劉露露 盧緒鑫 葉天韻 金司晨 閔元棋 韓亞杰 楊家新

(南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 南京 210023)

輪蟲是重要的淡水浮游生物類群, 由于其個(gè)體小, 生活史周期和世代時(shí)間短、生殖速度快, 自20世紀(jì)70年代初期開始, 輪蟲被用作毒理學(xué)研究的重要受試動(dòng)物[1,2], 如Buikema等[3]采用輪蟲評(píng)價(jià)重金屬離子的毒性, 并獲得理想效果。目前, 生態(tài)毒理學(xué)方面的研究多集中在萼花臂尾輪蟲(Brachionus calyciflorus), 而對(duì)捕食性晶囊輪蟲, 如卜氏晶囊輪蟲(Asplanchna brightwelli)作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究生態(tài)毒理效應(yīng)的報(bào)道尚不多見。目前, 針對(duì)晶囊輪蟲的研究大多學(xué)者都集中于輪蟲表型多態(tài)現(xiàn)象研究方面, Gilbert[4]發(fā)現(xiàn)西氏晶囊輪蟲(Asplanchna sieboldi)在0.02 pg生育酚的誘導(dǎo)下會(huì)由正常的囊型個(gè)體(Saccate)轉(zhuǎn)變?yōu)槭中蛡€(gè)體(Cruciform)和鐘型個(gè)體(Campanulate)。Birky[5]將雌體卜氏晶囊輪蟲的形態(tài)分為α 型和β 型。由于卜氏晶囊輪蟲個(gè)體比萼花臂尾輪蟲大且行動(dòng)緩慢易計(jì)數(shù), 很多學(xué)者都建議將其作為水環(huán)境監(jiān)測(cè)的指示生物。

睪丸酮與雌二醇是由脊椎動(dòng)物分泌的類固醇激素, 進(jìn)入水體會(huì)對(duì)浮游生物產(chǎn)生內(nèi)分泌干擾。近年來, 國內(nèi)外已有若干關(guān)于環(huán)境激素對(duì)輪蟲影響的研究[6,7], 如Radix等[8]發(fā)現(xiàn)當(dāng)睪丸酮濃度高于0.58 μmol/L時(shí), 萼花臂尾輪蟲內(nèi)稟增長率r會(huì)顯著下降。2種多溴二苯醚BDE-47和BDE-209均促進(jìn)褶皺臂尾輪蟲(Brachionus plicatilis)性成熟, 其中BDE-47顯著抑制其繁殖力, BDE-209顯著提高其繁殖力[9]。Huang等[10]發(fā)現(xiàn)狄氏劑濃度為0.001—100 μg/L,17β-雌二醇濃度為0.001、0.01、1、100和1000 μg/L時(shí), 可顯著延長萼花臂尾輪蟲輪蟲的繁殖期(P＜0.01)。然而關(guān)于環(huán)境激素對(duì)卜氏晶囊輪蟲生長生殖的影響鮮有報(bào)道。

本文以卜氏晶囊輪蟲為受試動(dòng)物, 旨在探討在睪丸酮、雌二醇等典型類固醇激素對(duì)卜氏晶囊輪蟲生殖的影響, 分析捕食性種類-晶囊輪蟲對(duì)環(huán)境內(nèi)分泌干擾物的敏感性和可靠性, 為利用輪蟲作為受試動(dòng)物, 開展環(huán)境激素風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和評(píng)價(jià)提供新的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料的培養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)采用卜氏晶囊輪蟲, 體長: 500—800 μm,來自南京采月湖(32°6′35.24″N, 118°18′32.71″E)。在解剖鏡下挑取活力旺盛的非混交雌體作為起始材料, 在實(shí)驗(yàn)室條件下以EPA(去離子水配制, 含96 mg/L NaHCO3, 60 mg/L CaSO4· 2H2O, 60 mg/L MgSO4, 4 mg/L KCl, pH 7.5左右)為培養(yǎng)基進(jìn)行單個(gè)體“克隆”培養(yǎng)[11]。培養(yǎng)光照強(qiáng)度約4000 lx, 晝長比L鯰D=12鯰12, 溫度(25±5)℃, 每天投喂萼花臂尾輪蟲為食物, 食物密度大于50個(gè)/mL, 每天投喂2次。萼花臂尾輪蟲使用濃縮蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)培養(yǎng), 蛋白核小球藻培養(yǎng)方式同楊家新和黃祥飛[12]。

