吳明明 林子鋒 程德林 潘浩波 阮長順

(中國科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院 人體組織與器官退行性研究中心 深圳 518055)

1 引 言

組織和器官病變、創(chuàng)傷和正常生理功能衰竭是人類醫(yī)學(xué)面臨的最棘手的問題之一，也是引起人類疾病和死亡的重要原因，嚴(yán)重危害著人類的健康和生活質(zhì)量。臨床統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，美國每年用于器官及組織損傷患者身上的資金高達(dá) 4 000多億美元，幾乎占全美國醫(yī)療費(fèi)用的一半[1]。美國醫(yī)院每年能完成 800 萬例次組織移植手術(shù)，但并不能保證成功挽救每一條生命或避免殘疾。此外，每年大約有 4 000 人在等待合適的器官時死亡，近 10 萬人在未被列入等待器官移植時就已死亡?？梢?，組織或器官缺損的修復(fù)和功能重建是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)領(lǐng)域所面臨的亟待解決的重大挑戰(zhàn)。傳統(tǒng)的組織工程方法是細(xì)胞經(jīng)體外增殖后接種到支架材料上，構(gòu)成“支架＋細(xì)胞”的復(fù)合體，體外培養(yǎng)一定時間后植入到患者體內(nèi)，隨著生物材料在體內(nèi)的逐漸降解和吸收，植入細(xì)胞在體內(nèi)不斷地增殖分化并分泌細(xì)胞外基質(zhì)，最終形成相應(yīng)的組織或器官，從而達(dá)到組織或器官修復(fù)和功能重建的目的。在過去幾十年的發(fā)展中，組織工程取得了長足的進(jìn)步，但傳統(tǒng)方法如溶液澆鑄/粒子瀝出法[2,3]、熱致相分離法[4,5]和靜電紡絲法等不能有效地控制孔徑、孔隙率以及構(gòu)造有序貫通的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，且可重復(fù)性差[6,7]。而三維打印技術(shù)通過計算機(jī)輔助設(shè)計(Computer Aided Design，CAD)建模能夠精確地控制打印物的外型和內(nèi)部結(jié)構(gòu)[8]，它的出現(xiàn)使得多孔支架的設(shè)計與構(gòu)建得到突飛猛進(jìn)的發(fā)展。

三維打印構(gòu)建支架方法主要有熔融沉積技術(shù)(FDM)[9]、選擇性激光燒結(jié)技術(shù)(SLS)[10]和光固化成型技術(shù)(SLA)[11]等。其優(yōu)點(diǎn)是可自由設(shè)計支架的三維結(jié)構(gòu)，通過調(diào)整成型參數(shù)，獲得多變可控的機(jī)械強(qiáng)度、精確的外形尺寸、內(nèi)部完全貫通的預(yù)血管化網(wǎng)絡(luò)以及可控的孔隙率[12]。雖然使用這些技術(shù)構(gòu)建結(jié)構(gòu)仿生的組織工程支架取得了令人稱贊的結(jié)果，但這些技術(shù)的成型條件苛刻，如高溫、紫外光照及有機(jī)溶劑等，不利于生長因子甚至細(xì)胞參與支架的構(gòu)建。而且種植于支架的細(xì)胞往往游離在支架表面，難以長入支架內(nèi)部，分布也不均勻，容易團(tuán)聚[13]。如何將細(xì)胞精確有序地排布在三維支架上，實(shí)現(xiàn)自然組織結(jié)構(gòu)和功能，一直是限制組織工程發(fā)展的科學(xué)問題之一。自 2009 年以來，熱門技術(shù)“三維生物打印(Three-Dimensional Bio-Printing，Bio-3DP)”快速發(fā)展，有望突破傳統(tǒng)組織工程方法中細(xì)胞無法長入且分布不均的瓶頸[14,15]。將快速成型技術(shù)和生物制造技術(shù)的有機(jī)結(jié)合，突破了傳統(tǒng)組織工程技術(shù)空間分辨率低的局限性，可精確控制細(xì)胞在支架材料中的定點(diǎn)分布，微觀上構(gòu)建具有適合細(xì)胞生存的微環(huán)境，為細(xì)胞提供了真正的三維均衡生長環(huán)境，使得復(fù)雜組織和器官的體外再造成為可能[16]。

2 生物打印技術(shù)

