方廣，黃韌

(1. 廣東醫(yī)科大學(xué)，廣東湛江 524045； 2. 廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物監(jiān)測所，廣州 510663)

近年來，腫瘤治療領(lǐng)域中，免疫治療越來越受到重視，并且研究成果顯著[1]。眾所周知，免疫系統(tǒng)分為兩種，特異性免疫和非特異性免疫，又可稱為獲得性免疫和固有免疫。目前研究主要針對(duì)特異性免疫中的后天獲得性T細(xì)胞展開[2]，研究發(fā)現(xiàn)T細(xì)胞是主要的抗腫瘤效應(yīng)細(xì)胞。除此之外，固有免疫也發(fā)揮著重要作用，尤其是天然殺傷細(xì)胞(natural killer cell， NK cell)具有強(qiáng)大的細(xì)胞毒性，在腫瘤先天免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用，可以殺死初始腫瘤細(xì)胞和減少腫瘤轉(zhuǎn)移，釋放影響固有和獲得性免疫應(yīng)答的可溶性因子[3-5]。由此可見，NK細(xì)胞不僅自身能發(fā)揮抗腫瘤作用，同時(shí)還可以聯(lián)系固有免疫和獲得性免疫。美國食品藥品監(jiān)督管理局(Food and Drug Administration，F(xiàn)DA)批準(zhǔn)了可促進(jìn)T細(xì)胞浸潤的抗PD-1和抗CTLA-4(anti-PD-1 and anti-CTLA-4)藥物制劑，但有部分報(bào)道指出部分NK細(xì)胞中具有類似于T細(xì)胞的PD-1/PDL-1免疫逃避機(jī)制[6-7]。比如，霍奇金淋巴瘤中的NK細(xì)細(xì)[8]。這部分報(bào)道指出在免疫檢查點(diǎn)阻滯療法中，NK細(xì)胞是潛在的治療靶點(diǎn)；并且，優(yōu)于獲得性免疫的是這部分固有免疫特性是先天獲得的，不僅可以遺傳，而且還可以同種異體間傳遞；在自身發(fā)揮殺瘤作用的同時(shí)還參與到獲得性免疫的啟動(dòng)和調(diào)節(jié)。以上種種均表明了NK細(xì)胞在抗腫瘤的地位不可小覷。

