙肝感染恢復(fù)后仍不能完全避免HCC發(fā)生的原因[6]。

東方土撥鼠(Eastern woodchuck)亦稱美洲土撥鼠(American woodchuck)，是Marmotamonax的俗稱，為松鼠科(Sciuridae)旱獺屬(Marmota)動(dòng)物，亦可譯為美洲旱獺，分布在美洲大陸，引入國(guó)內(nèi)非常困難，特別是WHV感染的土撥鼠，且價(jià)格高昂，在我國(guó)廣泛應(yīng)用存在一定局限性。我國(guó)西北地區(qū)也有旱獺分布，主要有喜馬拉雅旱獺(Marmotahimalayana)、灰旱獺(Marmotabaibacina)和長(zhǎng)尾旱獺(Marmotacaudata)等。我們研究發(fā)現(xiàn)喜馬拉雅旱獺(以下簡(jiǎn)稱旱獺)對(duì)WHV高度易感，WHV感染后第2～4周血清中檢出WHsAg、WHV DNA，第4～6周檢出WHcAb，在第10周處死動(dòng)物采集肝組織樣本，在肝內(nèi)檢出HBV復(fù)制中間體、WHsAg和WHcAg，其感染經(jīng)過(guò)和成年土撥鼠WHV感染過(guò)程非常相似[7]。應(yīng)用RNA-seq技術(shù)，我們比較了土撥鼠和旱獺轉(zhuǎn)錄序列同源性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)74%的序列同源性高達(dá)90% ～100%，9.9%的序列同源性高達(dá)80% ～90%，7.67%的序列同源性高達(dá)60% ～70%，提示二者轉(zhuǎn)錄組序列高度同源[8]。因此在下文中我們將東方土撥鼠模型和喜馬拉雅旱獺模型統(tǒng)稱為土撥鼠模型。

2 土撥鼠WHV感染后的免疫學(xué)特征

越來(lái)越多的研究表明抗病毒藥物聯(lián)合免疫調(diào)節(jié)治療是實(shí)現(xiàn)慢性乙肝臨床治愈最有可能的方案。要將土撥鼠WHV感染模型用于免疫調(diào)節(jié)治療研究需首先建立土撥鼠免疫學(xué)研究手段，以便對(duì)該模型WHV感染后的免疫學(xué)特征進(jìn)行研究。近年來(lái)，多種土撥鼠天然免疫、獲得性免疫分子被克隆，病毒特異性T細(xì)胞應(yīng)答檢測(cè)方法的建立，大大促進(jìn)了土撥鼠模型在乙肝免疫發(fā)病機(jī)制研究中的應(yīng)用。

2.1 模式識(shí)別受體

模式識(shí)別受體(pattern recognition receptors，PRR)是病毒感染啟動(dòng)天然免疫并介導(dǎo)獲得性免疫的重要分子。目前多種土撥鼠PRR已被成功克隆和進(jìn)行功能分析，包括Toll樣受體(toll-like receptor, TLR)2、TLR3、TLR4、TLR7、TLR8、TLR9、干擾素γ誘導(dǎo)蛋白16(gamma-interferon-inducible protein 16, IFI16)、AIM-2(absent in melanoma 2)和維甲酸誘導(dǎo)基因I(retinoic acid-inducible gene I, RIG-I)。我們的研究發(fā)現(xiàn)TLR2的配體可激活NF-κB、PI3K/Akt和部分MAPK信號(hào)通路，誘導(dǎo)肝細(xì)胞產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子。TLR2配體刺激誘導(dǎo)的天然免疫應(yīng)答可降低HepG2.2.15細(xì)胞中HBV與土撥鼠原代肝細(xì)胞中WHV的病毒復(fù)制和基因表達(dá)水平。土撥鼠WHV慢性感染時(shí)，外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)和肝組織中TLR2的表達(dá)水平相對(duì)較低，而急性感染或恩替卡韋經(jīng)治的慢性感染土撥鼠，其PBMC中TLR2表達(dá)水平與WHV DNA滴度呈負(fù)相關(guān)[9]。上述研究提示肝細(xì)胞在嗜肝DNA病毒感染TLR2介導(dǎo)的抗病毒應(yīng)答中發(fā)揮重要作用，TLR2信號(hào)在急慢性WHV感染時(shí)的差異或許對(duì)慢性乙肝的免疫治療有參考價(jià)值。我們的研究也發(fā)現(xiàn)土撥鼠IFI16和AIM2在DNA介導(dǎo)的IFN-β和IL-1β的誘導(dǎo)中可能分別起關(guān)鍵作用；IFI16和AIM2轉(zhuǎn)錄物在急性WHV感染后肝臟和脾臟中上調(diào)，而IFI16在慢性感染后肝臟中下調(diào)，IFI16的配體VACV ds 70 mer體內(nèi)轉(zhuǎn)染導(dǎo)致IFI16和IFN-β的上調(diào)，提示IFI16有可能作為HBV治療的新靶標(biāo)[10]。