美國克萊姆森大學(xué)的 Thomas Boland 教授在2000 年首次提出“三維生物打印(Bio-3DP)”的概念[17]。生物打印是指能夠?qū)⒓?xì)胞、生長因子和支架結(jié)合在一起形成一個完整的整體結(jié)構(gòu)，同時能夠?qū)崿F(xiàn)不同類型的細(xì)胞在支架內(nèi)部的準(zhǔn)確定位，通過細(xì)胞、生長因子以及支架之間的相互作用，實(shí)現(xiàn)組織功能化。因此，三維生物打印被認(rèn)為是現(xiàn)代組織工程中最有發(fā)展?jié)摿Φ募夹g(shù)，相應(yīng)流程圖及潛在應(yīng)用見圖1。三維生物打印技術(shù)通過改進(jìn)原有傳統(tǒng)的 3D 打印技術(shù)，以及對打印墨水進(jìn)行優(yōu)化，能夠在室溫常態(tài)下進(jìn)行 3D 打印，從而提高了生長因子的活性和細(xì)胞相容性。與傳統(tǒng)的組織工程技術(shù)相比，生物打印技術(shù)有諸多優(yōu)勢：(1) 能夠快速構(gòu)建出宏觀以及微觀結(jié)構(gòu)仿生的組織工程支架；(2) 構(gòu)建二維或三維的“多細(xì)胞/材料”體系，在組織成分和細(xì)胞構(gòu)成上更接近天然組織；(3)可以精確地控制細(xì)胞和材料在時間和空間上的分布；(4)構(gòu)建仿生的細(xì)胞外基質(zhì)環(huán)境等。目前生物打印技術(shù)主要包括擠出式、噴墨式和激光輔助三種(圖2)。

圖1 生物打印的流程及潛在應(yīng)用Fig. 1 Bioprinting process and potential application

圖2 普通的三維打印和生物打印技術(shù)Fig. 2 Normal 3D print and bioprinting techniques

2.1 擠出式生物打印

擠出成型是將流體沉積技術(shù)與自動化三維打印技術(shù)相結(jié)合，通過擠壓技術(shù)實(shí)現(xiàn)材料的三維結(jié)構(gòu)打印。根據(jù)流體沉積系統(tǒng)驅(qū)動力的不同，該三維生物打印方式可分為 3 種：氣壓驅(qū)動、機(jī)械驅(qū)動(活塞或螺桿)和螺線管驅(qū)動。目前應(yīng)用較多的是氣壓驅(qū)動和活塞驅(qū)動的方法。擠出成型常用的材料為剪切變稀水凝膠。隨著施加壓力的增大，水凝膠的黏度降低，能夠從針頭處擠出[18]。擠出方式可以分為直接擠出成型和間接擠出成型。其中，直接擠出生物打印為對含細(xì)胞的生物墨水進(jìn)行外部加壓，從而擠出細(xì)纖維并沉積于接收平臺。Zhang 等[19]使用同軸的針頭將海藻酸直接擠出成型，得到了管狀支架。同軸針頭的內(nèi)通道擠出含臍帶血管平滑肌細(xì)胞的海藻酸，外通道為氯化鈣溶液，在擠出海藻酸水凝膠的同時對其進(jìn)行交聯(lián)固化；細(xì)胞培養(yǎng) 7 天后的生存率仍然高達(dá)84%，具有很好的應(yīng)用前景。擠出式打印更有利于控制支架的孔隙結(jié)構(gòu)，Luo 等[20]制備了海藻酸和聚乙烯醇復(fù)合生物墨水，在常溫常壓下制得孔隙率可控以及具有多級孔結(jié)構(gòu)的支架，通過控制孔隙率能夠調(diào)整支架的力學(xué)性能以及活性因子的釋放速率。間接擠出生物打印是將含細(xì)胞的打印材料擠出于另一種基質(zhì)材料中，隨后去除打印材料和固化基質(zhì)材料，在基質(zhì)材料中得到了細(xì)胞均勻分布的管道。Bertassoni 等[21]將含成骨細(xì)胞的甲基丙烯酰胺化明膠作為基質(zhì)材料，打印瓊脂糖于基質(zhì)材料中，隨后對基質(zhì)材料進(jìn)行紫外光交聯(lián)固化并去除瓊脂糖。該方法在基質(zhì)材料中得到了管狀網(wǎng)絡(luò)，提高了物質(zhì)的傳輸和細(xì)胞的活性。