1 NK細(xì)胞抗腫瘤研究進(jìn)程

近期的一項(xiàng)報(bào)道指出在行為活躍程度較高的肺癌荷瘤小鼠中，腫瘤生長明顯受到抑制，其可能的原因在于活躍程度較高的小鼠具有較高的NK細(xì)胞殺傷活性[9]。其實(shí)，對(duì)于NK細(xì)胞作為癌癥先天效應(yīng)物的潛力，可以通過將體外擴(kuò)增和活化的NK細(xì)胞過繼轉(zhuǎn)移于免疫缺陷小鼠中進(jìn)行研究。人NK細(xì)胞過繼性免疫治療的小鼠模型可顯示NK介導(dǎo)對(duì)移植人類腫瘤的排斥反應(yīng)，并且可進(jìn)一步使用細(xì)胞因子如IL-2和IL-15大大提高了NK細(xì)胞量及其對(duì)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用。這些最初在小鼠體內(nèi)進(jìn)行的研究為20世紀(jì)80年代開始的自體NK細(xì)胞輸注治療奠定了基礎(chǔ)[10]。為了進(jìn)一步確證NK細(xì)胞的作用，研究人員開始體外分析NK細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的毒性作用。主要采用檢測NK細(xì)胞活性的間接方式，以及檢測NK細(xì)胞釋放物或死亡靶細(xì)胞內(nèi)所吸收或保留物質(zhì)的直接方式[11]。目前，這些體外實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)NK細(xì)胞對(duì)不同腫瘤細(xì)胞存在不同程度的殺傷作用。如一項(xiàng)研究通過使用了具有單一殺傷細(xì)胞抑制性受體(killer cell inlaibitory receptors，KIR)特異性的NK細(xì)胞系作用于人類白細(xì)胞抗原I型(human leukocyte antigen class I，HLAI)，結(jié)果表明NK細(xì)胞可殺傷原發(fā)性急性髓細(xì)胞白血病(acute myeloid leukemia，AML)髓母細(xì)胞，這項(xiàng)研究不僅證明了NK細(xì)胞可以識(shí)別原發(fā)性AML原始細(xì)胞，還指示出KIR配體失配在腫瘤細(xì)胞殺傷中的有益作用[12]。此外，亦有報(bào)道指出NK細(xì)胞可以介導(dǎo)殺傷一定數(shù)量的新鮮分離的人類部分腫瘤細(xì)胞，包括胃癌，卵巢癌，結(jié)腸癌和腎細(xì)胞癌[13]，這部分文獻(xiàn)提出了同種異體反應(yīng)性NK細(xì)胞針對(duì)實(shí)體瘤的可能性。而在近幾年的研究中，為了提高效率并減少副作用，研究人員往往采用的方式是針對(duì)腫瘤抗原，令NK細(xì)胞表達(dá)嵌合抗原受體。比如人源化小鼠中具靶向性NK細(xì)胞的臨床前評(píng)估開展的B系急性淋巴細(xì)胞白血病的臨床試驗(yàn)[14]。事實(shí)上，腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cell，CSC)正在成為實(shí)現(xiàn)腫瘤治愈的關(guān)鍵因素，因?yàn)槟壳暗闹委煼椒梢韵[瘤細(xì)胞的大部分，但耐藥性CSC持續(xù)存在會(huì)導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)[15]。而應(yīng)激誘導(dǎo)抗原的上調(diào)以及NK細(xì)胞的靶向非增殖細(xì)胞的能力表明NK細(xì)胞可以有效地消除CSC。比如在胰腺癌荷瘤NSG小鼠中的研究證明活化轉(zhuǎn)移的NK細(xì)胞可以減少瘤內(nèi)CSC的數(shù)量，進(jìn)而抑制腫瘤生長[16-17]。

另一方面，通過建立小動(dòng)物模型來研究免疫細(xì)胞和人類腫瘤之間復(fù)雜作用的研究已經(jīng)非常普遍，這部分的研究亦證實(shí)了NK細(xì)胞的抗腫瘤作用。運(yùn)用正常免疫活性小鼠品系作為人類腫瘤的宿主一般無法成瘤，這是因?yàn)樗鼈儗?duì)人類腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生異種免疫應(yīng)答，導(dǎo)致腫瘤移植失敗。針對(duì)此種情況，當(dāng)前已經(jīng)開發(fā)了幾種可用于異種腫瘤移植的免疫缺陷小鼠模型，并且因?yàn)樗鼈兛梢蕴峁﹦?dòng)物中人類腫瘤的病理生理學(xué)信息而引起高度關(guān)注。第一種用于異種移植的免疫缺陷小鼠是T-細(xì)胞缺陷的無胸腺裸鼠(Foxn1)[18]，其缺點(diǎn)是因?yàn)榫邆渫暾捏w液獲得性免疫系統(tǒng)和高活性的小鼠NK細(xì)胞，基本喪失了人類正?；驉盒栽煅?xì)胞植入的資格[19]。繼而研發(fā)了自發(fā)突變小鼠B.C17-SCID，其可以阻止T和B細(xì)胞的發(fā)育，與裸鼠相比可以更易于接受人類實(shí)體瘤植入[20- 21]。然而有報(bào)道指出該小鼠存在人骨髓細(xì)胞低植入現(xiàn)象[22]，認(rèn)為其可能是因缺乏獲得性免疫而產(chǎn)生一種補(bǔ)償機(jī)制，從而增強(qiáng)了NK細(xì)胞的活性。所以需要更有效的模型。進(jìn)一步將C.B17-scid小鼠的Prdkcscid突變基因?qū)隢OD近交系品系中，所構(gòu)建的NOD-scid小鼠減弱了宿主對(duì)腫瘤和造血系統(tǒng)異種移植物的排斥反應(yīng)，并且在先天免疫中存在幾種損傷[23]。盡管NOD-scid小鼠支持大量實(shí)體瘤和血液惡性腫瘤的生長，但由于剩余的NK細(xì)胞活性和其他殘留的先天免疫功能，部分腫瘤仍無法植入或有效生長[24-25]。目前在NOD-scid小鼠基礎(chǔ)上運(yùn)用基因工程敲除白細(xì)胞介素2受體(IL2rg)γ鏈所構(gòu)建的NOD-scid IL2Rgnull(NSG)，是迄今為止免疫缺陷程度最嚴(yán)重的小鼠。由于IL2rg敲除可阻斷IL-15信號(hào)傳導(dǎo)途徑，導(dǎo)致缺乏功能性NK細(xì)胞，這是支持各種惡性腫瘤生長的關(guān)鍵特征[26]。