2.2 細(xì)胞因子及其受體

α干擾素(interferon α, IFN-α)被廣泛用于慢性乙肝的抗病毒治療，然而其應(yīng)答率不高。近年來(lái)，關(guān)于土撥鼠IFN-α的認(rèn)識(shí)越來(lái)越深入。有兩種亞型的土撥鼠IFN-α最早被發(fā)現(xiàn)，通過(guò)腺病毒載體將IFN-α基因?qū)雭?lái)自WHV慢性感染土撥鼠的原代肝細(xì)胞內(nèi)，可使肝細(xì)胞內(nèi)WHsAg呈劑量依賴性降低[11]。隨后10個(gè)亞型的土撥鼠IFN-α和8個(gè)亞型的旱獺IFN-α被發(fā)現(xiàn)，二者具有非常高的同源性[12-13]。在Poly(I:C)刺激下，未感染W(wǎng)HV的土撥鼠PBMC可產(chǎn)生1、4、5型IFN-α，提示土撥鼠IFN-α亞型在PBMC呈選擇性表達(dá)；而慢性WHV感染土撥鼠PBMC的IFN-α產(chǎn)量減少，提示慢性HBV感染者的IFN應(yīng)答受損。土撥鼠和旱獺1型干擾素受體(IFNAR1/2)序列已成功鑒定[14]。在IFNα/γ的刺激下，土撥鼠原代肝細(xì)胞IFNAR2的表達(dá)水平顯著升高，而慢性感染時(shí)IFNAR1和IFNAR2的表達(dá)水平則降低[15]。用重組的土撥鼠IFN-α治療慢性WHV感染土撥鼠15周后，通過(guò)RNA-seq 檢測(cè)肝內(nèi)轉(zhuǎn)錄組學(xué)的改變，結(jié)果IFN-α誘導(dǎo)的抗病毒效應(yīng)與肝內(nèi)IFN刺激基因的表達(dá)沒(méi)有明顯相關(guān)性，而與肝內(nèi)NK/T細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄標(biāo)志相關(guān)，提示IFN-α誘導(dǎo)的抗病毒效應(yīng)更多地與NK/T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞殺傷效應(yīng)和非細(xì)胞殺傷效應(yīng)相關(guān)[16]。

白介素10(interleukin 10, IL-10)是一種重要負(fù)向免疫調(diào)節(jié)分子，通過(guò)與其受體(IL-10R)結(jié)合發(fā)揮免疫抑制功效。土撥鼠的IL-10R已被克隆，并制備了其特異性多抗，該抗體能在體外使來(lái)自慢性WHV感染土撥鼠的病毒特異性T細(xì)胞的增殖和脫顆粒功能明顯增強(qiáng)[17]。

