上官夢(mèng)原，趙 菁，陳俊宇，楊艷榮，張佳悅，趙淑華

(1.吉林大學(xué)第二醫(yī)院婦產(chǎn)科，吉林 長(zhǎng)春 130041； 2.延邊大學(xué)附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，吉林 延吉 133000；3.吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)系，吉林 長(zhǎng)春 130021)

鉑類(lèi)是治療卵巢癌的主要化療藥物，但其選擇性差、不良反應(yīng)作用強(qiáng)，長(zhǎng)期應(yīng)用易產(chǎn)生耐藥。高復(fù)發(fā)率和復(fù)發(fā)后的高耐藥率已嚴(yán)重影響卵巢癌的化療效果和長(zhǎng)期生存率。近年來(lái)，中藥治療以其毒性低、效率高的優(yōu)勢(shì)成為卵巢癌輔助治療手段之一。大量研究[1-6]表明：中藥五味子有效成分可能通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)凋亡、抗氧化、逆轉(zhuǎn)耐藥、提高免疫力和減輕化療不良反應(yīng)等方面發(fā)揮抗腫瘤作用。隨著五味子抗腫瘤作用研究的日益深入，五味子已成為抗腫瘤中藥的研究熱點(diǎn)。五味子具有多種活性成分[7]，以往研究多集中在五味子多糖及木脂素類(lèi)，如五味子乙素(schisandrin B)、五味子醇甲(schizandrin)、五味子醇乙(aomisin)和五味子酯A(schisantherin A)等。本研究選取五味子化學(xué)成分五味子脂A(gomisin A,GA)作為研究對(duì)象，觀察其與卡鉑(carboplatin,CBP)聯(lián)合應(yīng)用對(duì)卵巢癌Skov3細(xì)胞凋亡的影響，并初步探討其作用機(jī)制，為更加合理、有效的臨床卵巢癌化療方案提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株和主要試劑人卵巢漿液性乳頭狀囊腺癌細(xì)胞株Skov3由吉林大學(xué)前列腺疾病防治中心保存。GA(純度98%)購(gòu)于上海源葉生物制品有限公司，注射用CBP注射液為齊魯制藥有限公司生產(chǎn)，IMDM 培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibico公司，JC-1購(gòu)于碧云天生物技術(shù)研究所，Annexin Ⅴ-FITC/PI凋亡試劑盒購(gòu)于天津三箭生物技術(shù)有限公司，RT-PCR試劑盒購(gòu)于大連寶信生物工程有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和分組人卵巢癌Skov3細(xì)胞用含10% FBS 的IMDM培養(yǎng)液，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔3 d傳代1次，傳代比率1∶3，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期狀態(tài)良好的細(xì)胞進(jìn)行研究。研究分兩步：首先選擇不同濃度GA和CBP(GA濃度分別為0、0.01、0.02、0.04、0.08和0.16 μmol·L-1，CBP濃度分別為0、4、8、16、32和64 mg·L-1)單獨(dú)應(yīng)用和分別組合后觀察其對(duì)Skov3細(xì)胞增殖能力的影響；然后根據(jù)其結(jié)果選擇聯(lián)合用藥的合適濃度，將細(xì)胞分為對(duì)照組、GA(0.04 μmol·L-1)組、CBP(16 mg·L-1)組、GA(0.04 μmol· L-1)聯(lián)合CBP(16 mg·L-1)組(聯(lián)合用藥組)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，消化細(xì)胞后制備單細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度為3 000個(gè)/孔，接種于96孔板，每孔100 μL，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h。分組同上，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。加藥后，5%CO2、37℃條件下繼續(xù)孵育。細(xì)胞給藥48 h后，每孔加入MTT(5 g·L-1)10 μL，37℃孵育4 h，小心吸去培養(yǎng)液，每孔加入DMSO溶液150 μL。振蕩10 min，用酶標(biāo)儀于490 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔吸光度(A)值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。細(xì)胞增殖抑制率=(1/給藥組A值-1/空白對(duì)照組A值)×100%。

1.4 倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)表現(xiàn)將培養(yǎng)至80%融合的Skov3細(xì)胞分為對(duì)照組、GA組(0.04 μmol·L-1)、CBP組(16 mg·L-1)和GA+CBP組(聯(lián)合用藥組)，藥物處理48 h后，于倒置顯微鏡下觀察并拍照。

