龐彩紅 ，亓文英 ，李雙云 ，夏 陽 ，楊 勇 ，喬玉玲 ，孫 超 ，毛秀紅 ，臧真榮 ，劉盛芳

（1.山東省林業(yè)科學研究院，山東 濟南 250014；2.山東省林木遺傳改良重點實驗室，山東 濟南 250014；3.安丘市林業(yè)局，山東 濰坊 262100；4. 平?jīng)雎殬I(yè)技術學院，甘肅 平?jīng)?744000）

隨著現(xiàn)代遺傳學理論的不斷發(fā)展，人工創(chuàng)造變異的方法和新的林木育種手段不斷出現(xiàn)，但到目前為止，最基本的林木育種方法仍然是林木雜交育種[1-2]，雜交能創(chuàng)造出適合生產(chǎn)上需要的新基因型，其生長發(fā)育或抵抗性往往比兩個親本原種更為優(yōu)越；還可以利用雜交手段組配特殊的性狀，以解決生產(chǎn)上的特殊需求，而人工雜交育種是林木雜交育種的一個重要方法。劉孟軍等[3]從棗樹的親本選擇、免去雄控制雜交、授粉方法、胚培養(yǎng)等方面對棗樹雜交育種進行了探討與研究；王湘南等[4]對來自湖南、江西主產(chǎn)區(qū)不同種源油茶主栽品種在相同立地環(huán)境條件下開花授粉習性進行觀測研究，發(fā)現(xiàn)開花授粉習性與品種花期早晚、花期長短以及可授性與可配性、坐果率等密切相關，人工雜交授粉坐果率可高達88.0%；此外在桉樹、紅花油茶、油桐以及果樹上也取得一定進展[5-9]。國槐Sophora japonica在分類上屬于蝶形花科Papilionaceae槐屬Sophora，原產(chǎn)中國，現(xiàn)南北各省區(qū)廣泛栽培，華北和黃土高原地區(qū)尤為多見[10]。國槐樹冠優(yōu)美，花芳香，是行道樹和優(yōu)良的蜜源植物；具復圓錐花序，頂生，同一花序上的小花發(fā)育程度不同，開放時間也不同；花期7—8月，從花序基部依次向末端開放，這使得國槐花期時間較長，在綠化和園林配置中有較好的觀賞效果。國槐花量雖大，但自然落花情況嚴重，尤其是初花期和盛花期的前期，絕大部分花朵都敗育脫落，這一自然現(xiàn)象的存在使人工授粉雜交育種難以實施。因此，如何建立適宜國槐授粉雜交方法、獲得雜交種子成為國槐人工育種成敗的關鍵。到目前為止尚未見到相關文獻報道。本試驗以聊紅槐為父本，不同樹齡生長良好的普通國槐為母本，探索建立國槐人工授粉雜交的適宜方法，以期為國槐雜交育種提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 研究材料

試驗材料的母本為長勢健壯、開花結果正常的普通國槐，種植于山東省林業(yè)科學研究院壽光鹽堿地試驗站種質圃，位于壽光市北部，全年平均氣溫13℃，年均降水量600 mm，年均蒸發(fā)量2 200 mm，地下水位2～3 m，全年無霜期195 d。父本為聊紅槐Sophora japonica‘Liaohong’，種植于聊城大學國槐試驗園（由品種選育者邱艷昌先生提供）。

1.2 脫落花朵的統(tǒng)計

從7月初國槐初花期開始，每天中午收集當天脫落的花朵50～100朵，統(tǒng)計長雌蕊和中短雌蕊的花朵數(shù)，連續(xù)觀察1個月。

1.3 花粉萌發(fā)的觀察

參考牛艷娥等[11]方法并加以改進，國槐花粉萌發(fā)固體培養(yǎng)基為瓊脂20 g/L+蔗糖10 g/L+硼酸50 mg/L。25℃條件下培養(yǎng)4～5 h，顯微鏡下觀察萌發(fā)情況。

1.4 雌蕊形態(tài)的觀測

利用解剖鑷子將花瓣輕輕去掉，露出雌蕊和雄蕊，放在解剖鏡下觀察，拍照。

1.5 雌蕊柱頭可授性檢測

參考葉要妹等[12]的方法。柱頭呈現(xiàn)藍色并伴有大量氣泡出現(xiàn)，表明柱頭進入最佳可授期；柱頭外緣變藍有少量氣泡產(chǎn)生，為可授期；柱頭不變藍沒有氣泡，為不可授期。