白介素12(interleukin 12, IL-12)在誘導(dǎo)抗病毒細(xì)胞免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用。研究表明肝內(nèi)注射攜帶IL-12基因的腺病毒載體，僅能在低病毒載量的慢性WHV感染土撥鼠中發(fā)揮很好的抗病毒效應(yīng)[18]。在高病毒載量動(dòng)物體內(nèi)不能很好地發(fā)揮抗病毒效應(yīng)可能與TGF-β和Treg有關(guān)，在體外阻斷TGF-β和敲除Treg能恢復(fù)T細(xì)胞對(duì)IL-12的應(yīng)答，然而在體內(nèi)聯(lián)合TGF-β抑制性多肽和敲除Treg仍不能發(fā)揮很好的抗病毒效應(yīng)[19]。

白介素15(interleukin 15, IL-15)在天然和獲得性免疫自穩(wěn)中發(fā)揮重要功能。我們克隆了土撥鼠和旱獺IL-15分子，并發(fā)現(xiàn)重組的IL-15蛋白能增強(qiáng)活化的小鼠脾細(xì)胞及土撥鼠PBMC增殖功能，慢性WHV感染土撥鼠肝臟內(nèi)IL-15的表達(dá)輕度上調(diào)[20]。

2.3 T細(xì)胞應(yīng)答

已有研究表明，病毒特異性的T細(xì)胞應(yīng)答在HBV清除中發(fā)揮重要作用。T細(xì)胞表面標(biāo)志是區(qū)分T細(xì)胞亞群的先決條件，且在T細(xì)胞功能分析中不可或缺。土撥鼠CD4、CD28、CTLA-4、PD-1、PD-L1、PD-L2、Tim-3、Galectin-9等T細(xì)胞表面標(biāo)志均已克隆鑒定[21-26]。我們制備的抗土撥鼠CD4單克隆抗體(G2)在體外能有效抑制ConA誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞增殖，在健康土撥鼠體內(nèi)能清除60% CD4+T細(xì)胞，余下的CD4+T細(xì)胞仍能保持對(duì)ConA刺激的反應(yīng)性[23]。土撥鼠慢性WHV感染時(shí)CD8+T細(xì)胞上PD-1的表達(dá)水平明顯升高，且與WHV病毒載量呈正相關(guān)；恩替卡韋治療時(shí)，隨著病毒載量的下降，CD8+T細(xì)胞上PD-1表達(dá)水平隨之下降[25]。急慢性WHV感染時(shí)PBMC上PD-L1的表達(dá)均明顯上調(diào)，體外阻斷PD-L1 和PD-L2 能部分上調(diào)WHV感染土撥鼠PBMC的增殖和脫顆粒功能[26]。

檢測(cè)病毒特異性T細(xì)胞功能是將土撥鼠模型用于免疫發(fā)病機(jī)制和免疫調(diào)節(jié)治療的先決條件。最早建立的土撥鼠T細(xì)胞功能檢測(cè)方法是基于同位素氚[3H]標(biāo)記的腺嘌呤的淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)，使用WHV抗原刺激土撥鼠PBMC后用液體閃爍計(jì)數(shù)儀檢測(cè)被細(xì)胞攝取的氚[3H]標(biāo)記的腺嘌呤數(shù)量。應(yīng)用上述方法，Menne等[27]發(fā)現(xiàn)WHV感染3周即可檢出強(qiáng)烈的針對(duì)WHsAg、WHcAg以及WHcAg 97-110aa多肽的T細(xì)胞應(yīng)答，并在病毒清除期達(dá)到高峰。病毒清除1年后，病毒特異性T細(xì)胞應(yīng)答僅能在WHV再次接種后檢出。新生土撥鼠接種WHV后，清除WHV的個(gè)體在急性期即可檢出強(qiáng)烈且多特異性的病毒特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答，而WHV持續(xù)感染的個(gè)體則缺如或應(yīng)答不足[28]。隨著流式細(xì)胞術(shù)的發(fā)展，基于羧基熒光素二乙酸酯琥珀酰亞胺酯(carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester, CFSE)的土撥鼠淋巴細(xì)胞增殖流式分析方法隨后也被建立[29]。CD107a可以作為細(xì)胞毒性T細(xì)胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)脫顆粒的標(biāo)志，可被用于檢測(cè)抗原特異性的CTL應(yīng)答[30]。應(yīng)用建立的CD107a脫顆粒流式細(xì)胞技術(shù)，F(xiàn)rank等[31]發(fā)現(xiàn)：急性WHV感染的土撥鼠PBMC，用WHcAg 96-110aa多肽刺激后，從病毒復(fù)制的高峰期至感染后15周均能檢出強(qiáng)烈的CTL應(yīng)答；而慢性WHV感染土撥鼠則不能檢出病毒特異性CTL應(yīng)答。上述研究結(jié)果均與在人HBV感染及黑猩猩HBV感染中的T細(xì)胞應(yīng)答高度近似。