1.5 Annexin Ⅴ-FICT/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Skov3單細(xì)胞懸液接種6孔板，37℃孵育24 h后，分組同上，每組3個(gè)復(fù)孔，另設(shè)僅含10%血清IMDM培養(yǎng)液和Skov3細(xì)胞的對(duì)照組，給藥后37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育48 h。胰酶消化細(xì)胞，制備單細(xì)胞懸液，冷PBS洗2次，離心后棄上清，1×binding buffer 1 mL重懸細(xì)胞，使細(xì)胞濃度為1×106mL-1。取100 μL細(xì)胞懸液，加入5 μL Annexin Ⅴ-FICT，室溫避光孵育15 min，加入PI 5 μL，室溫避光5 min，加PBS至500 μL，1 h內(nèi)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。細(xì)胞凋亡率=凋亡細(xì)胞數(shù)/(凋亡細(xì)胞數(shù)+正常細(xì)胞數(shù))×100%。

1.6 TUNEL染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡指數(shù)(apoptotic index,AI)用各組藥物作用48 h的細(xì)胞爬片進(jìn)行TUNEL染色。參考試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行染色后用抗熒光淬滅封片液封片后熒光顯微鏡下觀察。陽(yáng)性細(xì)胞核呈綠色。顯微鏡(×400)下隨機(jī)選取10個(gè)視野，計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)和染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，二者之比值乘以100%即為細(xì)胞AI(%)。

1.7 JC-1染色檢測(cè)Skov3細(xì)胞線粒體膜電位取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Skov3單細(xì)胞懸液接種于24孔板，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個(gè)/孔，每孔500 μL液體。于37℃、含5% CO2的孵箱中孵育24 h后給藥，分組同上。給藥后37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育48 h。吸去24孔板內(nèi)培養(yǎng)基，用PBS洗2次，每孔加入500 μL JC-1 稀釋液，細(xì)胞培養(yǎng)箱中37℃孵育30 min。孵育結(jié)束后，吸去JC-1，PBS洗2次。熒光顯微鏡下觀察。

1.8 RT-PCR法檢測(cè)Skov3細(xì)胞中Bax、caspase-3、Bcl-2和Stat3 mRNA表達(dá)水平對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Skov3單細(xì)胞懸液接種于6孔板，37℃孵育24 h貼壁后給藥，孵育48 h后，使用Trizol試劑盒提取各組細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度。根據(jù)RT-PCR試劑盒方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。PCR引物設(shè)計(jì)：Bax，上游引物5′-AGGGTTTCAGG ATCGAGC-3′，下游引物5′-AGGCGGTGAGGACTCCAGCC-3′;caspase-3，上游引物5′-CTGGACTGCGGTATTGAGAC-3′，下游下物5′-CCGGGTGCGGTAGAGTAAGC-3′;Bcl-2，上游引物5′-GGATGACTGAGTACCTGAA-3′，下游引物5′-TTCAGGTACTCAGTCATCC-3′；Stat3，上游引物5′-ATTCAAACACTTGACCCTGA-3′，下游引物5′-ATTGTT GGTCAGCATGTTGT-3′；GAPDH ，上游引物5′-GGAAAGGCTGGGGCTCATTTG-3′，下游引物5′-AGAAGGGGCCATCCACAGTCTTC-3′。以cDNA為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)，擴(kuò)增條件如下：94℃、3 min(預(yù)變性)；94℃、30 s，55℃、30 s，72℃、45 s，40個(gè)循環(huán)；72℃、5 min。以GAPDH為內(nèi)參照，通過(guò)2-ΔΔCt法計(jì)算各基因mRNA相對(duì)表達(dá)水平。

1.9 Western blotting法檢測(cè)Skov3細(xì)胞中Bax、caspase-3和Stat3蛋白表達(dá)水平在直徑100 mm培養(yǎng)皿中接種細(xì)胞，37℃、含5% CO2的孵箱中孵育24h后給藥，給藥后繼續(xù)孵育48 h。離心收集細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液，充分裂解細(xì)胞，離心收集上清，采用BCA法測(cè)定蛋白含量。SDS-PAGE電泳分離蛋白樣本中不同相對(duì)分子質(zhì)量蛋白，將蛋白轉(zhuǎn)印到PVDF 膜上。轉(zhuǎn)膜完成后，用5%脫脂奶粉封閉1 h，TBST洗3次，稀釋一抗，稀釋比例分別為Bax(1∶1 000)、caspase-3(1∶1 000)、Stat3(1∶1 000)和β-actin(1∶500)，將膜封入一抗，4℃靜置過(guò)夜。TBST洗3次后，加入過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗，37℃孵育1 h，TBST洗3遍。以β-actin作為內(nèi)參照。DAB顯色，凝膠成像系統(tǒng)拍照。以各實(shí)驗(yàn)組灰度值與對(duì)照組之比表示蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

