竇全偉 李吉濤, 劉 萍, 李 健, 劉九美孫東方 蔡 影 環(huán)朋朋

(1. 大連海洋大學水產(chǎn)與生命學院, 大連 116023; 2. 中國水產(chǎn)科學研究院黃海水產(chǎn)研究所, 農(nóng)業(yè)部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點實驗室, 青島 266071; 3. 青島海洋科學與技術國家實驗室, 海洋漁業(yè)科學與食物產(chǎn)出過程功能實驗室, 青島 266235)

脊尾白蝦(Exopalaemon carinicauda)又名小白蝦、五須蝦、迎春蝦等, 隸屬甲殼綱(Crustacea)、十足目(Decapoda)、長臂蝦科(Palaemonidae)、白蝦屬(Exopalaemon), 系熱溫帶海區(qū)底棲蝦類, 分布于中國大陸沿岸和朝鮮半島西岸的淺海低鹽水域,以黃渤海產(chǎn)量最高, 具有繁殖周期長、生長速度快、環(huán)境適應性廣、食性雜、經(jīng)濟價值高等優(yōu)點[1,2],成為沿海灘涂地區(qū)重要的特色水產(chǎn)養(yǎng)殖品種。

近20年來, 隨著池塘養(yǎng)殖規(guī)模的迅速擴大, 脊尾白蝦顯示出明顯的養(yǎng)殖前景, 然而細菌及病毒疾病的爆發(fā)給蝦類養(yǎng)殖造成了嚴重的經(jīng)濟損失, 針對蝦類非特異性免疫防御機制的研究正在廣泛開展[3]。研究表明, 血藍蛋白不僅具有輸氧功能, 而且還具有酚氧化物酶活性[4]、抗病毒活性[5]、凝集活性[6]和抑菌活性[7]等多種免疫學功能, 被認為是一種具有多種非特異性免疫活性的多功能蛋白。目前, 隨著對甲殼動物血藍蛋白功能的深入研究, 其cDNA序列已相繼被克隆[8—10]。研究表明凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)具有大小兩個血藍蛋白亞基[11],且感染哈維氏弧菌后的血藍蛋白mRNA的表達量呈上調趨勢[12]。脊尾白蝦血藍蛋白基因小亞基的克隆工作已經(jīng)完成[10], 而大亞基的研究未見報道。本研究通過RACE技術(Rapid Amplification of cDNA Ends)克隆了脊尾白蝦血藍蛋白大亞基基因的cDNA全長, 并分析了金黃色葡萄球菌、副溶血弧菌及白斑綜合征病毒(WSSV)感染后該基因的表達變化, 為進一步深入了解血藍蛋白基因在免疫防御中作用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

取體長(4.5±0.25) cm、(2.19±0.42) g的健康脊尾白蝦, 飼養(yǎng)于200 L的PVC桶中, 暫養(yǎng)7d進行實驗,實驗期為3d。選取暫養(yǎng)的健康脊尾白蝦1200尾(每桶100尾)分為4個組, 設金黃色葡萄球菌感染組、副溶血弧菌感染組、WSSV感染組和對照組, 每組3個平行, 分別進行細菌感染和病毒感染實驗。

菌懸液的制備配制2216E (液體成分: 蛋白胨母膏, 磷酸高鐵; 固體成分加瓊脂粉)和胰蛋白大豆肉湯(TSB)液體及固體培養(yǎng)基, 滅菌備用。將副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)菌種(本實驗室保存)接種于2216E液體培養(yǎng)基中, 28℃培養(yǎng)過夜。于2216E固體培養(yǎng)基上劃線純化1次; 選取單菌落接種于2216E液體培養(yǎng)基中, 28℃ 200 r/min搖床上培養(yǎng)8—10h, 使活菌數(shù)在108CFU/mL左右。將菌懸液離心, 棄上清液, 用生理鹽水對菌體進行反復洗滌,重懸后, 使菌體的濃度達108CFU/mL。

將金黃色葡萄球菌(Stphylococcus aureus)(本實驗室保存)接種于TSB液體培養(yǎng)基中, 37℃培養(yǎng)過夜。于TSB固體培養(yǎng)基上劃線純化1次; 選取單菌落接種于TSB液體培養(yǎng)基中, 37℃ 180 r/min搖床上培養(yǎng)12h, 使活菌數(shù)在108CFU/mL左右。將菌懸液離心, 棄上清液, 用生理鹽水對菌體進行反復洗滌,重懸后, 使菌體的濃度達108CFU/mL。

