鄭惠元，王英平，雷秀娟

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，長春 130112）

人工種子是1978年由Murashige[1]首次提出的，自提出以來，就引起國內(nèi)、外很多國家的重視。1985年，歐共體把人工種子列入“尤里卡”計劃；我國在1987年也將其列入“863”高新技術(shù)發(fā)展計劃，并在胡蘿卜、苜蓿、芹菜等模式作物的人工種子制作技術(shù)中取得了重要進(jìn)展；日本將人工種子的研究范圍擴(kuò)大到重要的糧食作物水稻和蔬菜等作物[2]。為提高人工種子的萌發(fā)率和成苗率，人們致力于人工胚乳的研究，并取得了很好的效果。要想制作出符合機(jī)械化生產(chǎn)的人工種子，外種皮的研制尤為重要。為延長人工種子的貯藏時間，增強(qiáng)人工種子的抗菌能力，需要在人工胚乳中加入提高繁殖體耐性的成分。因此，包埋基質(zhì)的研究不論是對提高人工種子的萌發(fā)率和成苗率還是在人工種子的貯藏和防腐研究中都具有重要意義。

1 人工種子的概念及特點

人工種子是指將植物離體培養(yǎng)后產(chǎn)生的體細(xì)胞胚或分生組織包埋在含有養(yǎng)分和保護(hù)功能的物質(zhì)中，在適宜條件下萌發(fā)成苗的球狀結(jié)構(gòu)。它具有同天然種子類似的結(jié)構(gòu)，由人工種胚、人工胚乳和人工種皮3部分組成，故又稱作合成種子或種子類似物[3]。

人工種子屬于無性繁殖，具有固定雜種優(yōu)勢、保持優(yōu)良品種、縮短育種年限等優(yōu)點。此外，與一年一度的天然育種相比，人工種子的生產(chǎn)不受季節(jié)性限制，還能根據(jù)植物的不同品種和各種環(huán)境因素，人為地在包埋基質(zhì)中添加農(nóng)藥、生物肥料、有益微生物、植物激素等物質(zhì)，以增強(qiáng)植物在不同環(huán)境中的抗逆性，促進(jìn)植物生長；在繁殖苗木、人工育林等方面，人工種子比試管育苗繁殖成本更低，節(jié)省了人力、物力和財力。

2 人工種子的包埋基質(zhì)及方法

2.1 人工胚乳

人工胚乳介于人工種皮和胚狀體之間，為人工種胚提供有機(jī)物和無機(jī)鹽等物質(zhì)，這些營養(yǎng)物質(zhì)能夠促進(jìn)人工種子的生長發(fā)育。人工胚乳所含的物質(zhì)是體細(xì)胞胚萌發(fā)的培養(yǎng)基成分，主要有MS培養(yǎng)基、N6培養(yǎng)基[4]、B5培養(yǎng)基[5]和SH培養(yǎng)基[6]。除此之外，還需要在人工胚乳中添加適當(dāng)?shù)奶荚?，一方面，碳源能夠維持球狀膠囊內(nèi)外的滲透壓；另一方面，體胚在生長和分化成苗的過程中也需要來自于人工胚乳所提供的碳源。目前，常用的碳源有蔗糖、果糖、麥芽糖和淀粉，需要根據(jù)植物自身的特性選擇其所適宜的碳源。葉志毅等[7]以蔗糖和果糖作為碳源包埋桑樹體細(xì)胞胚，當(dāng)果糖的濃度為20g/L時，人工種子的發(fā)芽率和莖發(fā)生率都只有22%；把碳源換為30g/L的蔗糖后，發(fā)芽率達(dá)100%、莖發(fā)生率達(dá)89%。郭順星等[8]用麥芽糖作為鐵皮石斛原球莖的碳源時，存活率達(dá)到64%。刑小黑等[9]在研究水稻釉粳人工種子時發(fā)現(xiàn)，用麥芽糖作為碳源更有利于水稻釉粳不定芽的萌發(fā)。黃紹興等[10]在研究木薯淀粉時發(fā)現(xiàn)，淀粉分子具有多孔狀的結(jié)構(gòu)，這樣的特性恰好改善了海藻酸鈣的致密結(jié)構(gòu)影響明膠顆粒透氣性、保水性和吸水性差的問題。此外，不同的碳源濃度也影響著人工種子的萌發(fā)，研究發(fā)現(xiàn)，一定范圍內(nèi)提高人工胚乳中的蔗糖濃度能夠增加獼猴桃人工種子的萌發(fā)率[11]。