2 結(jié) 果

2.1 MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖抑制率隨著濃度增加，GA和CBP對(duì)Skov3細(xì)胞增殖抑制率明顯升高。單獨(dú)應(yīng)用GA(0.01、0.02、0.04、0.08和0.16 μmol·L-1)干預(yù)后，Skov3細(xì)胞增殖抑制率為9.4%～21.3%；單獨(dú)應(yīng)用CBP(4、8、16、32和64 mg·L-1)干預(yù)后，細(xì)胞增殖抑制率為14.6%～27.2%；而CA與CBP聯(lián)合作用后細(xì)胞增殖抑制率明顯升高，高于同濃度GA組和CBP組(P<0.01)，且GA和CBP濃度分別為0.04 μmol·L-1和16 mg·L-1時(shí)量效比最佳，細(xì)胞增殖抑制率為52.1%。見(jiàn)圖1。

n=6；*P<0.01 compared with GA group;△P<0.01 compared with CBP group.

2.2 倒置顯微鏡下觀察各組Skov3細(xì)胞形態(tài)表現(xiàn)對(duì)照組Skov3細(xì)胞形狀呈梭形或多角形，胞核圓形或橢圓形，胞質(zhì)透亮，貼壁生長(zhǎng)旺盛，折光性好；GA組Skov3細(xì)胞光鏡下見(jiàn)體積略縮小，回縮變圓的細(xì)胞略有增加，細(xì)胞核相對(duì)變?。籆BP組Skov3細(xì)胞折光性減弱，回縮明顯，部分脫落呈懸浮狀；聯(lián)合用藥組細(xì)胞回縮現(xiàn)象更為明顯，細(xì)胞數(shù)量減少，體積縮小，細(xì)胞形態(tài)不一，并見(jiàn)大量脫落細(xì)胞。見(jiàn)圖2。

2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率對(duì)照組細(xì)胞凋亡率為(4.33±1.69)%，GA組、CBP組及聯(lián)合用藥組細(xì)胞凋亡率分別為(8.69±3.55)%、(13.12±0.79)%和(18.54±2.11)%。與對(duì)照組比較，GA組、CBP組和聯(lián)合用藥組細(xì)胞凋亡率明顯升高(P<0.05或P<0.01)；與GA組和CBP組比較，聯(lián)合用藥組細(xì)胞凋亡率進(jìn)一步升高(P<0.05)。見(jiàn)圖3。

A：Control group;B：GA group;C：CBP group;D：GA+CBP group.

A：Control group;B：GA group;C：CBP group;D：GA+CBP group.

2.4 TUNEL染色法檢測(cè)各組細(xì)胞AI藥物作用Skov3細(xì)胞48 h后，TUNEL法染色檢測(cè)各組Skov3細(xì)胞凋亡，細(xì)胞核中有綠色熒光顆粒者為陽(yáng)性細(xì)胞，細(xì)胞呈典型的凋亡形態(tài)學(xué)改變(變小、變圓、核固縮)；正常細(xì)胞的胞核不著色。與對(duì)照組比較，GA組和CBP組Skov3細(xì)胞核中有綠色熒光顆粒者數(shù)量均有增加，聯(lián)合用藥組陽(yáng)性細(xì)胞增加更明顯。對(duì)照組細(xì)胞AI為(3.53±1.29)%，GA組、CBP組和聯(lián)合用藥組細(xì)胞AI分別為(12.21±2.47)%、(17.36±0.86)%和(26.87±2.62)%。與對(duì)照組比較，GA組、CBP組和聯(lián)合用藥組細(xì)胞AI明顯升高(P<0.05或P<0.01)；與GA組和CBP組比較，聯(lián)合用藥組細(xì)胞AI明顯升高(P<0.05) (圖4，見(jiàn)插頁(yè)三)。