WSSV 粗提液的制備取感染W(wǎng)SSV的脊尾白蝦病蝦(本實驗室保存) 頭尖組織5 g, 加入適量(800 μL) 4℃預冷的磷酸鹽緩沖液(1×PBS), 20000 r/min冰浴勻漿, 將獲得的勻漿液于4℃ 3000 r/min離心15min, 取上清液反復離心3次(4000、6000、8000 r/min各15min), 將所得的上清液用0.45 μm濾膜過濾除菌, 將除菌的粗提液稀釋100倍(3.7×107copy/mL)進行分裝并保存于 -80℃冰箱中備用。

實驗時將菌懸液、WSSV粗提液用微量注射器從脊尾白蝦的第2腹節(jié)處注入(20 μL/尾)。對照組注射pH為7.4的1×PBS緩沖液(20 μL/尾)。在注射后的6h、12h、24h、48h、72h取樣, 每個時間點各取5尾蝦, 取血液、肝胰腺、鰓、肌肉等組織, 用于總RNA提取。

1.2 脊尾白蝦總RNA提取及cDNA合成

脊尾白蝦組織總RNA提取利用TRIzol試劑(Invitrogen公司), 用核酸定量儀(Thermo, NanoDrop 2000)和1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的質量及完整性。使用DNaseⅠ RNase-free (Fermentas)試劑盒去除提取的總RNA中殘留的DNA。

cDNA合成體系(20 μL): 10 μL總RNA, 2 μL Oligo dT (50 μmol/L), 72℃水浴5min, 冰浴2min, 瞬時離心數(shù)秒使溶液聚集于管底; 之后再向管中加入1.0 μL dNTP Mixture (each 10 mmol/L)、5×M-MLV Buffer 4.0 μL、0.5 μL RNase Inhibitor (40 μL/mL,TaKaRa)和1.0 μL M-MLV反轉錄酶(TaKaRa), 用DEPC水補足體積; PCR儀上42℃孵育lh; 72℃孵育15min; 4℃孵育20min。合成的cDNA用于后期脊尾白蝦血藍蛋白基因的克隆及Real-time PCR檢測。脊尾白蝦3′和5′RACE模板的合成根據(jù)SMARTTM RACE Amplification Kit說明書進行。

1.3 脊尾白蝦血藍蛋白大亞基基因cDNA中間片段克隆

根據(jù)從GenBank獲得的凡納濱對蝦血藍蛋白基因(AJ250830.1)、斑節(jié)對蝦(Penaeus monodon)血藍蛋白基因(AF4317371)、日本沼蝦(Macrobrachium mipponensis)血藍蛋白基因(KF431830)序列設計簡并引物HcL-F和HcL-R (上海生工生物工程有限公司合成)(表 1)。PCR反應體系(20 μL): TransTaq?HiFi Polymerase (5 U/μL) 0.2 μL, 10×TransTaqHiFi Buffer Ⅱ 2 μL, 2.5 mmol/L dNTPs 1.6 μL, HcLF 1 μL, HcLR 1 μL, 脊尾白蝦cDNA模板2 μL, ddH2O 12.2 μL。反應程序: 94℃ 5min; 94℃ 30s, 58℃ 30s,72℃ 30s, 35個循環(huán); 72℃ 10min; 4℃保存。1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測后, 用DNA膠回收試劑盒(北京天根生化科技有限公司)純化PCR擴增特異性產(chǎn)物,連接到pMD18-T (TaKaRa)載體上, 重組載體轉化到大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細胞(北京天根生化科技有限公司)中, 挑取陽性克隆子進行菌液PCR驗證后測序。

表 1 本研究所用引物序列Tab. 1 Primers used in this study

1.4 脊尾白蝦血藍蛋白大亞基cDNA 5′和3′末端的擴增

根據(jù)測序得到的中間序列設計5′ RACE引物(5HcL-1、5HcL-2)和3′ RACE引物(3HcL-1、3HcL-2)(表 1)擴增脊尾白蝦大亞基血藍蛋白基因cDNA全長序列。按照SMARTTMcDNA Amplification Kit(Clontech)說明書推薦的反應體系及反應條件進行5′ RACE和3′ RACE擴增。PCR擴增產(chǎn)物的純化、克隆及測序同上所述。