3 土撥鼠WHV感染模型在抗病毒藥物評(píng)價(jià)中的應(yīng)用

目前臨床上使用的核苷類似物包括拉米夫定(lamivudine, LAM)、阿德福韋酯(adefovir, ADV)、恩替卡韋和替諾福韋(tenofovir, TDF)均在土撥鼠模型進(jìn)行了評(píng)價(jià)。以替諾福韋為例，土撥鼠分別按每日0.5、1.5或5.0 mg/kg的劑量用替諾福韋處理4周，血清WHV DNA水平均顯著降低，但血清WHcAb和WHsAb、肝內(nèi)WHV RNA無(wú)顯著變化[32]。其中部分動(dòng)物血清中WHsAg、肝內(nèi)WHV復(fù)制中間體和肝內(nèi)WHV抗原表達(dá)也出現(xiàn)一過(guò)性降低[32]。聯(lián)合抗病毒治療是HIV感染的標(biāo)準(zhǔn)治療方案，聯(lián)合抗病毒治療能否在HBV治療中取得更好的治療效果及其安全性在TDF上市之初就在土撥鼠模型中進(jìn)行了評(píng)價(jià)。該研究發(fā)現(xiàn)ADV和LAM聯(lián)用、TDF和恩曲他濱(emdtricitabine, FTC)聯(lián)用24周，能顯著降低土撥鼠WHV病毒血癥水平，上述四種藥物單獨(dú)和聯(lián)用48周均未見(jiàn)明顯的生理、生化及血液學(xué)異常[33]。為驗(yàn)證新藥在土撥鼠模型抗WHV療效能否預(yù)測(cè)該藥在慢性乙肝患者中抗HBV的療效，研究者在LAM上市之初就進(jìn)行了下面的研究。四種當(dāng)時(shí)已在臨床上使用的抗病毒藥物阿糖腺苷、病毒唑、LAM和泛昔洛韋在土撥鼠模型中抗WHV的療效與慢性乙肝患者抗HBV臨床研究中的療效類似，均可降低WHV病毒血癥和肝內(nèi)WHV DNA復(fù)制水平[34]。和慢性乙肝患者的臨床研究結(jié)果類似，齊多夫定對(duì)WHV的復(fù)制無(wú)影響。這進(jìn)一步說(shuō)明WHV慢性感染的土撥鼠模型可以作為慢乙肝抗病毒治療藥物的精準(zhǔn)研究模型。

除核苷類似物外，土撥鼠模型最近也被用于TLR7刺激劑GS-9620的臨床前研究[35]。研究發(fā)現(xiàn)GS-9620可快速、顯著且持續(xù)降低土撥鼠血清WHV DNA、肝內(nèi)WHV DNA復(fù)制中間體、肝內(nèi)WHV cccDNA和WHV RNA水平，使血清WHsAg水平低于檢測(cè)下限。GS-9620還可誘導(dǎo)部分土撥鼠對(duì)WHsAg產(chǎn)生持續(xù)的抗體應(yīng)答，在持續(xù)低病毒載量的土撥鼠中顯著降低肝癌的發(fā)生率[35]。上述研究提示TLR7激動(dòng)劑GS-9620的短期使用可誘導(dǎo)WHV慢性感染的土撥鼠產(chǎn)生持續(xù)的抗病毒應(yīng)答，有可能在慢性乙肝患者中實(shí)現(xiàn)功能性治愈。