1.2 試驗(yàn)藥品的配置

睪丸酮和雌二醇(純度均＞98%)購于Sigma-Aldrich公司。采用丙酮(分析純)為助溶劑, 分別將睪丸酮、雌二醇配置為10000 mg/L的母液, 再用EPA培養(yǎng)基稀釋為不同濃度梯度的實(shí)驗(yàn)溶液。

1.3 急性毒性實(shí)驗(yàn)

利用1.2母液, 分別配制不同濃度(5、10、15和20 mg/L)的睪丸酮和雌二醇, 隨機(jī)挑取300只非混交雌體幼體(齡期＜4h), 分別放入6孔板中培養(yǎng), 每孔添加5 mL實(shí)驗(yàn)液, 隨機(jī)加入10只個(gè)體。每12h觀察1次, 24h更換培養(yǎng)基。根據(jù)幾率單位法計(jì)算48hLC50。每組設(shè)6個(gè)平行及1個(gè)對(duì)照組。

1.4 激素單一作用效應(yīng)實(shí)驗(yàn)

睪丸酮、雌二醇對(duì)卜氏晶囊輪蟲生殖和壽命的影響隨機(jī)挑取單個(gè)活潑健壯的新生幼體(＜4h), 移入24孔板中培養(yǎng), 每孔加入1 mL濃度為0.5、1、2、4和8 mg/L的實(shí)驗(yàn)液。每4—6h觀察1次, 24h更換培養(yǎng)基。記錄輪蟲第一次產(chǎn)幼時(shí)間、后代幼體個(gè)數(shù)以及母體存活數(shù)。移除剛出生幼體,實(shí)驗(yàn)至全部個(gè)體死亡為止。每組設(shè)12個(gè)平行及1個(gè)對(duì)照組。其他培養(yǎng)條件同1.1。

睪丸酮、雌二醇對(duì)卜氏晶囊輪蟲種群增長率的影響隨機(jī)挑取齡期小于4h的非混交雌體于6孔板中, 每孔4只并加入4 mL實(shí)驗(yàn)液。每組設(shè)6個(gè)平行及1個(gè)對(duì)照組。藥品濃度與培養(yǎng)方法同上。

1.5 睪丸酮和雌二醇組合效應(yīng)實(shí)驗(yàn)

睪丸酮和雌二醇組合定量(8 mg/L)對(duì)卜氏晶囊輪蟲生殖、壽命影響根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn), 睪丸酮與雌二醇濃度為8 mg/L時(shí)對(duì)卜氏晶囊輪蟲生長抑制最為明顯, 設(shè)置組合總實(shí)驗(yàn)濃度為8 mg/L。將睪丸酮和雌二醇按以下方案進(jìn)行混合: T表示睪丸酮, E表示雌二醇, 下標(biāo)為濃度(單位mg/L), 具體組合如下:T0E8、T2E6、T4E4、T6E2和T8E0, 另設(shè)置一個(gè)對(duì)照組T0E0, 每組12個(gè)平行。

睪丸酮和雌二醇組合定量(8 mg/L)對(duì)卜氏晶囊輪蟲種群增長率的影響隨機(jī)挑取齡期小于4h的非混交雌體于6孔板中, 每孔4只并加入4 mL實(shí)驗(yàn)液。每組設(shè)6個(gè)平行及1個(gè)對(duì)照組。藥品濃度與培養(yǎng)方法同上。