1.5 序列分析

將測序結果去載體后, 采用ContigExpress進行5′和3′序列拼接, 用NCBI BLAST (http://blast.ncbi.nlm.gov/Blast.cgi)網(wǎng)頁進行序列比對及結構域預測,用SignalP 4.0軟件分析信號肽, 采用DNAMAN軟件進行不同來源的血藍蛋白的氨基酸序列多序列比對, 用MEGA 6.0軟件[13]中的Neighbor-joining法[14]構建系統(tǒng)樹。

1.6 EcHcL基因組織分布特征分析

根據(jù)脊尾白蝦血藍蛋白EcHcL基因設計正反向引物(QEcHcL-F/R)(表 1), 用于Real-time PCR檢測。按照前述選擇6尾健康的脊尾白蝦, 取其鰓、卵巢、肝胰腺、心臟、腸、肌肉、胃、腹神經(jīng)節(jié)、眼柄、血細胞用于各組織RNA的提取及cDNA的合成。利用Real-time PCR檢測不同組織中EcHcL基因的分布情況。使用SYBR Premix ExTaqⅡ 試劑(TaKaRa), Applied Biosystems 7500 Real Time PCR儀上進行, 反應體系為10 μL: 5 μL SYBR Premix ExTaqⅡ、1 μL cDNA、0.4 μL正反向引物、0.2 μL ROX Reference dye Ⅱ 及3 μL ddH2O。反應程序為95℃ 10min; 95℃ 30s, 95℃ 5s, 60℃ 34s,40個循環(huán); 95℃ 15s; 60℃ 1min; 95℃ 15s。以βactin基因作為內(nèi)參基因, 樣本和內(nèi)參均設置3個平行, 采用2-ΔΔCt方法[15]計算EcHcL基因的相對表達量。

圖1 脊尾白蝦EcHcL血藍蛋白結構域位置Fig. 1 Three domains of EcHcL hemocyanin

1.7 副溶血弧菌和金黃色葡萄球菌感染脊尾白蝦后血藍蛋白基因EcHcL的表達分析

分別提取副溶血弧菌和金黃色葡萄球菌感染后不同時間脊尾白蝦的肝胰腺和血細胞組織的RNA, 按照前述方法逆轉錄合成cDNA進行Realtime PCR, 以β-actin基因作為內(nèi)參基因, 樣本和內(nèi)參均設置3個平行, 檢測細菌感染下的脊尾白蝦血細胞和肝胰腺中EcHcL基因在不同時間點的表達情況。反應體系、反應程序及數(shù)據(jù)分析如1.6所述。

1.8 白斑綜合征病毒感染后脊尾白蝦EcHcL的表達分析

提取WSSV感染后不同時間脊尾白蝦血細胞和肝胰腺組織的RNA, 按照前述方法反轉錄合成cDNA進行Real-time PCR。反應體系、反應程序及數(shù)據(jù)處理同如1.6所述。

2 結果

2.1 脊尾白蝦血藍蛋白大亞基因cDNA全長的克隆及序列分析

采用RACE方法和RT-PCR擴增獲得脊尾白蝦血藍蛋白大亞基基因cDNA全長, 命名為EcHcL(GenBank登錄號: MFID143190)。EcHcL序列分析顯示全長2192 bp, 包括2034 bp的開放閱讀框(ORF)、5′端非編碼區(qū)(UTP) 21 bp和137 bp的3′非編碼區(qū), 其中包括1個終止子TAG和多聚腺苷酸PolyA尾(加尾信號AATAAA)。氨基酸序列分析顯示,EcHcL編碼677個氨基酸, 預測分子量為78.5 kD,理論等電點(PI)為5.41。Signal P 4.0 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)分析顯示此氨基酸序列N端前21個氨基酸組成信號肽。SMART(Simple Modular Architecture Research Tool)軟件分析表明, 脊尾白蝦EcHcL血藍蛋白含有3個結構域:Hemocyanin_N (25-147aa)、Hemocyanin_M (154-411aa)、Hemocyanin_C (420-668aa)(圖1)。Hemoeyanin-M結構域中的兩個銅離子結合位點含6個保守的組氨酸殘基H218、H222、H249、H372、H376、H414。