2 NK細(xì)胞的抗腫瘤機(jī)制

2.1 識(shí)別機(jī)制

“喪失自我”假說(“missing-self” hypothesis)：一開始是因?yàn)橛^察到NK細(xì)胞可以直接作用于主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex class I，MHCI)缺失的腫瘤[27]。后來在鼠和人體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)NK細(xì)胞毒性與靶細(xì)胞上MHCI類分子表達(dá)缺失直接相關(guān)[28-29]。NK細(xì)胞可以通過KIR、C型凝集素超家族抑制性受體(CD94/NKG2A)和白細(xì)胞抑制性受體(leucocyte inhibitory receptors，LIR)來區(qū)分正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞。NK細(xì)胞的這部分受體與正常細(xì)胞的MHCI類分子結(jié)合后可以抑制NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用，防止了殺傷正常細(xì)胞。而在初生腫瘤中，腫瘤細(xì)胞通常會(huì)下調(diào)或失去MHCI類分子的表達(dá)[30]，進(jìn)而被NK細(xì)胞所清除。同時(shí)在腫瘤環(huán)境中大量的細(xì)胞因子和趨化因子也可以激活NK細(xì)胞，進(jìn)而發(fā)揮作用[31]。

2.2 殺瘤機(jī)制

NK細(xì)胞可以通過多種機(jī)制發(fā)揮細(xì)胞毒性作用，其中最重要的是抗體依賴性細(xì)胞毒性(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC)。在針對(duì)實(shí)體瘤和血液惡性腫瘤的許多單克隆抗體療法中，ADCC發(fā)揮了重要的抗腫瘤作用。由NK細(xì)胞表達(dá)的Fc受體(FcγRIII或CD16)與腫瘤表面上的腫瘤相關(guān)抗原(tumor-associated antigen，TAA)結(jié)合[32]，這一特性因無需預(yù)先致敏而有區(qū)別于獲得性免疫細(xì)胞。研究表明ADCC參與調(diào)控免疫細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)和獲得性免疫應(yīng)答的多個(gè)過程[33]。當(dāng)NK細(xì)胞與其靶細(xì)胞形成免疫突觸時(shí)，便會(huì)通過穿孔素和顆粒酶介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[34-35]：NK細(xì)胞釋放預(yù)形成的細(xì)胞質(zhì)顆粒，其類似于分泌型溶酶體并含有穿孔素和顆粒酶。穿孔素可以破壞蛋白，穿透靶細(xì)胞的細(xì)胞膜，而屬于絲氨酸蛋白酶家族的顆粒酶則可以觸發(fā)細(xì)胞凋亡程序。激活后，NK細(xì)胞迅速極化顆粒并將微管組織中心重新定位到與靶細(xì)胞突觸。顆粒膜隨后與質(zhì)膜融合，外化并釋放細(xì)胞毒性顆粒內(nèi)容物，引發(fā)靶細(xì)胞凋亡[36]。該細(xì)胞毒性途徑有依賴于腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)受體超家族成員在的靶細(xì)胞表達(dá)。誘導(dǎo)凋亡的主要是兩種TNF受體，F(xiàn)as(CD95)和TNF相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體(TNF-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL)。而在活化的NK細(xì)胞和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic T lymphocytes，CTLs)中表達(dá)Fas配體(FasL)和TRAIL分子，這些配體結(jié)合靶細(xì)胞上的死亡受體，通過半胱天冬酶啟動(dòng)酶促級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致凋亡[37-38]。此外，活化的NK細(xì)胞也產(chǎn)生干擾素IFN-γ可間接促成靶細(xì)胞死亡[39-40]。 原因在于IFN-γ是一種II型干擾素，可激活樹突細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，并對(duì)獲得性免疫應(yīng)答具有多效性作用[38]。IFN-γ有助于激活腫瘤微環(huán)境中的固有免疫和獲得性免疫細(xì)胞，并產(chǎn)生持續(xù)的抗腫瘤免疫應(yīng)答[41]。