1.6 數(shù)據(jù)處理與分析

種群增長率:r=(lnNt-lnN0)/tNt為種群在t時(shí)的種群數(shù)量,N0為起始數(shù)量,T為試驗(yàn)時(shí)間。采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件包對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(One Way ANOVA)。

2 結(jié)果

2.1 睪丸酮、雌二醇的急性毒性實(shí)驗(yàn)

如圖1、圖2, 卜氏晶囊輪蟲暴露在5、10、15和20 mg/L濃度組梯度的睪丸酮中, 處理48h, 其死亡率分別為31.30%、43.80%、70.80% 和72.90%,運(yùn)用概率單位法求得睪丸酮對(duì)卜氏晶囊輪蟲的48hLC50為9.56 mg/L, 直線回歸方程為Y=1.98X+3.06(R2=0.92), 95%置信限為2.74—33.40 mg/L。

卜氏晶囊輪蟲暴露在5、10、15和20 mg/L雌二醇濃度處理48h, 其死亡率分別為28.30%、50.00%、78.30% 和95.00%, 運(yùn)用概率單位法求得雌二醇對(duì)卜氏晶囊輪蟲的48hLC50為8.18 mg/L, 直線回歸方程為Y=3.53X+1.78 (R2=0.92), 95%置信限為3.07—21.77 mg/L。由以上結(jié)果可看出隨睪丸酮與雌二醇濃度升高, 輪蟲死亡率呈上升趨勢(shì)。

圖1 睪丸酮濃度對(duì)數(shù)與輪蟲死亡幾率的關(guān)系Fig. 1 The relationship between probability and logarithmic of testosterone concentrations

圖2 雌二醇濃度對(duì)數(shù)與輪蟲死亡幾率的關(guān)系Fig. 2 The relationship between probability and logarithmic of estradiol concentrations

2.2 睪丸酮和雌二醇對(duì)卜氏晶囊輪蟲生殖、壽命的影響

在睪丸酮處理后, 卜氏晶囊輪蟲平均壽命和后代個(gè)體數(shù)均受到顯著影響(表 1)。方差分析顯示,生殖前期在8 mg/L時(shí), 比對(duì)照組顯著延長11.71%(P＜0.05), 其他組無顯著性變化(P＞0.05)。除0.5 mg/L濃度組之外, 其余各處理組的平均壽命顯著縮短、后代個(gè)體數(shù)明顯減少(P＜0.05)。與對(duì)照組相比, 睪丸酮濃度為1、2、4和8 mg/L時(shí), 平均壽命分別縮短21.91%、35.61%、35.00%和52.22%;后代個(gè)數(shù)分別降低31.63%、69.22%、60.51%和82.20%, 差異顯著(P＜0.05)。

方差分析顯示, 雌二醇為4和8 mg/L處理組的生殖前期比對(duì)照組分別延長6.74% 和7.10%(P＜0.05)。與對(duì)照組相比, 各處理組表現(xiàn)出輪蟲壽命縮短和后代個(gè)體數(shù)減少現(xiàn)象。雌二醇濃度為0.5、1、2、4和8 mg/L時(shí), 輪蟲平均壽命分別縮短21.49%、27.72%、34.58%、39.09%和49.75%; 后代個(gè)數(shù)分別降低24.44%、38.67%、46.22%、49.44%和80.33%, 各處理間差異顯著(P＜0.05)。

2.3 睪丸酮、雌二醇對(duì)卜氏晶囊輪蟲種群增長率的影響

由圖3可以看出, 睪丸酮對(duì)卜氏晶囊輪蟲的種群增長率有顯著影響, 在總體上, 隨著睪丸酮濃度升高,r值呈現(xiàn)下降趨勢(shì), 其中第4天組間差異最為明顯(F=20.17,df組間=5,df組內(nèi)=66,P＜0.001)。 與對(duì)照組相比, 第4天睪丸酮濃度為4和8 mg/L時(shí), 種群增長率為0.74和0.55, 分別比對(duì)照組下降10.77%和33.58%, 差異極其顯著(P＜0.01)。