2.2 EcHcL氨基酸序列比對同源性分析

使用NCBI BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) 對脊尾白蝦EcHcL基因編碼的氨基酸序列與其他物種的血藍蛋白氨基酸序列進行同源性比較, 結果發(fā)現(xiàn)其與日本沼蝦(Macrobrachium nipponense)同源性最高達到87%, 與凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)、斑節(jié)對蝦(Penaeus monodon)、日本囊對蝦(Marsupenaeus japonicus)同源性分別為73%、72%、71%, 與疣酋婦蟹(Eriphia verrucosa)、中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis)、斑點海虱(Eurydice pulchra)的同源性分別為68%、67%、63%。將多個物種的血藍蛋白Hemocyanin_M結構域比對發(fā)現(xiàn), 這些氨基酸序列都相對保守, 同源性達到90.97%, 并且均含有兩個銅離子結合位點。

2.3 EcHcL氨基酸序列系統(tǒng)進化分析

利用MEGA 6.0軟件對脊尾白蝦EcHcL基因氨基酸序列進行系統(tǒng)進化分析, 并構建系統(tǒng)進化樹(圖2)。結果顯示17個物種中, 脊尾白蝦EcHcL與日本沼蝦、大和米蝦(Caridina multidentata)血藍蛋白、日本囊對蝦、斑節(jié)對蝦、凡納濱對蝦、中國對蝦(Fenneropenaeus chinensis)等動物的血藍蛋白為一個亞群。與中華絨螯蟹、疣酋婦蟹、珍寶蟹(Metacarcinus magister)、藍蟹(Callinectes sapidus)、擬穴青蟹(Scylla paramamosain)為另一個亞群。EcHcL在進化上與日本沼蝦的親緣關系最近, 與信號小龍蝦(Pacifastacus leniusculus)、斑點海虱、蛀木水虱(Limnoria quadripunctata)、鉤蝦(Gammarus roeselii)、木紋網(wǎng)球蝦(Atyopsis moluccensis)、蟬形齒指蝦蛄(Odontodactylus scyllarus)等動物的血藍蛋白親緣關系較遠。

2.4 EcHcL基因在不同組織中的表達分析

利用RT-PCR分析EcHcL基因在不同組織中的表達水平, 結果顯示,EcHcL基因在脊尾白蝦鰓、卵巢、肝胰腺、心臟、腸、肌肉、胃、腹神經(jīng)節(jié)、眼柄、血細胞中均有表達, 其中, 肝胰腺中表達量最高, 其次為血細胞, 在腹神經(jīng)節(jié)、心臟、腸、鰓、卵巢、肌肉、胃、眼柄中表達量較低(圖3)。

圖2 MEGA 6.0軟件構建的基于EcHcL氨基酸序列的NJ系統(tǒng)進化樹Fig. 2 NJ phylogenetic tree based on EcHcL amino acid sequence by MEGA 6.0

2.5 感染后EcHcL基因在肝胰腺及血細胞中的表達分析

如圖4所示, 脊尾白蝦感染金黃色葡萄球菌、副溶血弧菌、WSSV后, 脊尾白蝦肝胰腺中EcH-cL基因表現(xiàn)出一定的時間依賴性, 總體趨勢表現(xiàn)為先升高后降低。EcHcL表達量在金黃色葡萄球菌感染后48h達到峰值, 與對照組有顯著性差異(P＜0.05), 到72h下降到與對照組無顯著性差異(P＞0.05)。EcHcL表達量在副溶血弧菌感染后12h達到峰值,與對照組差異極顯著(P＜0.01), 24h后表達量持續(xù)下降, 到72h下降到與對照組無顯著性差異(P＞0.05)。感染W(wǎng)SSV后,EcHcL在肝胰腺內(nèi)表達量在12h達到最大值, 并與對照組差異極顯著(P＜0.01)。如圖5所示, 感染金黃色葡萄球菌、副溶血弧菌、WSSV后,脊尾白蝦血細胞中血藍蛋白EcHcL基因表達量表現(xiàn)出先升高后下降的趨勢, 均在24h達到峰值, 并且金黃色葡萄球菌感染組和WSSV感染組與對照組相比有顯著性差異(P＜0.05), 副溶血弧菌感染組與對照組相比差異極顯著(P＜0.01)。