2.5 JC-1染色觀察各組細(xì)胞線粒體膜電位線粒體膜電位的下降是細(xì)胞早期凋亡的標(biāo)志性事件。通過(guò)JC-1從紅色熒光到綠色熒光的轉(zhuǎn)變過(guò)程觀察細(xì)胞膜電位的降低，同時(shí)也可用JC-1從紅色熒光到綠色熒光的變化作為細(xì)胞凋亡的早期指標(biāo)。對(duì)照組細(xì)胞在熒光顯微鏡下大部分呈紅色熒光，GA組和CBP組部分細(xì)胞在熒光顯微鏡下呈綠色熒光，而聯(lián)合用藥組大部分細(xì)胞在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)綠色熒光，提示聯(lián)合用藥組Skov3細(xì)胞線粒體膜電位降低，細(xì)胞發(fā)生早期凋亡(圖5,見(jiàn)插頁(yè)三)。

2.6 RT-PCR法檢測(cè)細(xì)胞中凋亡、侵襲相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平與對(duì)照組比較，GA組、CBP組和聯(lián)合用藥組細(xì)胞中Bax和caspase-3 mRNA表達(dá)水平上調(diào)(P<0.05)，Stat3和Bcl-2 mRNA表達(dá)水平下調(diào)(P<0.05)；與GA組和CBP組比較，聯(lián)合用藥組細(xì)胞中Bax和caspase-3 mRNA表達(dá)水平上調(diào)(P<0.05)，Stat3和Bcl-2 mRNA表達(dá)水平下調(diào)(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組Skov3細(xì)胞中凋亡相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平

Tab.1 Expression levels of apoptosis-related gene mRNA in Skov3 cells in various groups

表1 各組Skov3細(xì)胞中凋亡相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平

GroupCaspase?3mRNABaxmRNA Bcl?2mRNA Stat3mRNA ControlGACBPGA+CBP1．00±0．202．80±0．30?3．98±0．15?6．89±0．20?△#1．11±0．242．50±0．18?2．20±0．11?5．00±0．25?△#0．99±0．210．90±0．190．50±0．12?0．25±0．15?△#1．12±0．300．75±0．21?0．45±0．11?0．26±0．11?△#

*P<0.05 compared with control group;△P<0.05 compared with GA group;#P<0.05 compared with CBP group.

2.7 Western blotting法檢測(cè)各組細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平與對(duì)照組比較，GA組、CBP組和聯(lián)合用藥組細(xì)胞中Bax和Cleave-caspase-3蛋白表達(dá)水平上調(diào)(P<0.05)，Stat3蛋白表達(dá)水平下調(diào)(P<0.05)；與GA組和CBP組比較，聯(lián)合用藥組細(xì)胞中Bax和Cleave-caspase-3蛋白表達(dá)水平上調(diào)(P<0.05)，Stat3蛋白表達(dá)水平下調(diào)(P<0.05)。見(jiàn)圖6和表2。

Lane 1：Control group;Lane 2：GA group;Lane 3：CBP group;Lane 4：GA+CBP group.

表2 各組Skov3細(xì)胞中凋亡相關(guān)基因蛋白表達(dá)水平

*P<0.05 compared with control group;△P<0.05 compared with GA group;#P<0.05 compared with CBP group.

3 討 論

卵巢癌的發(fā)病率日益增高，嚴(yán)重威脅女性的生命健康。紫杉醇和卡鉑聯(lián)合化療是目前卵巢癌輔助治療的重要手段，但是存在嚴(yán)重的不良反應(yīng)。近年來(lái)，天然、高效、低毒和來(lái)源廣泛的中草藥受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的青睞。五味子的抗腫瘤活性已被許多研究所證實(shí)。研究[8]表明：五味子乙素通過(guò)激活p38MAPK/p53信號(hào)通路而抑制結(jié)腸癌SW480細(xì)胞增殖和侵襲，促進(jìn)細(xì)胞凋亡；禹潔等[9]發(fā)現(xiàn)：五味子木脂素對(duì)人乳腺癌細(xì)胞MCF-7、食管癌9706細(xì)胞和肝癌HepG2細(xì)胞的抑制效果明顯。Kim等[10]發(fā)現(xiàn)：五味子脂可抑制乳腺癌細(xì)胞增殖，其機(jī)制可能是抑制細(xì)胞周期蛋白Cyclin D1、Cyclin E和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶CDK2、CDK4的表達(dá)。有研究[11]顯示：隨著五味子多糖濃度升高可明顯抑制卵巢癌Skov3細(xì)胞增殖。本課題組前期研究[12]顯示：?jiǎn)为?dú)使用GA和CBP均可抑制人卵巢癌Skov3細(xì)胞增殖，聯(lián)合用藥后抑制作用更為明顯，進(jìn)一步證實(shí)GA可增強(qiáng)卡鉑對(duì)人卵巢癌Skov3細(xì)胞增殖的抑制作用。