3 靶向腫瘤的NK細(xì)胞治療

3.1 臨床NK細(xì)胞療法方式

在將NK細(xì)胞輸注進(jìn)入患者體內(nèi)之前，可以通過體外短期暴露將NK細(xì)胞激活。為了獲得臨床上足夠量的NK細(xì)胞，需要它們在體外長期培養(yǎng)擴(kuò)增。然而，體外培養(yǎng)擴(kuò)增可能會(huì)導(dǎo)致潛在的表型發(fā)生變化，進(jìn)而導(dǎo)致其選擇性擴(kuò)增，降低細(xì)胞毒性殺傷作用。但是，這部分擔(dān)憂可以通過技術(shù)改進(jìn)來消除，以獲得具有體內(nèi)抗腫瘤功效的臨床相關(guān)NK細(xì)胞。以下幾個(gè)因素影響NK細(xì)胞的臨床效力：①NK細(xì)胞的來源：外周血單核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)、臍帶血(umbilical cord blood，UCB)，細(xì)胞系，人胚胎干細(xì)胞(human embryonic stem cells，HESC)誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells， iPSCs)[42]；②用于刺激的細(xì)胞因子的類型；③細(xì)胞培養(yǎng)和條件的培養(yǎng)基，擴(kuò)增等。

NK細(xì)胞的純化可以采用在cGMP條件下的血清法或Ficoll分離處理PBMC以進(jìn)行[43]。 Sukamoto等[44]采用了一種獨(dú)特的方法，在沒有事先純化外周血的情況下產(chǎn)生大量NK細(xì)胞，即用自體血漿，IL-2，OK-432和γ-照射的自體T-細(xì)胞(FN-CH 296刺激)培養(yǎng)PBMC細(xì)胞。在第21～22天，NK細(xì)胞純度達(dá)到90.96%。免疫磁性耗盡法是純化和富集NK細(xì)胞的另一種方法，涉及耗盡其他淋巴細(xì)胞如T和B細(xì)胞和骨髓細(xì)胞[45]。Nguyen等[46]報(bào)道了造血干細(xì)胞(HSC)移植后部分T細(xì)胞耗竭的有益作用，從而表明T細(xì)胞在體內(nèi)刺激NK細(xì)胞活性中具有積極作用。飼養(yǎng)層細(xì)胞和細(xì)胞系在NK細(xì)胞體內(nèi)擴(kuò)增中的應(yīng)用也有報(bào)道[47]。此外，通過免疫磁性選擇直接富集CD56+細(xì)胞是另一種有用的方法[45]。通過CD34+的分化和擴(kuò)增從骨髓，外周血或UCB中使用HSC(CD34+)可以成為具有臨床相關(guān)性抗腫瘤NK細(xì)胞的另一潛在來源。最近，一項(xiàng)研究表明，與新鮮CBCD34+和冷凍PBCD34+[48]相比，冷凍CBCD34+是產(chǎn)生NK細(xì)胞的最有希望的HSC來源。來源于UCB的NK細(xì)胞活性較低，表現(xiàn)出降低的殺傷特性，但可以通過用IL-2，IL-12和IL-15進(jìn)行離體處理來刺激[45]。 Knorr 等[47]報(bào)道NK細(xì)胞的重要來源HESC和iPSC可降低免疫排斥反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)。在這個(gè)過程中，HESCs和iPSCs經(jīng)歷兩階段培養(yǎng)方法，通過SPIN-EB系統(tǒng)分化成CD34+細(xì)胞[49]。源自人類胚胎干細(xì)胞的NK細(xì)胞具有在體內(nèi)和體外殺死多種類型的腫瘤的能力。來源于HESc和IPSC的NK細(xì)胞能夠抑制來自CEM-GFP細(xì)胞的HIV-1 NL4-3感染[50]。此外，基于小鼠異種移植模型的研究還觀察到來源于PB和iPSC的NK細(xì)胞具有介導(dǎo)殺死卵巢癌細(xì)胞的能力[51]。在無異種和無血清條件下，產(chǎn)生細(xì)胞毒性NK細(xì)胞，導(dǎo)致臨床規(guī)模生產(chǎn)向前邁進(jìn)一步[47]。

