岳 紅 李巧玉 喻 燚 張紅波 董聰聰 施軍瓊 吳忠興

(西南大學(xué)三峽庫(kù)區(qū)生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 重慶市三峽庫(kù)區(qū)植物生態(tài)與資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 重慶 400715)

近年來, 水體富營(yíng)養(yǎng)化導(dǎo)致的藍(lán)藻水華已在世界各地廣泛報(bào)道[1], 藍(lán)藻水華的發(fā)生, 不僅引起水質(zhì)的惡化, 影響生態(tài)環(huán)境, 而且部分種類能夠釋放毒素影響了人類身體健康[2,3]。在已報(bào)道的藍(lán)藻水華中, 微囊藻水華最為普遍。研究表明池塘中微囊藻水華發(fā)生率為30%—50%, 主要是銅綠微囊藻與水華微囊藻[4], 而大中型水庫(kù)大部分水體優(yōu)勢(shì)種主要是微囊藻, 占水華總數(shù)的75%以上[5,6]。因而, 研究微囊藻水華生態(tài)過程具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

先前的研究表明, 微囊藻通常在春末迅速生長(zhǎng),夏季進(jìn)入穩(wěn)定期并占據(jù)主體地位, 秋季、冬季進(jìn)入水體底層或沉積物越冬, 到第二年的春天開始新一輪的循環(huán)[7]。許多藍(lán)藻形成休眠孢子或厚壁孢子來渡過冬季的逆境條件, 而微囊藻仍以營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞形式來應(yīng)對(duì)冬季低溫黑暗條件[8]。休眠孢子具有休眠和極強(qiáng)的抗逆性特征, 因此, 它具有很好的抵御冬季脅迫環(huán)境的能力, 然而, 微囊藻營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞如何適應(yīng)冬季逆境條件, 其作用機(jī)理尚不明確, 這也是揭示微囊藻水華形成過程的重要生態(tài)問題。因此, 本實(shí)驗(yàn)中以銅綠微囊藻(Microcystis aeruginosa PCC 7806)為研究對(duì)象, 將其與小球藻(Chlorella sp.FACHB-31)進(jìn)行對(duì)比實(shí)驗(yàn), 探究其在低溫黑暗條件下它們的響應(yīng)機(jī)制, 為揭示藍(lán)藻水華形成提供重要的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藻種及培養(yǎng)條件

實(shí)驗(yàn)所采用的銅綠微囊藻和小球藻均由中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所淡水藻種庫(kù)提供。采用MA培養(yǎng)基在(25±1)℃, 光照強(qiáng)度為25 μE/(m2·s) (光暗比12h鯰12h)交替培養(yǎng)[9]。當(dāng)2種藻生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)期后, 對(duì)其進(jìn)行離心, 并用新鮮的MA培養(yǎng)基進(jìn)行清洗3次, 清洗后的藻樣接種到250 mL錐形瓶中(細(xì)胞密度為1.0×106cells/mL)。用黑布和錫箔紙將錐形瓶包扎且不透光后, 放置4℃的冷柜中, 保持低溫黑暗培養(yǎng)。平均每5天取樣1次進(jìn)行測(cè)定, 持續(xù)30d。

1.2 恢復(fù)培養(yǎng)

在適應(yīng)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行30d后, 將培養(yǎng)條件恢復(fù)到正常情況[溫度為(25±1)℃, 光照強(qiáng)度為25 μE/(m2·s)],再平均2d取樣一次進(jìn)行測(cè)定, 實(shí)驗(yàn)持續(xù)10d。

1.3 生物量及色素含量測(cè)定

細(xì)胞數(shù)量采用浮游植物計(jì)數(shù)法進(jìn)行測(cè)定[10]。樣品中葉綠素a與胡蘿卜素含量測(cè)定采用90%的丙酮過夜提取, 離心, 取上清液于663、645和450 nm處測(cè)定吸收值[11]。葉綠素含量采用Chl.a(mg/L)=12.72×A663[10]; 而類胡蘿卜素含量Carotenoids(mg/L)=4.1×A450-0.0435×Chl.a[12]。

1.4 最大可變熒光(Fv/Fm)測(cè)定

利用Phyto-PAM(Phyto-PAM, ED, Walz, Effeltrich, Germany)測(cè)定, 具體測(cè)定方法參見吳曉東等[13]研究。