雌二醇處理組與睪丸酮較為相似(圖4), 卜氏晶囊輪蟲種群增長率呈現(xiàn)顯著差異, 總體上隨著雌二醇濃度升高,r值呈現(xiàn)下降趨勢(shì), 其中第4天組間差異最為明顯(F=25.81,df組間=5,df組內(nèi)=66,P＜0.001)。與對(duì)照組相比, 第4天睪丸酮濃度為1、4和8 mg/L時(shí), 種群增長率為0.80、0.74和0.61, 分別比對(duì)照組下降12.92%、18.70%和33.53%, 差異顯著(P＜0.05)。

2.4 睪丸酮和雌二醇組合對(duì)卜氏晶囊輪蟲生殖、壽命影響

睪丸酮與雌二醇組合對(duì)卜氏晶囊輪蟲生殖前期、平均壽命和后代個(gè)體數(shù)有顯著影響(表 2)。方差分析顯示, 藥物濃度為T0E8、T2E6和T8E0mg/L時(shí),生殖前期顯著延長, 分別比對(duì)照組延長34.17%、48.01%和43.57%(P＜0.05), 其他組無顯著性變化(P＞0.05)。組合濃度為T0E8、T2E6、T4E4、T6E2和T8E0時(shí), 輪蟲平均壽命比對(duì)照組分別縮短32.53%、42.12%、31.56%、35.33%和37.73%; 后代個(gè)數(shù)則分別減少87.89%、89.78%、78.67%、85.22%和86.11%, 差異極其顯著(P＜0.001)。

表 1 睪丸酮和雌二醇對(duì)卜氏晶囊輪蟲生殖前期、平均壽命與產(chǎn)出后代個(gè)數(shù)的影響Tab. 1 The effect of testosterone and estradiol on pre-reproductive period, mean lifespan and fecundity of Asplanchna brightwelli under different concentrations

由表 1、表 2可看出, 8 mg/L睪丸酮的生殖前期為(35.00±1.56)h, 后代個(gè)數(shù)為1.88 ± 0.35, 組合處理組T0E8、T2E6和T8E0輪蟲的生殖前期分別較其延長19.14%、31.43%和27.51%, 產(chǎn)出后代個(gè)數(shù)分別減少42.01%、51.06%和33.51%; 8 mg/L雌二醇的生殖前期為33.20±0.84, 后代個(gè)數(shù)為1.77±0.32, 處理組T0E8、T2E6和T8E0的生殖前期分別延長25.60%、38.55%和34.43%; 產(chǎn)出后代個(gè)數(shù)分別減少38.42%、48.02%和29.38%。

圖3 不同濃度睪丸酮對(duì)卜氏晶囊輪蟲種群增長率的影響Fig. 3 The impact of testosterone with different concentrations on population growth rate of Asplanchna brightwelli

圖4 不同濃度雌二醇對(duì)卜氏晶囊輪蟲種群增長率的影響Fig. 4 The impact of estradiol with different concentration on the population growth rate of Asplanchna brightwelli

2.5 睪丸酮和雌二醇組合對(duì)卜氏晶囊輪蟲種群增長率的影響

由圖5可以看出, 睪丸酮和雌二醇組合對(duì)卜氏晶囊輪蟲的種群增長率的影響顯著, 總體上, 隨著組合中雌二醇睪丸酮濃度升高,r值呈下降趨勢(shì), 其中第5天, 組間差異最為明顯(F=9.71,df組間=5,df組內(nèi)=62,P＜0.001)。與對(duì)照組相比, 第5天, 濃度組為T6E2、T4E4、T8E0、T0E8和T2E6mg/L的種群增長率分別為0.49、0.44、0.41、0.28和0.24, 分別比對(duì)照組減少30.00%、37.14%、41.43%、60.00%和65.71%, 差異極其顯著(P＜0.01)。由此可見, 在睪丸酮與雌二醇組合中, 雌二醇對(duì)卜氏晶囊輪蟲種群存活和繁殖影響更大, 兩者表現(xiàn)出顯著的協(xié)同作用。