1.6 人工授粉

在晴朗天氣的早上，選擇當天盛開的花朵，將花粉磕到硫酸紙上，包好，放在呈有干燥劑的干燥器中，帶回實驗室干燥12 h后，冷藏（4℃）5～7 d[11]。雜交前，挑選含苞待放的大花朵進行去雄，并摘除花序上所有花朵及小果莢。用小號毛筆蘸取收集好的花粉，輕輕涂抹在已去雄花朵的雌蕊柱頭上，柱頭顯示為淡黃色，說明花粉已成功涂抹上，授粉結束。再將整個花序用授粉袋套起來，并套上注明父本和母本、授粉時間、授粉花朵個數(shù)的標簽。授粉5～7 d后去袋，統(tǒng)計花朵授粉率；3個月后，統(tǒng)計坐果率。

式中：r為成功授粉花朵數(shù)；p為雜交成熟果實數(shù)；V為雜交授粉花朵數(shù)。

1.7 播 種

授粉3個月后采摘的綠色果莢，用75%酒精浸泡5 min后，無菌濾紙上吸干多余的酒精和水分，用鑷子和剪刀將果皮和種皮去掉，接種到MS培養(yǎng)基上，每瓶接種3粒。16 h光照/8 h黑暗培養(yǎng)，溫度為18～25 ℃。當幼苗長至2 片真葉時，統(tǒng)計種子萌發(fā)率。

授粉4個月后，種子完全成熟。用清水浸泡1 d后去除果皮，晾干，室溫保存。翌年春天用80 ℃熱水浸泡保存后的雜交種子，邊倒水邊攪拌。浸泡24 h后，撈出種子放入干凈的塑料盆中，覆蓋潮濕的紗布保濕。每天用清水沖洗種子2次，直至露白。露白種子播種在直徑12 cm的無紡布營養(yǎng)缽中，每個營養(yǎng)缽種2粒種子。播后覆蓋1 cm 營養(yǎng)土，澆透水。每周澆透水1次，當小苗長至2 片真葉時，統(tǒng)計出苗率。

2 結果與分析

2.1 授粉期對國槐授粉率和坐果率的影響

授粉時期的早晚直接決定授粉率的高低，選擇合適的授粉時期對于人工雜交育種至關重要[13-14]。國槐初花期的花朵一般自然脫落，此時脫落花朵中短雌蕊花朵所占比例達80%以上，隨后，長雌蕊花朵所占比例逐漸增大。當脫落花朵中長雌蕊花朵所占比例達到50%以上且花枝上出現(xiàn)已經(jīng)自然授粉成功的小果莢時進行人工授粉，可使國槐的人工授粉率達80%以上，坐果率達30%以上。這些授粉成功的花朵一般都位于花枝中末端。授粉期間，晴朗天氣上午人工授粉的授粉率和坐果率分別是90%和36.1%，下午的授粉率和坐果率分別是88.3%、34.9%（見表1），差異不明顯。

表1 國槐授粉率和坐果率與脫落花朵中長雌蕊花朵比例及授粉時間的關系Table1 Ratio of long pistil flower, artificial pollination rate and seed setting rate

2.2 花朵發(fā)育狀態(tài)及柱頭可授性對授粉率的影響

解剖鏡下觀察國槐花朵的形態(tài)發(fā)現(xiàn)，開放花朵的花藥已經(jīng)完全裂開，釋放出黃色花粉，雌蕊的柱頭上也已密布成熟花粉（見圖1C），因此開放花朵不能用來進行人工授粉；對于未開放的花朵來說，花藥尚未裂開，花粉沒有釋放出來，柱頭未被花粉污染（見圖1G），這樣的花朵符合授粉的要求。但并不是所有未開放的花朵都能用來進行人工授粉，通過聯(lián)苯胺-過氧化氫染色柱頭發(fā)現(xiàn)只有那些含苞待放的大花朵（長度大于14 mm）柱頭外緣變藍且有少量氣泡產(chǎn)生，具有可授性，這樣的花朵一般在第二天早上都會盛開，可用于人工授粉。

圖1 花朵形態(tài)(上：開放花朵；下：含苞待放花朵)Fig.1 Shape of fl owers (Upper: blooming fl owers; Lower: fl owers in bud)

2.3 花朵雌蕊長度對授粉率的影響

如圖2所示，解剖鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，國槐花朵存在長、中、短3種類型的雌蕊，早期開放的花朵一般是短、中型雌蕊，都會自然脫落，人工授粉過程中也發(fā)現(xiàn)這兩種類型的花朵不能完成授粉；后期開放的花朵一般具有長雌蕊，自然狀態(tài)下能夠授粉結出果莢，可選擇此種類型的含苞待放的花朵進行人工授粉。