1.5 丙二醛(MDA)含量及過氧化氫酶活性(CAT)測(cè)定

脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸比色法進(jìn)行測(cè)定[14], 過氧化氫酶(CAT)采用比色法在240 nm處進(jìn)行測(cè)定[15]。

1.6 細(xì)胞存活率

所有處理30d的樣品通過FDA (Fluorescein diacetate)染料染色。FDA熒光用Epics Altra流式細(xì)胞儀(Coulter, Beckman, USA)進(jìn)行檢測(cè)。FCM輸出功率為15 mW, 激發(fā)光為488 nm。FDA染色的細(xì)胞所發(fā)出的熒光在505—545 nm被檢測(cè), 根據(jù)熒光點(diǎn)的位置和密度判斷細(xì)胞存活率[16]。

1.7 統(tǒng)計(jì)方法

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均設(shè)置3個(gè)重復(fù)。Control(對(duì)照)表示正常處理30d的各項(xiàng)指標(biāo), 而低溫+黑暗表示在低溫黑暗處理?xiàng)l件下的各項(xiàng)指標(biāo), 數(shù)據(jù)表達(dá)形式均為Means±SD, 并采用ANOVA進(jìn)行顯著性分析, 顯著性水平設(shè)置為P＜0.05。統(tǒng)計(jì)分析應(yīng)用SPSS22.0軟件, 圖形采用Origin8.6軟件繪制。

2 結(jié)果

2.1 葉綠素濃度

低溫黑暗培養(yǎng)30d后, 銅綠微囊藻PCC 7806的葉綠素a濃度下降了55.88%, 小球藻FACHB-31的葉綠素a濃度下降52.07%。在低溫黑暗條件下, 類胡蘿卜素與葉綠素的比值(Car/Chl.a)均高于對(duì)照組,微囊藻PCC 7806增加了0.61倍, 小球藻FACHB-31增加了3.23倍(圖1)。然而, 在正常條件培養(yǎng)下, 微囊藻和小球藻的葉綠素1.48倍和3.58倍。

圖1 銅綠微囊藻與小球藻的葉綠素a及類胡蘿卜素相對(duì)含量Fig. 1 Chlorophyll a contents and the relative contents of carotenoids in Microcystis aeruginosa PCC 7806 and Chlorella sp.FACHB-31 after 30 days under darkness and low temperature incubation

2.2 最大光化學(xué)效率(Fv/Fm)

低溫黑暗培養(yǎng)30d后, 2種藻的最大光化學(xué)效率(Fv/Fm)均呈現(xiàn)下降的趨勢(shì), 微囊藻PCC 7806的對(duì)照處理組差異不顯著, 小球藻FACHB-31對(duì)照組在15d增加到0.67后, 開始緩慢下降, 但整體均高于低溫黑暗處理組(圖2)。

圖2 低溫低光對(duì)微囊藻PCC 7806和小球藻FACHB-31 Fv/Fm的影響Fig. 2 Effects of darkness and low-temperature on Fv/Fm of Microcystis aeruginosa PCC 7806 and Chlorella sp. FACHB-31 during 30 days incubation

2.3 存活率比較

低溫和黑暗抑制了兩種藻的生長(zhǎng)(圖3), 在正常培養(yǎng)和低溫黑暗條件下培養(yǎng)30d后, 銅綠微囊藻存活率分別為(81.6±0.04)%和(54.6±2.9)%, 降幅為33.09%; 而小球藻分別為(74.5±0.04)%和(31.3±1.2)%, 降幅為57.99%。與對(duì)照相比, 2種藻存活率均顯著降低(P＜0.05, ANOVA)。

2.4 丙二醛含量(MDA)及過氧化氫酶(CAT)活性

在30d正常和低溫黑暗條件下培養(yǎng), 銅綠微囊藻的丙二醛(MDA)含量(圖4a)分別為4.7和37.5 μmol/mg protein, 與正常對(duì)照組相比, 在低溫黑暗條件培養(yǎng)下MDA具有顯著變化(P＜0.05, ANOVA); 而小球藻MDA含量分別為0.5和2.5 μmol/mg protein, 變化顯著(P＜0.05, ANOVA)。PCC 7806及FACHB-31的過氧化氫酶(CAT)在低溫黑暗培養(yǎng)過程分別上升44.8%和5.5%(圖4b)。銅綠微囊藻在培養(yǎng)前后差異顯著(P＜0.05, ANOVA), 且2種藻之間具有顯著性差異(P＜0.05, ANOVA)。然而, 在正常對(duì)照培養(yǎng)條件下, 微囊藻和小球藻的MDA含量和CAT活性均未顯著性變化。