凋亡是細(xì)胞為了維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定而發(fā)生的自主的程序性死亡。多數(shù)化療藥物是通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡達(dá)到殺傷細(xì)胞、治療腫瘤的目的。Yim等[13]研究五味子木脂素不同成分對(duì)肝癌細(xì)胞的影響發(fā)現(xiàn):五味子木脂素可通過(guò)增強(qiáng)促凋亡蛋白Bax表達(dá)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。Inoue等[14]發(fā)現(xiàn)：五味子脂N預(yù)處理可上調(diào)caspase-3和caspase-9水平，促進(jìn)RARP-1裂解,上調(diào)死亡受體4(DR4)和死亡受體5(DR5)轉(zhuǎn)錄，最終通過(guò)蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)促進(jìn)凋亡。本研究Annexin Ⅴ-FICT/PI雙染法及線粒體膜電位等結(jié)果顯示：GA與CBP聯(lián)合應(yīng)用可加速CBP誘導(dǎo)的卵巢癌細(xì)胞凋亡；應(yīng)用TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡也發(fā)現(xiàn)：聯(lián)合用藥組凋亡細(xì)胞明顯增多，進(jìn)一步證實(shí)GA與CBP聯(lián)合應(yīng)用可促進(jìn)CBP誘導(dǎo)的卵巢癌細(xì)胞凋亡，肯定了GA在抗腫瘤方面的價(jià)值。

細(xì)胞凋亡是多基因調(diào)控的復(fù)雜過(guò)程，抗凋亡蛋白Bcl-2與促凋亡蛋白Bax的比例決定了細(xì)胞是否發(fā)生凋亡[15]。細(xì)胞色素C是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的線粒體凋亡蛋白，是細(xì)胞凋亡的閥門(mén)，Bcl-2蛋白通過(guò)抑制線粒體中細(xì)胞色素C的釋放從而抑制細(xì)胞凋亡，細(xì)胞色素C釋放可直接激活caspase-9，繼而活化caspase-3，caspase-3是caspase家族中的凋亡執(zhí)行者，其激活預(yù)示著凋亡進(jìn)入不可逆階段[16]。本實(shí)驗(yàn)分別采用RT-PCR及Western blotting法檢測(cè)藥物處理后Skov3細(xì)胞凋亡相關(guān)基因mRNA和蛋白表達(dá)水平，結(jié)果表明：聯(lián)合用藥組Skov3細(xì)胞中Bax基因表達(dá)水平增高， Bcl-2基因表達(dá)水平明顯降低，由此推斷，GA可能是通過(guò)上調(diào)促凋亡因子Bax、下調(diào)抗凋亡因子 Bcl-2的表達(dá)，激活caspase-3，從而協(xié)同卡鉑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。

JAK-Stat信號(hào)通路對(duì)多種細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化和凋亡具有重要的調(diào)節(jié)功能，通過(guò)使蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸化和激活，引起級(jí)聯(lián)激酶的活化，并將活化的信號(hào)傳導(dǎo)給其他分子如Stat，繼而引發(fā)一系列基因和蛋白的變化[17]。Stat3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路直接影響分化、增殖和凋亡過(guò)程，可導(dǎo)致細(xì)胞的異常增殖和惡性轉(zhuǎn)化[18]。研究[19-21]顯示:磷酸化Stat3(p-Stat3)在卵巢癌細(xì)胞株中高表達(dá)，卵巢癌組織中Stat3途徑的激活與腫瘤的侵襲力有關(guān)。本研究結(jié)果顯示:CBP與GA聯(lián)合用藥后Stat3表達(dá)的下調(diào)更加明顯，提示GA協(xié)同CBP誘導(dǎo)Skov3凋亡的作用可能是通過(guò)抑制JAK- Stat信號(hào)通路完成的。

本研究表明：GA和CBP聯(lián)合用藥對(duì)卵巢癌Skov3細(xì)胞的凋亡的作用優(yōu)于單獨(dú)應(yīng)用CBP，即低濃度的CBP與微量的GA聯(lián)合用藥即可達(dá)到高濃度CBP所產(chǎn)生的抑瘤效果，從而可降低CBP的用量，減少化療藥物對(duì)人體的不良作用，為臨床開(kāi)發(fā)新的抗腫瘤藥物提供了理論依據(jù)。

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