3.2 未來NK細(xì)胞療法發(fā)展方向

對(duì)于現(xiàn)有的抗癌療法，NK細(xì)胞的細(xì)胞系(NK-92，NKL，KYHG-1和NKG)是潛在的工具。此外，表達(dá)細(xì)胞內(nèi)IL-2和細(xì)胞表面分子如CD16，NCR或嵌合抗原受體的基因修飾NK細(xì)胞系也被用作產(chǎn)生活化的NK細(xì)胞的可能工具[49]。這一思路來源于，近年來，F(xiàn)DA批準(zhǔn)了幾例CAR-T細(xì)胞療法用于癌癥治療[52-53]。優(yōu)于CAR-T細(xì)胞療法的是CAR-NK細(xì)胞療法，其可以無需預(yù)先致敏而以非特異性方式殺死靶細(xì)胞，且異體NK細(xì)胞缺乏引起移植物抗宿主反應(yīng)(graft-versus-host disease，GVHD)的潛力[54]。許多基因修飾的NK細(xì)胞已被選為臨床試驗(yàn)，但所有這些仍處于新生階段，一些新的潛在策略還處于研究中。此外，為了應(yīng)對(duì)腫瘤微環(huán)境，各種免疫抑制療法也正在開發(fā)中。許多方法涉及通過單克隆抗體觸發(fā)ADCC，其抗原結(jié)合片段(Fab)結(jié)合腫瘤細(xì)胞，并且恒定區(qū)(Fc)結(jié)合NK細(xì)胞表面上的CD16配體[55]。此外， Anti-CD20(Rituximab)，Anti-Her-2(Trastuzumab)，Anti-CD52(Alemtuzumab)和Anti-EGFR(Cetuximab)都是利用ADCC觸發(fā)現(xiàn)象的單克隆抗體的幾個(gè)例子[56]。

4 結(jié)語與展望

理想的NK細(xì)胞可成為安全的、已有的且易于產(chǎn)生足夠量的過繼性細(xì)胞治療產(chǎn)品。目前許多團(tuán)隊(duì)正在探索從外周血單核細(xì)胞、臍帶血和胚胎干細(xì)胞提取NK細(xì)胞的方法。為了增加NK細(xì)胞對(duì)腫瘤的毒性作用，有團(tuán)隊(duì)已經(jīng)嘗試了將以NK細(xì)胞為基礎(chǔ)的免疫療法與各種有效細(xì)胞因子相組合，運(yùn)用CAR轉(zhuǎn)導(dǎo)和基因編輯的方法改變它們的抗原特異性，提高NK細(xì)胞在傳輸過程的持續(xù)性和提高其細(xì)胞毒性。對(duì)于NK細(xì)胞在腫瘤治療中的實(shí)際應(yīng)用，有必要深入了解其基礎(chǔ)生理學(xué)，以便良好控制NK細(xì)胞活性。平行于臨床上NK細(xì)胞庫的開發(fā)，同時(shí)也需要進(jìn)行比較性臨床試驗(yàn)。未來需要進(jìn)行基于NK細(xì)胞產(chǎn)品的多中心臨床試驗(yàn)，以評(píng)估其數(shù)據(jù)的有效性。很快，NK細(xì)胞治療可能會(huì)成為治療人類癌癥的最有前景的工具之一。