2.5 恢復(fù)實(shí)驗(yàn)

在30d的低溫黑暗培養(yǎng)后, 將2種藻放置正常溫度及正常光照條件繼續(xù)培養(yǎng)10d, 研究2種藻的生長(zhǎng)恢復(fù)能力。結(jié)果表明2種藻均能迅速恢復(fù)生長(zhǎng)(圖5),銅綠微囊藻PCC 7806細(xì)胞數(shù)由原來的0.1195(×107/mL)增加到0.55 (×107cell/mL), 上升6.5倍, 變化顯著(P＜0.05, ANOVA)。小球藻FACHB-31細(xì)胞數(shù)則上升8.6倍, 達(dá)到0.6365 (×107/mL), 顯著增加(P＜0.05, ANOVA), 而2種藻之間差異不顯著(P＞0.05, ANOVA)。

3 討論

圖3 銅綠微囊藻(PCC 7806)與小球藻(FACHB-31)存活率Fig. 3 Comparison of metabolic activities between Microcystis aeruginosa PCC 7806 and Chlorella sp. FACHB-31 by flow cytometry(FCM) after 30 days of darkness and low-temperature incubation

在自然水體中, 浮游植物必須面對(duì)晝夜和季節(jié)交替的過程, 這使得它們可能會(huì)長(zhǎng)期或周期性地處于一個(gè)不利的環(huán)境中, 在這種情況下, 藻類需要具備能夠長(zhǎng)期耐受不利條件并能在有利條件下及時(shí)恢復(fù)的能力。對(duì)藍(lán)藻生活史的研究發(fā)現(xiàn), 一部分時(shí)間是以休眠的形式存在于底泥中, 剩余的時(shí)間是以漂浮狀態(tài)存在[17]。這種底棲-漂浮的生活史不僅影響不同浮游植物種類的演替[18], 也直接影響了水體某些種類的優(yōu)勢(shì)度[19]。然而, 藻類如何應(yīng)對(duì)底棲中的低溫、黑暗條件以及它們的機(jī)制研究甚少。Wu等[8]研究發(fā)現(xiàn)與柵藻相比, 銅綠微囊藻在低溫黑暗條件下培養(yǎng)30d后, 細(xì)胞數(shù)量及葉綠素a含量變化不顯著, 表現(xiàn)出更強(qiáng)的適應(yīng)能力, 使得其能在這樣的逆境條件下生存更長(zhǎng)的時(shí)間。謝曉玲等[20]研究也表明, 當(dāng)氣溫較低時(shí), 藍(lán)藻較綠藻更占優(yōu)勢(shì)。本研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)了低溫黑暗培養(yǎng)下銅綠微囊藻葉綠素a含量變化不顯著(圖1a), 表明銅綠微囊藻能夠適應(yīng)低溫黑暗條件并保持色素的穩(wěn)定性。然而,與微囊藻相比, 本研究發(fā)現(xiàn)小球藻的葉綠素a含量經(jīng)過低溫黑暗培養(yǎng)呈顯著降低(圖1b), Zhang等[21]對(duì)黑暗處理?xiàng)l件下小球藻(Chlorella pyrenodosa)的研究也獲得了類似的結(jié)果, 即黑暗條件對(duì)小球藻細(xì)胞色素的合成有顯著影響。

圖4 銅綠微囊藻與小球藻的丙二醛含量和過氧化氫酶活性Fig. 4 Effects of darkness and low-temperature on Malodialdehyde content (MDA) and catalase activity (CAT) in Microcystis aeruginosa PCC 7806 and Chlorella sp. FACHB-31 after 30 days incubation

圖5 適應(yīng)期(黑暗低溫)與恢復(fù)期(正常條件)細(xì)胞數(shù)量Fig. 5 Change of cell numbers in Microcystis aeruginosa PCC 7806 and Chlorella sp. FACHB-31 in response to darkness and low-temperature conditions