3 討論

3.1 睪丸酮和雌二醇單一作用下對(duì)卜氏晶囊輪蟲生殖和種群增長的影響

許多浮游動(dòng)物早期生命階段對(duì)毒物的敏感性較晚期發(fā)育階段高, 胚胎發(fā)育歷時(shí)在輪蟲、枝角類和橈足類都被認(rèn)為是比較敏感性的指標(biāo)之一[13,14]。生殖前期是輪蟲性成熟標(biāo)志, 與平均壽命和后代個(gè)體數(shù)目作為生活史特征參數(shù)來檢測(cè)環(huán)境激素具有重要意義。Halbach[15]提出環(huán)境激素會(huì)降低機(jī)體對(duì)食物攝取、減緩游泳速度以及通過影響各生活史階段歷時(shí)和產(chǎn)卵量, 進(jìn)而影響輪蟲的種群動(dòng)態(tài)。Marcial等[14]研究發(fā)現(xiàn), 當(dāng)敵匹硫磷濃度高于2.5 mg/L時(shí), 褶皺臂尾輪蟲第一次產(chǎn)幼時(shí)間顯著滯后, 高于5 mg/L時(shí), 延遲其產(chǎn)卵時(shí)間并顯著縮短其平均壽命。朱瑋閣等[16]研究發(fā)現(xiàn)1和5 μg/LTBTC能顯著延長萼花臂尾輪蟲生殖前期并縮短其平均壽命。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, 環(huán)境雄激素睪丸酮和雌性激素雌二醇在1—8 mg/L內(nèi)均能降低卜氏晶囊輪蟲種群增長率、減少產(chǎn)出后代個(gè)體數(shù)目、縮短平均壽命, 且表現(xiàn)出明顯劑量效應(yīng), 這與以往觀察結(jié)果相近[14,16,17]。比較產(chǎn)出后代個(gè)體數(shù)目發(fā)現(xiàn), 各處理組后代個(gè)體數(shù)僅相當(dāng)于對(duì)照組的15%—70%, 這意味著睪丸酮和雌二醇對(duì)卜氏晶囊輪蟲的性成熟和生殖行為存在明顯的干擾作用。

表 2 睪丸酮和雌二醇組合定量(8 mg/L)對(duì)卜氏晶囊輪蟲生殖前期、平均壽命與產(chǎn)出后代個(gè)數(shù)的影響Tab. 2 The effect of testosterone and estradiol on pre-reproductive period, mean lifespan and fecundity of Asplanchna brightwelli with a total concentration of 8 mg/L