雖然土撥鼠模型在核苷類似物及TLR7激動(dòng)劑中的研究結(jié)果能夠很好地預(yù)測(cè)這些藥物在慢性乙肝患者中的抗HBV療效，然而最近的研究也有不同發(fā)現(xiàn)。核酸聚合物(nucleic acid polymers, NAP)被發(fā)現(xiàn)可阻斷HBV感染肝細(xì)胞中HBsAg的釋放。NAP可清除DHBV感染時(shí)的血清DHBsAg，并顯著降低甚至清除人HBV慢性感染或HBV/HDV重疊感染時(shí)的HBsAg。雖然在土撥鼠和小鼠肝內(nèi)均能檢出兩種NAP REP 2139和REP 2055的聚集，然而上述兩種NAP在WHV感染土撥鼠、HBV感染SCID-Hu小鼠及HBV轉(zhuǎn)基因小鼠中均未能檢出很好的抗WHV或抗HBV效應(yīng)。推測(cè)可能是嚙齒類動(dòng)物肝細(xì)胞中表面抗原顆粒的裝配及分泌不同于人HBV和鴨DHBV[36]。

4 土撥鼠WHV感染模型在免疫調(diào)節(jié)治療中的應(yīng)用

病毒特異性的T細(xì)胞應(yīng)答在HBV清除中發(fā)揮重要作用，其功能缺失是HBV感染持續(xù)的根本原因。核苷類似物治療只能暫時(shí)恢復(fù)HBV特異性的CTL功能[37]。與此類似，土撥鼠WHV慢性感染時(shí)，恩替卡韋治療也只能誘導(dǎo)短期的CTL應(yīng)答[25]。因此抗病毒治療聯(lián)合免疫調(diào)節(jié)治療可能是實(shí)現(xiàn)慢性乙肝臨床治愈最有可能的方案。

表達(dá)WHV核心抗原的DNA疫苗初次免疫和腺病毒疫苗增強(qiáng)免疫在小鼠和土撥鼠中均能誘導(dǎo)強(qiáng)烈的CD8+T細(xì)胞應(yīng)答。將其與恩替卡韋聯(lián)合使用后，可使WHV慢性感染的土撥鼠產(chǎn)生WHsAg 和WHcAg特異性CD4+和CD8+T細(xì)胞應(yīng)答，且持久抑制WHV復(fù)制，維持低水平WHsAg。其中4只土撥鼠中有兩只在恩替卡韋停藥后仍維持WHsAg的血清學(xué)轉(zhuǎn)換[38]。上述研究結(jié)果提示抗病毒治療聯(lián)合DNA疫苗初次免疫-腺病毒疫苗增強(qiáng)免疫的新方案有可能成為慢性乙肝治療的新方案。

乙肝疫苗需冷鏈保存，在偏遠(yuǎn)農(nóng)村地區(qū)的普及難度較大，且乙肝疫苗仍存在血源性病原感染的風(fēng)險(xiǎn)。最近我們也在土撥鼠模型中評(píng)價(jià)了抗病毒藥物聯(lián)合疫苗免疫在HBV暴露后預(yù)防中的價(jià)值。我們發(fā)現(xiàn)恩替卡韋單藥或聯(lián)用DNA疫苗，可使土撥鼠在大劑量WHV接種后不出現(xiàn)病毒血癥，部分或全部動(dòng)物產(chǎn)生了保護(hù)性免疫可以抵抗WHV的再次感染[39]?；谏鲜鲅芯?，我們提出核苷類似物單獨(dú)使用或聯(lián)合乙肝疫苗可能是HBV暴露后預(yù)防的替代方案，特別是對(duì)發(fā)展中國(guó)家的偏遠(yuǎn)農(nóng)村地區(qū)居民、乙肝疫苗無(wú)應(yīng)答者的職業(yè)或非職業(yè)HBV暴露后預(yù)防將大有裨益。