最大可變熒光(Fv/Fm)是衡量光化學(xué)效率的重要參數(shù), 常用來表征PSⅡ反應(yīng)中心內(nèi)稟光能轉(zhuǎn)換效率。在正常生理狀態(tài)下,Fv/Fm處于穩(wěn)定狀態(tài)[22]。本研究發(fā)現(xiàn)銅綠微囊藻與小球藻在低溫黑暗條件下培養(yǎng)Fv/Fm呈現(xiàn)逐步下降趨勢(shì)(圖2), 表明2種藻隨著低溫黑暗培養(yǎng)時(shí)間的增加, 最大可變熒光均受到影響。然而, 相比于小球藻, 銅綠微囊藻下降更加明顯。Wu等[8]對(duì)微囊藻和柵藻的研究也發(fā)現(xiàn)類似的結(jié)論。Jochem[23]研究發(fā)現(xiàn), 在面對(duì)著黑暗脅迫下, 不同的浮游植物呈現(xiàn)可能呈現(xiàn)出2種不同的機(jī)制, 即減少代謝活性或仍保持穩(wěn)定的代謝活性。本研究發(fā)現(xiàn)小球藻Fv/Fm值一直維持在一個(gè)穩(wěn)定的水平, 這表明當(dāng)遭受低溫、黑暗脅迫時(shí), 微囊藻和小球藻表現(xiàn)出不同的機(jī)制來應(yīng)對(duì)脅迫, 即微囊藻可能通過降低自身的光合活性, 而小球藻則保持較高的、穩(wěn)定的光合活性。

丙二醛(MDA)是膜質(zhì)過氧化的產(chǎn)物, 是表征膜受損程度及抗逆性的重要參數(shù), MDA含量越高則表示細(xì)胞受損程度越大[24]。過氧化氫酶是細(xì)胞內(nèi)分解有害產(chǎn)物過氧化氫重要的酶類。本研究發(fā)現(xiàn)銅綠微囊藻MDA含量高于小球藻(圖3a), 表明與小球藻相比, 銅綠微囊藻受到更大的氧化損傷。類胡蘿卜素是一種廣泛存在于生物的天然色素, 更是1種保護(hù)細(xì)胞免受活性氧, 強(qiáng)光等有害因素影響的天然抗氧化劑[25]。它是植物光合作用的輔助色素,具有捕獲光能并將其傳遞到葉綠素a的功能[26], 小球藻單位類胡蘿卜素含量的增加(圖1b), 表明類胡蘿卜素參與保護(hù)小球藻使其免受氧化損傷。過氧化氫酶(CAT)通過將H2O2歧化為H2O和O2的方式來維持生物體內(nèi)的氧化還原平衡[27]。本研究發(fā)現(xiàn)與小球藻相比, 銅綠微囊藻CAT顯著增加(圖3b), 表明銅綠微囊藻通過CAT清除氧化損傷。由于抗氧化系統(tǒng)酶對(duì)于機(jī)體內(nèi)活性氧自由基及過氧化氫的清除存在1個(gè)閾值, 當(dāng)細(xì)胞內(nèi)氧自由基濃度超過一定范圍, 抗氧化體系酶不能及時(shí)清除, 導(dǎo)致細(xì)胞進(jìn)一步受到損傷[28]。因此, 本研究發(fā)現(xiàn)低溫黑暗培養(yǎng)30d后, 銅綠微囊藻與小球藻的存活率分別為54.9%和31.3% (圖4b、圖4d)。這表明2種藻均受到細(xì)胞的損傷。Wu等[8]表明銅綠微囊藻通過降低自身的代謝活性, 降低了細(xì)胞的死亡率。相比銅綠微囊藻,由于小球藻一直保持較高的光合活性, 導(dǎo)致存活率降低。當(dāng)恢復(fù)光照與溫度后, 2種藻細(xì)胞數(shù)量增加,銅綠微囊藻與小球藻均顯著增加(P＜0.05, ANOVA,圖5)。然而, 小球藻則表現(xiàn)出較快的生長(zhǎng)恢復(fù)。陳曦等[29]研究提出小球藻對(duì)溫度具有極強(qiáng)的適應(yīng)能力, 且在富含有機(jī)質(zhì)的水域中生活良好, 因此在恢復(fù)溫度和光照的后便能更快的進(jìn)行生長(zhǎng)。

綜上所述, 低溫黑暗培養(yǎng), 銅綠微囊藻存活率高于小球藻, 2種藻細(xì)胞數(shù)量差異顯著; 為了應(yīng)對(duì)外界脅迫環(huán)境, 2種藻采用不同的代謝策略, 即銅綠微囊藻通過降低代謝活性, 而小球藻則采取保持較高代謝活性來應(yīng)對(duì)不良環(huán)境。

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