為提高人工種子的萌發(fā)率，程力輝等[12]研究表明，在半夏人工胚乳中添加萘乙酸和赤霉素，萌發(fā)率達(dá)到84%。添加適宜的生長調(diào)節(jié)劑有利于繁殖體的萌發(fā)和生長，若增強(qiáng)植物的抗逆性還需添加殺菌劑、防腐劑、抗生素等提高植物抗逆性的物質(zhì)[13]。Kumar等[14]為抑制雜交稻人工種子萌發(fā)環(huán)境的微生物，在人工胚乳中添加適量的多菌靈和鏈霉素，對胚乳的發(fā)芽和轉(zhuǎn)化沒有影響。薛建平等[15]在半夏人工胚乳中添加1%的多菌靈，25℃貯藏30d，萌發(fā)率可達(dá)到65%，表明多菌靈在對人工種皮霉菌的滋生方面起到了一定的延緩作用。

2.2 人工種皮

人工種皮分為內(nèi)種皮和外種皮2種，對于內(nèi)種皮的選取應(yīng)具備以下條件：內(nèi)種皮的成分應(yīng)對繁殖體無毒、無害，具有生物相容性，能支持胚；能與外界環(huán)境交換氣體，具有保持水分及營養(yǎng)物質(zhì)和保護(hù)劑的能力；具備一定的機(jī)械強(qiáng)度，保持明膠顆粒的完整性，既不阻礙人工種子的正常萌發(fā)，在人工種子的貯藏、運輸和播種中對胚狀體起到保護(hù)作用；能被生物降解，對其他植物和環(huán)境不造成傷害和污染。

海藻酸鈉具有良好的通透性、生物活性、價格低廉、無毒害等優(yōu)點，常被用作包埋基質(zhì)中的內(nèi)種皮。但在人工種子制作過程中，僅僅使用海藻酸鈉作為內(nèi)種皮仍存在易粘連、易失水、吸水回漲性差等問題。因此，為提高人工種子的成苗率，結(jié)合海藻酸鈉研制復(fù)合包埋基質(zhì)成為人們研制人工種皮的新熱點。Timbert等[16]發(fā)現(xiàn)，添加多糖、樹膠、高嶺土后的海藻酸鈉保水性增加，對干燥處理過的胡蘿卜體細(xì)胞胚的活力恢復(fù)也起到了積極的促進(jìn)作用。薛建平等[17]在海藻酸鈉中添加赤霉素、苯甲酸鈉、多菌靈、Cl2O和殼聚糖等制成的復(fù)合人工種皮，萌發(fā)率可達(dá)95%。張明生等[18]在海藻酸鈉中添加2.0%的殼聚糖為半夏人工種皮基質(zhì)，在4℃貯藏20d，發(fā)芽率和轉(zhuǎn)化率分別達(dá)到82.8%和78.6%。

目前，內(nèi)種皮的研制還僅限于無菌條件，且僅有內(nèi)種皮包埋的人工種子不利于機(jī)械化播種，要想同自然種子一樣能夠正常貯藏、包裝和運輸，還有賴于人工外種皮的研制。Redenbaugh等[19]采用ElvexTM-4260作為外種皮的材料，這種材料能有效地防止?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)滲漏和膠囊間黏連，同時，還具有保持水分和抑制干縮等優(yōu)點，制作出的人工種子機(jī)械強(qiáng)度較高，有較高的萌發(fā)率，但未見成苗的報道。Ling[20]以海藻酸鈉為內(nèi)層基質(zhì)，殼聚糖為外層基質(zhì)包埋油菜次生胚狀體時，實現(xiàn)了100%的萌發(fā)率，但在有菌條件下的發(fā)芽率仍然不高。George[21]試用硅膠制作的谷子人工種子，其發(fā)芽率達(dá)82%，4℃貯藏14d后，體胚仍可萌發(fā)。

包裹人工種子的外種皮不僅可以提高人工種子的保水力、防止胚乳中的營養(yǎng)外滲，還可以減少土壤中的微生物、溫度和pH值等環(huán)境因素對人工種子的萌發(fā)率、成苗情況的影響。同時也便于人工種子的運輸、貯藏和播種。

2.3 人工種子的包埋

雖然現(xiàn)在已經(jīng)有國家研制出了人工種子包埋機(jī)，但還沒能完全替代手工包埋，還有許多需要改進(jìn)的地方。目前，主要的包埋方法有液膠包埋法、干燥法和水凝膠法。液膠包埋法是將粘滯流體膠中懸浮的胚狀體直接播種于土壤中，Drew[22]用此法將胡蘿卜的體細(xì)胞胚播種于無糖的基質(zhì)上，成功獲得了3顆植株。干燥法是指用聚氧乙烯等聚合物包埋干燥過的體細(xì)胞胚，此法有利于人工種子的貯藏，Redenbaugh等[19]首次用該方法包埋苜蓿體細(xì)胞胚，成苗率達(dá)86%，證明了干燥法包埋體細(xì)胞胚的有效性。水凝膠法是指通過離子交換或溫度突變將繁殖體包埋起來，形成球形的凝膠顆粒，目前，最常用的是離子交換法，即將海藻酸鈉中懸浮的體細(xì)胞胚滴入 CaCl2溶液后發(fā)生離子交換反應(yīng)，形成球狀膠囊。