AIC649可直接作用于宿主免疫防御系統(tǒng)的抗原提呈細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的釋放和活化T細(xì)胞的應(yīng)答。AIC649對(duì)HBV轉(zhuǎn)基因小鼠可產(chǎn)生等同于替諾福韋的抗病毒效應(yīng)。有趣的是AIC649治療在WHV慢性感染的土撥鼠產(chǎn)生雙向治療應(yīng)答，WHV DNA和WHsAg在治療初期升高，隨后則顯著降低直至治療結(jié)束后，這可能與AIC649重建WHV特異性免疫應(yīng)答相關(guān)[40]。

慢性病毒感染中PD-1/PD-L1的相互作用對(duì)T細(xì)胞功能耗竭至關(guān)重要，阻斷PD-1/PD-L1的相互作用可部分恢復(fù)T細(xì)胞功能。慢性乙肝患者和慢性WHV感染土撥鼠中病毒特異性T細(xì)胞上的PD-1表達(dá)上調(diào)，體外阻斷PD-1/PD-L1的相互作用可部分恢復(fù)T細(xì)胞功能。無(wú)論在慢性乙肝患者還是WHV慢性感染的土撥鼠，恩替卡韋治療均能降低PD-1的表達(dá)。因此抗病毒藥物聯(lián)合PD-1/PD-L1阻斷有可能較單用抗病毒藥物獲得更好的療效。最近的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)：在自然感染所致的WHV慢性感染土撥鼠中，PD-L1抗體和恩替卡韋聯(lián)用比恩替卡韋單藥治療能更好地實(shí)現(xiàn)病毒血癥和WHsAg的控制，然而僅在少數(shù)土撥鼠中實(shí)現(xiàn)上述療效[41]。我們最近還測(cè)試了抗病毒藥物、DNA疫苗聯(lián)合PD-1/PD-L1阻斷的聯(lián)合免疫治療策略。我們發(fā)現(xiàn)PD-1抗體、DNA疫苗聯(lián)合恩替卡韋，可協(xié)同增強(qiáng)病毒特異性T細(xì)胞的功能，誘導(dǎo)部分土撥鼠實(shí)現(xiàn)病毒清除和WHsAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換[25]。這些研究結(jié)果為慢性乙肝的免疫調(diào)節(jié)治療策略設(shè)計(jì)提供了新的可能。

總之，由于WHV和HBV在基因組結(jié)構(gòu)、生物學(xué)特性、復(fù)制周期、感染后的自然經(jīng)過(guò)及免疫學(xué)特征均與HBV高度近似，因而土撥鼠WHV感染模型在抗病毒藥物評(píng)價(jià)方面有較高的應(yīng)用價(jià)值，且已被廣泛應(yīng)用。隨著該模型免疫學(xué)特征的闡明及免疫學(xué)檢測(cè)方法的完善，其在免疫調(diào)節(jié)治療策略及聯(lián)合治療策略評(píng)估中的應(yīng)用價(jià)值也大大提高。得益于深度測(cè)序技術(shù)的進(jìn)展，隨著土撥鼠模型轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)的逐步豐富，該模型在生物醫(yī)藥中的應(yīng)用也將進(jìn)一步拓寬。然而，仍需注意到嚙齒動(dòng)物和人、WHV和HBV尚存在一定的差異，因此在評(píng)價(jià)來(lái)自土撥鼠模型的研究結(jié)果時(shí)仍需謹(jǐn)慎。