3 討論

3.1 EcHcL基因cDNA全長的克隆及序列分析

血藍蛋白是位于甲殼動物血淋巴中的含銅呼吸蛋白, 它通過與氧氣的可逆結合滿足集體的氧需求, 結合氧狀態(tài)與銅結合為藍色, 脫氧狀態(tài)與銅脫離為無色。本實驗成功克隆了脊尾白蝦血藍蛋白大亞基基因, 預測編碼蛋白分子量為78.5 kD, 與已分離的日本沼蝦、凡納濱對蝦血藍蛋白大亞基分子量類似[11,16]。研究表明, 典型的甲殼動物血藍蛋白是由氨基酸數(shù)為630—660、分子量為70—80 kD的異源亞基構成的六聚體, 六聚體中每個亞基折疊為三個結構域, 其中第一、三結構域分別為亞基蛋白的N、C端, 第二結構域含血藍蛋白的活性部位,活性部位結合有兩個銅離子, 每個銅離子分別與蛋白質鏈上三個組氨酸結合[17]。在本實驗中, SMART結果顯示, 脊尾白蝦血藍蛋白大亞基含有3個結構域: Hemocyanin_N (25—147aa)、Hemocyanin_M(154—411aa)、Hemocyanin_C (420—668aa) 和Hemoeyanin-M結構域中的兩個銅離子結合位點含6個保守的組氨酸殘基H218、H222、H249、H372、H376和H414。氨基酸序列比對結果顯示, 銅離子結合區(qū)相似性較高, 說明該血藍蛋白銅結合區(qū)在進化上相對保守。系統(tǒng)進化分析結果顯示EcHcL與日本沼蝦血藍蛋白親緣關系最近, 疣酋婦蟹、中華絨螯蟹、斑點海虱等甲殼動物的血藍蛋白親緣關系次之。

圖3 EcHcL基因在脊尾白蝦不同組織中的表達Fig. 3 EcHcL expression level in different tissues of E. carinicauda

圖4 EcHcL基因在脊尾白蝦肝胰腺組織中的表達變化Fig. 4 Relative expression of EcHcL in hepatopancreas of E. carinicauda

圖5 EcHcL基因在脊尾白蝦血細胞中的表達變化Fig. 5 Relative expression of EcHcL in haemocytes of E. carinicauda

3.2 EcHcL基因在不同組織中的表達分析

本實驗對EcHcL在不同組織中的表達量進行了測定, 發(fā)現(xiàn)EcHcLmRNA的表達組織分布廣泛且具有組織特異性, 在肝胰腺最高, 血細胞次之, 與凡納濱對蝦[18]、中國對蝦[8]的研究結果一致。此研究支持了肝胰腺是甲殼動物血藍蛋白的主要合成器官的觀點[19]。

3.3 感染后EcHcL基因的表達分析

近年來的研究發(fā)現(xiàn), 血藍蛋白具有載氧功能外,還具有凝集活性、酚氧化酶活性、抗菌和抗病毒等作用。目前的研究結果認為血藍蛋白是構成甲殼動物免疫防御體系的重要成員之一[20]。章躍陵等[21,22]研究發(fā)現(xiàn)血藍蛋白蛋白斑點的肽質量譜峰值可以與流感病毒的血凝素相匹配, 提示血藍蛋白可能具有凝集活性; 并發(fā)現(xiàn)血清中與溶藻酸弧菌、哈維氏弧菌、嗜水氣單胞菌和金黃色葡萄球菌等4種病原菌直接結合的蛋白是血藍蛋白, 提示血藍蛋白具有一定的抗菌活性, 并首次證明了血藍蛋白具有非特異性抗病毒作用[23]。Lee等[24]研究發(fā)現(xiàn)信號小龍蝦血藍蛋白在酸性環(huán)境下能水解產(chǎn)生抗菌肽, 對革蘭氏陽性菌和陰性菌都有很強的抑制作用。綜上所述, 血藍蛋白及其降解片段在蝦類的免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的作用。在本實驗中, 脊尾白蝦肝胰腺和血細胞血藍蛋白基因EcHcL基因在金黃色葡萄球菌、副溶血弧菌刺激后, 其表達量表現(xiàn)出一定的時間依賴性, 總體趨勢表現(xiàn)為先升高后降低。肝胰腺和血細胞EcHcL表達量在金黃色葡萄球菌感染后24h內(nèi)發(fā)生輕微浮動, 在48h達到最大值,約是對照組的2倍, 隨后下降到與對照組無顯著差異(P＞0.05), 與Lu等[25]研究發(fā)現(xiàn)注射金黃色葡萄球菌后, 凡納濱對蝦血藍蛋白基因在肝胰腺中表達量增加顯著結果相一致, 提示血藍蛋白具有抗菌作用;血細胞EcHcL表達量在金黃色葡萄球菌感染后24h達到最大值, 約是對照組的2倍, 可能由于球菌的感染激活了血藍蛋白的免疫活性, 促進血藍蛋白基因的表達, 之后顯著降低, 可能由于蝦血細胞體液免疫將異物排除體外。脊尾白蝦在受到副溶血弧菌感染后, 肝胰腺EcHcL表達量隨著時間增加而增加,在注射12h達到最大值, 約是對照組的8倍, 隨后逐漸下降, 72h恢復到與對照組相當, 與李彥飛[26]研究發(fā)現(xiàn)凡納濱對蝦血藍蛋白p77亞基在注射病原菌后,12h達到表達量達到最大值之后下調趨勢一致, 提示血藍蛋白在蝦類免疫防御體系中具有抗菌作用;血細胞EcHcL表達量在24h達到最大值, 約是對照組的3倍, 隨后逐漸下降, 在72h與對照組無顯著性差異(P＞0.05), 與楊留冰[27]研究發(fā)現(xiàn)注射球菌及弧菌24h后凡納濱對蝦血漿血藍蛋白亞基表達量達到最大值之后下調趨勢一致, 提示血藍蛋白具有抗菌作用。經(jīng)金黃色葡萄球菌及副溶血弧菌感染脊尾白蝦后, 在感染后期EcHcL表達量恢復到正常水平(圖3), 推測病原菌的入侵激活了脊尾白蝦的免疫防御體系, 血藍蛋白及血細胞等免疫因子的共同作用先將病原菌清除[28]。