圖2 長、中、短3種類型雌蕊形態(tài)Fig.2 Shape of long, middle and short pistil

2.4 授粉母樹樹齡對授粉率和坐果率的影響

園林樹木生命周期長，從種子萌發(fā)到具有開花潛能的成熟期需要幾年到幾十年，母樹樹齡過幼或者過大對人工授粉的效果影響明顯。如表3所示，國槐樹齡超過30 a，其人工授粉的授粉率為8.6%，結實率為0，因此不能選擇樹齡超過30 a的樹木作為母樹；樹齡在15～20 a的母樹其人工授粉率接近90%，坐果率為37.4%；樹齡在10 a左右的國槐坐果率不穩(wěn)定，不適合用來進行人工授粉。

表2 不同樹齡的國槐授粉率與坐果率Table 2 Artificial pollination rate and seed setting rate of different ages of mother tree

2.5 育 苗

雜交種子在MS培養(yǎng)基中播種80粒，出苗 80棵，出苗率為 100%；無紡布營養(yǎng)缽中播種80粒，出苗54棵，出苗率為67.5%，出苗率低于無菌育苗方法的出苗率，這可能是種子干燥過程中種皮變得致密堅硬，透氣性、透水性變差，影響了種子的發(fā)芽率。由此可見，盡早收集種子，進行無菌育苗是提高國槐雜交種子出苗率的首選方法。

3 結論與討論

為了提高人工授粉率及坐果率，需要找到適宜的授粉方法。不同植物的開花結實習性不同，人工授粉方法各異。大棚栽培條件下，翠冠梨Pyrus pyrifolia開花后3 d內為最佳授粉時間，在這期間授粉對大棚翠冠梨的坐果率、種子數(shù)、種子百粒重均無顯著影響[13]；油茶Camelia oleifera最佳授粉時間在單花開放第1～5 天，單花壽命越長其可授期就越長久[4]；刺槐Black locust[15]開花前1～2 d去雄，此時花瓣閉合，花藥未開裂，柱頭表面干凈無花粉，去雄后2 d 內授粉，否則柱頭干燥，且可授性差，雜交結實率為3.56%。本研究表明，國槐開花前1 d去雄，此時花藥未開裂，柱頭表面干凈，去雄后立即授粉雜交，坐果率可在30%以上，與刺槐的授粉特性相似。國槐初花期花朵一般自然脫落，脫落花朵中占比例達80%以上的是中、短型雌蕊花朵（柱頭明顯低于花絲），這也是造成初花期授粉率極低、坐果率為0的主要原因，這種現(xiàn)象在多種植物中存在，花生中短柱頭花朵的授粉率明顯低于正常花朵[16]，石榴花中雌蕊柱頭顯著低于雄蕊時，柱頭表面分泌物少，花粉不能正常黏合，難以進入花柱萌發(fā)形成花粉管[17]，因此也不能正常授粉結果。當國槐長雌蕊花朵比例達到50%～60%時，進入盛花期，是人工授粉的適宜時期，此時授粉率在80%以上，坐果率達30%以上。國槐最佳授粉時間就整個母樹花期而言，通過統(tǒng)計脫落花朵長雌蕊與中短雌蕊花朵比例來確定；就單個花朵而言，通過柱頭可授性檢測和雌蕊長度來確定；就整個花枝而言，授粉成功的花朵一般都位于花枝中末端。此外，天氣和病蟲害也會大大降低國槐人工授粉率和坐果率，2015年國槐人工雜交授粉率和坐果率分別為85.5%和16.8%（實驗室已有結果），因當年7月份雨天較多且有蚜蟲危害，授粉去袋后發(fā)現(xiàn)子房雖授粉膨大但布滿蚜蟲，甚至有些已萎蔫，導致后期的坐果率過低，因此國槐人工授粉要選擇晴朗天氣進行，授粉之前要提前防治蚜蟲。

因樹木種類的不同，到達成年期所需的時間也各不相同，刺槐需要4～5 a、側柏6～10 a、油松7～10 a、國槐10 a左右，剛進入成年期的國槐花量不大，結實率很低，此時進行人工授粉效果差，15～20 a的國槐進入開花結果的高峰期，且生長旺盛，營養(yǎng)充足，此時進行人工授粉效果最好。超過30 a樹齡的國槐人工授粉效果差，可能是隨樹齡的增長，生長勢變弱，病蟲害增加所致；隨著樹齡的增長，花朵對外界的刺激變得更加敏感，去雄及套袋對花發(fā)育的不利影響變大，導致授粉率及坐果率降低。對于園林綠化樹種及用材樹種進行人工雜交育種時，應選擇開花結實量大、花芽發(fā)育完全、生長旺盛、處于壯年期的母株。

結論：當脫落花朵中長雌蕊花朵所占比例達到50%以上時，選擇樹齡15～20 a、長勢健壯的母株且具有長雌蕊的含苞待放的大花朵，于晴朗天氣進行人工授粉，其授粉率在80%以上，坐果率在35%以上，這樣的花朵一般位于花枝的中末端，此方法簡單，便于大田操作，為國槐人工授粉提供了技術支持。

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