3 人工種子的貯藏

因農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的季節(jié)性限制，包埋出的人工種子不一定能及時用于生產(chǎn)，人工種子的含水量高，易失水干縮，這極大地增加了人工種子的貯藏難度。想要解決該技術(shù)的關(guān)鍵問題還在于完善人工種子的包埋基質(zhì)。目前，研究的貯藏方法有低溫法、干燥法、抑制法、液體石蠟法、超低溫液氮保存及上述方法的組合[23]，報道最多的是低溫法和干燥法的結(jié)合。

干燥法實質(zhì)上是模擬天然種子經(jīng)過脫水等生理變化進(jìn)入休眠的過程。干化能使胚狀體的生長停滯，同時人工種子幼苗的活力也有所提高[24，25]。崔紅等[26]發(fā)現(xiàn)，干化使貯藏期間芹菜體胚的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)不被破壞，保持了細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的相對穩(wěn)定。Gray等[24]研究報道，在相對濕度70%的條件下，脫水貯存葡萄體細(xì)胞胚，21d后的萌發(fā)率為34%。Hammatt等[27]研究表明，脫水處理過的大豆的體胚萌發(fā)率顯著增加。Takahata[28]將脫落酸處理過的子葉期甘藍(lán)體胚脫水至含水量為10%，在室溫條件下保存3個月后仍能轉(zhuǎn)化成苗，并在形態(tài)和倍性水平上均與未干化的體胚無顯著差異。

干化對細(xì)胞組織有一定的傷害作用，為降低這種損傷，Timbert等[16，29]用高濃度的蔗糖、脯氨酸和ABA預(yù)處理體胚，脫水耐性在一定程度上有所提高。Choi等[30]報道了蔗糖預(yù)處理高麗參體胚后延長了體胚的休眠時間。Timbert等[16]發(fā)現(xiàn)，經(jīng)脯氨酸預(yù)處理后的胡蘿卜體胚其自身的抗逆性有所增加。Roberts等[31]發(fā)現(xiàn)，與13%和20%的甘露醇相比，脫落酸能更好地促進(jìn)云杉子葉期體細(xì)胞胚中貯藏蛋白及可溶性糖等脫水保護(hù)物質(zhì)的積累，干化后的體胚發(fā)芽率能達(dá)到83%。

此外，4℃低溫儲藏法，有效地抑制了胚狀體的萌發(fā)，延緩芽的生長。Kumar等[32]將蝶豆的合成種子在4℃下保存5個月后，仍然有86%的存活率，并均發(fā)芽成功轉(zhuǎn)移到土壤中。

4 人工種子的防腐

防腐是實現(xiàn)人工種子在田間應(yīng)用的關(guān)鍵技術(shù)之一，人工胚乳中含有糖類等有機(jī)物，這些營養(yǎng)物質(zhì)暴露于大田這種開放的系統(tǒng)中，除了快速失水之外，還會遭受細(xì)菌、真菌、病毒等的侵染，要想使人工種子在萌發(fā)前不腐爛，還需要進(jìn)一步改善包埋基質(zhì)。柯善強(qiáng)等[33]在黃蓮人工種皮中加入防腐劑，有菌條件下其萌發(fā)率和成苗率均顯著提高。湯紹虎等[34]在甘薯人工種皮中加入400mg/L～500mg/L的先鋒霉素、多菌靈、安芐青霉素或羥基苯酸丙酯，均在不同程度上表現(xiàn)出抑菌作用，在MS培養(yǎng)基上的萌發(fā)率提高了4%～10%。陳德富等[35]在苧麻人工種皮中添加100mg/L的青霉素和0.1%克拉霉素作為防腐劑，播種到沙石肥土中，發(fā)芽率達(dá)15.3%，生根率為8.2%。

5 小結(jié)

自人工種子提出以來，在穩(wěn)定園林珍稀花卉物種、保存瀕危藥用植物資源、快繁脫毒果樹苗木等方面起到了重要作用。人工種子所具有的繁殖成苗快、不受季節(jié)限制、固定雜種優(yōu)勢等特點為種子的培育開辟了一條新途徑。不過，人工種子的研制存在著許多問題，例如，制作費用較高、包埋基質(zhì)不夠成熟、離實現(xiàn)大量制種和田間播種以及規(guī)?；a(chǎn)還有一定的差距。這就更需要人們根據(jù)不同的植物和用途對人工胚乳和種皮不斷地改進(jìn)和探索，提高人工種子的萌發(fā)率和成苗率，延長人工種子的貯藏時間，增強(qiáng)人工種子在自然環(huán)境的耐性，為人工種子的推廣奠定基礎(chǔ)。

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