白斑綜合征病毒是蝦類主要的病毒性疾病之一, 給蝦類養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失[29,30], 因此越來越多的學者對蝦類抗病毒展開研究。近十幾年來研究表明, 對蝦血藍蛋白具有抗病毒活性。Zhang等[21]將凡納濱對蝦血藍蛋白分離為分子質量為73 kD和75 kD的兩種亞基, 并首次證明血藍蛋白具有非特異性抗病毒作用。Lei等[31]研究發(fā)現(xiàn)血藍蛋白能與WSSV和虹彩病毒(Singapore Grouper Irido Virus, SGIV)結合揭示血藍蛋白具有抗病毒功能。在本實驗中, 脊尾白蝦肝胰腺及血細胞EcH-cL基因在WSSV感染后, 與對照組相比具有時空表達模式, 表達量先升高后降低, 分別在12h和24h達到最高值, 分別約是對照組的4倍和2倍, 與Xu等[32]研究發(fā)現(xiàn)凡納濱對蝦人工感染W(wǎng)SSV后血藍蛋白基因在肝胰腺中的表達上調趨勢一致, 表明血藍蛋白在蝦類的免疫防御中還具有抗病毒的作用。WSSV感染脊尾白蝦前期在肝胰腺組織及血細胞中的EcHcL基因表達量持續(xù)增加, 可能因為病毒的復制刺激了血藍蛋白的合成促進了免疫應答;感染后期, WSSV的擴增進入對數(shù)期, 抑制了脊尾白蝦的免疫防御系統(tǒng), 使EcHcL表達量持續(xù)下降。

本實驗對脊尾白蝦血藍蛋白大亞基基因cDNA全長進行了克隆分析, 并研究了其在病原菌及病毒的感染下的表達規(guī)律, 發(fā)現(xiàn)感染后基因表達呈現(xiàn)特定的時空表達模式, 進一步證明了血藍蛋白具有抗菌和抗病毒雙重作用, 為深入研究血藍蛋白在對蝦免疫防御系統(tǒng)中的作用積累了資料。

[1]Li M Y. An approach to the reproduction and growth of shrimpExopalaemon carinicaudacultured in earthen ponds with reference to its maximum sustaining yield on catch rotation [J].Journal of Fisheries of China, 1994,18(2): 85—92 [李明云. 池養(yǎng)脊尾白蝦的繁殖, 生長及其最大持續(xù)輪捕量的初步探. 水產(chǎn)學報, 1994, 18(2):85—92]

[2]Liang J P, Li J, Liu P,et al. Research progress of biological characteristics and artificial breeding of ridgetail white prawn,Exopalaemon carinicauda[J].Chinese Agricultural Science Bulletin, 2012, 28(17): 109—116 [梁俊平, 李健, 劉萍, 等. 脊尾白蝦生物學特性與人工繁育的研究進展. 中國農(nóng)學通報, 2012, 28(17): 109—116]

[3]Roch P. Defense mechanisms and disease prevention in farmed marine invertebrates [J].Aquaculture, 1999,172(1-2): 125—145