國內(nèi)外關(guān)于環(huán)境因子和污染物(如除草劑、殺蟲劑和重金屬等)對(duì)輪蟲存活率和繁殖率的研究已有若干報(bào)道, 但對(duì)利用輪蟲評(píng)價(jià)環(huán)境激素類污染物的報(bào)道尚不多見。Radix等[8]研究發(fā)現(xiàn), 當(dāng)乙炔雌二醇和睪丸酮濃度分別高于1.72和8.88 μmol/L時(shí), 萼花臂尾輪蟲的內(nèi)稟增長率顯著下降。 柯麗霞等[18]研究發(fā)現(xiàn)100 μg/L 17β-雌二醇顯著提高萼花臂尾輪蟲種群增長率, 1000 μg/L時(shí)顯著降低其休眠卵產(chǎn)量。許多學(xué)者認(rèn)為, 輪蟲孤雌生殖的過程中生殖前期歷時(shí)和胚胎發(fā)育時(shí)間會(huì)影響其種群增長速率, 生殖前期的延長會(huì)導(dǎo)致種群增長率降低[19,20]。Gama-Flores等[21]認(rèn)為輪蟲暴露時(shí)間和濃度對(duì)種群增長有重要影響。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示睪丸酮和雌二醇濃度高于1 mg/L時(shí), 隨暴露時(shí)間的延長, 卜氏晶囊輪蟲種群增長率呈下降趨勢(shì), 且濃度越高抑制作用越明顯。卜氏晶囊輪蟲生殖前期對(duì)睪丸酮和雌二醇的反應(yīng)并不敏感, 平均壽命與后代個(gè)體數(shù)目間接反應(yīng)種群增長率的變化, 這與以往的研究結(jié)果較為一致[21]。輪蟲繁殖能力下降不僅與其生殖前期延長, 進(jìn)而導(dǎo)致生殖期縮短, 同時(shí)還可能是因?yàn)楦邼舛葎┝坎G丸酮和雌二醇對(duì)輪蟲生理機(jī)能產(chǎn)生了影響, 干擾其內(nèi)分泌系統(tǒng)正常機(jī)能, 對(duì)其種群增長產(chǎn)生的不利影響。這種激素效應(yīng)是否會(huì)隨食物鏈傳遞到高營養(yǎng)級(jí)的魚類尚不得而知, 因此, 利用卜氏晶囊輪蟲作為環(huán)境激素檢測(cè)的標(biāo)志動(dòng)物具有潛在應(yīng)用價(jià)值[22]。

圖5 睪丸酮和雌二醇聯(lián)合定量(8 mg/L)對(duì)卜氏晶囊輪蟲種群增長率的影響Fig. 5 The impact of testosterone and estradiol (8 mg/L) on the population growth rate of A.brightwelli

3.2 睪丸酮與雌二醇組合作用下對(duì)卜氏晶囊輪蟲生殖和種群增長的影響

在自然界中, 環(huán)境污染物影響著物種豐富度、多樣性和生態(tài)系統(tǒng)功能, 它們往往是聯(lián)合發(fā)揮作用,目前關(guān)于單一環(huán)境激素對(duì)輪蟲生殖影響研究的報(bào)道很多, 但以組合形式對(duì)輪蟲的研究的卻很少[23]。Gallardo等[24,25]提出50 mg/L γ-氨基丁酸、0.0025和0.025 IU/mL生長激素、0.25和2.50 IU/mL人體絨毛膜促性腺激素釋放激素以及5 mg/L 5-羥色胺聯(lián)合能顯著提高褶皺臂尾輪蟲種群增長率。張輝等[26]以鯽(Carassius auratus)血漿卵黃蛋白為指標(biāo)并借助數(shù)學(xué)模型, 得出17β-雌二醇和雙酚A毒性固定比例混合物的劑量-效應(yīng)關(guān)系, 發(fā)現(xiàn)混合物的效應(yīng)取決于化合物的性質(zhì)、暴露劑和質(zhì)量比例, 為環(huán)境內(nèi)分泌干擾物在水生生物中的作用機(jī)理提供了很好的科學(xué)依據(jù)。睪丸酮是生物中主要的雄性激素, 是類固醇物質(zhì)[27]; 雌二醇同樣是類固醇物質(zhì), 在雌性生殖中是重要生長激素, 它保持卵母細(xì)胞的活力,又能阻止精細(xì)胞的凋亡[28]。楊家新等[29]提出睪丸酮和孕酮組合定量為1000 μg/L時(shí), 能顯著提高萼花臂尾輪蟲的種群增長率。本研究發(fā)現(xiàn), 與睪丸酮和雌二醇單一濃度為8 mg/L相比, 兩激素組合定量(8 mg/L)中各處理組的生殖前期顯著延長, 后代個(gè)體數(shù)目顯著減少, 種群增長率顯著降低。整體上表現(xiàn)出在組合中隨雌二醇濃度增高, 對(duì)輪蟲生殖抑制越明顯,其中T2E6濃度組最為顯著, 這表明卜氏晶囊輪蟲對(duì)雌二醇更為敏感, 并且2種藥品呈現(xiàn)出協(xié)同作用。

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