[4]Yan F, Zhang Y L, Luo H Q,et al. The phenoloxidase activity of hemocyanin from white leg shrimpLitopenaeus vannamei[J].Fish Science, 2008, 27(1): 5—8

[5]Zhang X, Huang C, Qin Q. Antiviral properties of hemocyanin isolated from shrimpPenaeus monodon[J].Antiviral Research, 2004, 61(2): 93—99

[6]Zhang Y L, Chen J, Lin B K,et al. An attempt to study the agglutinative activity of hemocyanin in shrimpPenaeus vannameiwith several kinds of erythrocyte [J].Journal of Shantou University(Natural Science), 2005,20(3): 48—53 [章躍陵, 陳俊, 林伯坤, 等. 南美白對蝦血藍蛋白血細胞凝集活性初探. 汕頭大學學報(自然科學版), 2005, 20(3): 48—53]

[7]Zhang X Y, Lin X M, Zhang Y L,et al. Comparative analysis of hemolytic activity of hemocyanin isomers binding to different bacteria in shrimpLitopenaeus vanname[J].Acta Hydrobiologica Sinica, 2013, 37(6):1079—1084 [張小瑜, 林曉敏, 章躍陵, 等. 與不同病原菌相結合的凡納濱對蝦血藍蛋白溶血活性對比分析.水生生物學報, 2013, 37(6): 1079—1084]

[8]Sun J, Wang B J, Sun S J,et al. cDNA cloning and sequence analysis of hemocyanin inFenneropenaeus chinensis[J].Marine Fisheries Research, 2010, 31(1):80—88 [孫杰, 王寶杰, 孫姝娟, 等. 中國明對蝦血藍蛋白基因cDNA的克隆與序列分析. 漁業(yè)科學進展, 2010,31(1): 80—88]

[9]Wang W F, Xia X C, Wang X S,et al. Molecular cloning and expression analysis of hemocyanin gene fromMacrobrachium nipponense[J].Acta Anatomica Sinica, 2012,43(2): 214—219 [王文鋒, 夏西超, 王雪參, 等. 日本沼蝦血藍蛋白基因cDNA全長克隆及表達分析. 解剖學報,2012, 43(2): 214—219]

[10]Yu G, Li J, Li J T,et al. cDNA cloning and expression analysis of hemocyanin inExopalaemon carinicauda[J].Marine Fisheries Research, 2012, 33(6): 74—80 [于戈,李健, 李吉濤, 等. 脊尾白蝦血藍蛋白基因cDNA的克隆與表達分析. 漁業(yè)科學進展, 2012, 33(6): 74—80]

[11]Zhang X L. Single nucleotide polymorphism (SNPs) of hemocyanin Ig-like region inLitopenaeus vannamei[D].Thesis for Master of Science, Shantou University,Shantou. 2010 [趙憲亮. 凡納濱對蝦血藍蛋白Ig-like區(qū)單核苷酸多態(tài)性(SNPs)的研究. 碩士學位論文, 汕頭大學, 汕頭. 2010]

[12]Pan L Q, Jin C X. A review on hemocyanins of crustacean [J].Journal of Fisheries of China, 2008, 32(3):484—490 [潘魯青, 金彩霞. 甲殼動物血藍蛋白研究進展. 水產(chǎn)學報, 2008, 32(3): 484—490]

[13]Tamura K, Peterson D, Peterson N,et al. MEGA5: molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods [J].Molecular Biology & Evolution, 2011,28(10): 2731—2739

[14]Saitou N, Nei M. The neighbor-joining method a new method for reconstructing phylogenetic trees [J].Molecular Biology and Evolution, 1987, 4(4): 406—425

[15]Livak K J, Schmittgen T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C (T)) method [J].Methods, 2001, 25(4):402—408

[16]Li C P, Huang H, Wang F,et al. Agglutinative and antibacterial activity of the peptides hydrolyzed fromLitopenaeus vannameihemocyanin with trypsin [J].Acta Hydrobiologica Sinica, 2017, 41(5): 1042—1047 [李長平, 黃河, 王帆, 等. 凡納濱對蝦血藍蛋白酶解多肽的凝集與抑菌活性. 水生生物學報, 2017, 41(5): 1042—1047]

[17]Burmester T. Origin and evolution of arthropod hemocyanins and related proteins [J].Journal of Comparative Physiology B, 2002, 172(2): 95—107

[18]Daniel S, Soasig L, Alain V W. Molecular cloning of hemecyanin cDNA fromPenaeus vannamei(Crustaceu,Decapoda): structure, evolution and physiological aspects[J].FEBS Letters, 1997, 407(2): 153—158

[19]Gellissen G, Hennecke H, Spindler K D. The site of synthesis of hemocyanin in the crayfishAstacus leptodactylus[J].Experientia, 1991, 47(2): 194—195

[20]Fenmndo L, Gareia C, Keni C,et al. Phenoloxidmm activity of hemecyanin in whiteleg shrimpPenaeus vannamei: conversion, characterization of catalytic properties, and role in postmortem melanosis [J].Agricultural Food Chemistry, 2008, 56(15): 6454—6459

[21]Zhang Y L, Lin B, Chen J,et al. Bacterial agglutinative activity of hemocyanin in shrimpLitopenaeus vannamei[J].Journal of Fishery Sciences of China, 2006, 13(6):1006—1011

[22]Zhang Y L, Zhuo Y M, Zhu Y F,et al. Identification of two type of main differential proteins in white leg shrimpLitopenaeus vannameiinfected by pathogenic bacteriaVibrio alginolyticus[J].Fisheries Science, 2005, 24(6):19—23 [章躍陵, 卓奕明, 朱永飛, 等. 凡納濱對蝦人工感染細菌后肝胰臟中主要變化蛋白的研究. 水產(chǎn)科學,2005, 24(6): 19—23]

[23]Zhang Y L, Wang S Y, Xu A L,et al. Affinity proteomic approach for identification of an IgA-like protein inLitopenaeus vannameiand study on its agglutination characterization [J].Journal of Proteome Research, 2006,5(4): 815—821

[24]Lee S Y, Lee B L, S?derh?ll K. Processing of an antibacterial peptide from hemocyanin of the freshwater crayfishPacifastacus leniusculus[J].Journal of Biological Chemistry, 2003, 278(10): 7927

[25]Lu X, Lu H, Guo L,et al. Cloning and characterization of a novel hemocyanin variant LvHMCV4 from shrimpLitopenaeus vannamei[J].Fish & Shellfish Immunology,2015, 46(2): 398—405

[26]Li Y F. Effects of injection of pathogenic bacteria and salinity on hemocyanin synthesis and phenoloxidase activity inLitopenaeus vannamei[D]. Thesis for Master of Science, Ocean University of China, Qingdao. 2009 [李彥飛. 注射病原菌, 鹽度變化對凡納濱對蝦血藍蛋白合成, 酚氧化酶活性的影響. 中國海洋大學, 青島. 2009]

[27]Yang L B. Preliminary study on the immune function of hemocyanin inLitopenaeus vannamei[D]. Thesis for Master of Science, Ocean University of China, Qingdao.2013 [楊留冰. 凡納濱對蝦血藍蛋白免疫作用的初步研究. 中國海洋大學, 青島. 2013]

[28]Guo Z X, Feng J, Wang J Y. Clearance ofVibrio anguillarumby haemocytes in giant black tiger shrimpPenaeus monodonin vivo [J].Journal of Fishery Sciences of China, 2006, 13(1): 28—32 [郭志勛, 馮娟, 王江勇. 斑節(jié)對蝦血淋巴細胞對鰻弧菌的清除作用. 中國水產(chǎn)科學,2006, 13(1): 28—32]

[29]Soto M A, Shervette V R, Lotz J M. Transmission of white spot syndrome virus (WSSV) toLitopenaeus vannameifrom infected cephalothorax, abdomen, or whole shrimp cadaver [J].Diseases of Aquatic Organisms, 2001,45(2): 81—87

[30]Li H M, Jiang X, Liu Z H,et al. Real-time fluorescence loop mediated isothernal amplification for the rapid detection of white spot syndrome virus [J].Acta Hydrobiologica Sinica, 2015, 39(1): 142—148 [李紅梅, 江曉, 劉助紅, 等. 白斑綜合癥病毒實時熒光LAMP檢測方法的建立及應用. 水生生物學報, 2015, 39(1): 142—148]

[31]Lei K, Li F, Zhang M,et al. Difference between hemocyanin subunits from shrimpPenaeus japonicusin anti-WSS defense [J].Developmental & Comparative Immunology, 2008, 32(7): 808—813

[32]Xu J X, Ruan L W, Li Z,et al. Characterization of four hemocyanin isoforms inLitopenaeus vannamei[J].Acta Oceanologica Sinica, 2015, 34(2): 36—44