2.2 噴墨生物打印

在噴墨生物打印中，生物墨水的成分為培養(yǎng)基或者水凝膠，以液滴的形式精確地打印在接收平臺的凝膠基質(zhì)上，隨后固化[22]。每個液滴中包裹少量細(xì)胞，液滴的驅(qū)動模式主要有熱驅(qū)動和壓電驅(qū)動[23,24]。其中，熱驅(qū)動通過加熱針頭產(chǎn)生氣泡，氣泡破裂的壓力驅(qū)動液滴擠出針頭。Cui 和 Boland[23]將人微血管內(nèi)皮細(xì)胞懸浮于含凝血酶和鈣離子的培養(yǎng)基，熱驅(qū)動噴墨打印于纖維蛋白原的通道中，最終打印的細(xì)胞在通道中取向排列。結(jié)果表明，該方法有利于促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和微血管的形成。Xu 等[25]利用壓電驅(qū)動的噴墨打印技術(shù)，將海藻酸生物墨水打印于氯化鈣溶液中。其中，氯化鈣溶液除了作為離子交聯(lián)劑還可以提供浮力，從而作為支撐材料。利用這一方法，成功得到了分叉狀的血管支架，細(xì)胞的存活率高達(dá) 90%[26]。

2.3 激光輔助生物打印

除了噴墨和基于擠出的打印技術(shù)之外，光輔助生物打印平臺也越來越多地被用于細(xì)胞印刷和組織工程應(yīng)用。激光輔助生物打印可分為兩個類別，一是激光導(dǎo)致局部射流形成的細(xì)胞打印，二是過程涉及光聚合的成型技術(shù)。前者使用激光對生物墨水進(jìn)行局部加熱，形成高壓氣泡，導(dǎo)致射流形成[27]。射流的粗細(xì)與激光能量、生物墨水黏度和接收平臺的距離等因素有關(guān)，接收平臺通常覆蓋著凝膠材料，打印過程中實(shí)現(xiàn)熱交聯(lián)或者離子交聯(lián)。后者使用細(xì)胞相容性較好的光敏聚合物作為打印材料，通過紫外光交聯(lián)的形式精確控制交聯(lián)區(qū)域，得到精確度較高的三維打印支架。Ovsianikov 等[28]使用聚乙二醇二丙烯酸酯作為打印材料，利用雙光子聚合的方法制備了三維支架，并使用激光誘導(dǎo)射流在支架上進(jìn)行細(xì)胞打印。熒光照片結(jié)果顯示，平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞區(qū)域具有明顯的過渡，精確地控制了細(xì)胞在支架上的密度和位置。

3 生物墨水

在人工組織或器官制造過程中，生物墨水主要承擔(dān)了構(gòu)建三維結(jié)構(gòu)和重建組織的功能，即讓活體細(xì)胞按照預(yù)先設(shè)計好的形狀來生長。因此，生物墨水合適與否直接決定生物三維打印技術(shù)能否應(yīng)用于臨床[29]。盡管金屬、無機(jī)物(羥基磷灰石、磷酸三鈣、生物活性玻璃)、高分子聚合物等已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用于三維打印技術(shù)中，但與這些傳統(tǒng)的三維打印支架不同的是，三維細(xì)胞打印技術(shù)需要將細(xì)胞與被打印材料均勻地混合在一起，故打印材料必須具備可打印性和可交聯(lián)性，同時還需具備良好的生物相容性和必要的力學(xué)性能[30,31]。典型的生物墨水由水凝膠的前驅(qū)體溶液和細(xì)胞組成。其中，水凝膠與細(xì)胞直接接觸，不僅對細(xì)胞提供了三維力學(xué)支撐，還決定了細(xì)胞所處的微化學(xué)和物理環(huán)境，從而促進(jìn)細(xì)胞的增殖和分化[32]。交聯(lián)方式主要有兩類：化學(xué)(pH、離子作用)和物理(光、電)交聯(lián)。理想的生物墨水打印成型后需要具備類似于天然細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)[33]，材料的差異導(dǎo)致交聯(lián)后力學(xué)性能也存在差異，這也決定了該三維支架的應(yīng)用位置，如骨、軟骨、皮膚、心臟等。目前研究常用的材料如表1 所示。

3.1 膠原

膠原是動物體內(nèi)數(shù)量最多的蛋白，是所有連接組織和細(xì)胞外基質(zhì)的成分之一[34]。膠原最常見的來源是鼠尾、牛皮膚和跟腱，具有很好的生物相容性和較低的免疫原性，是組織工程最為常用的材料之一[35]。Ⅰ型膠原中含有的氨基酸 RGD 序列可以與整聯(lián)蛋白受體相結(jié)合，不僅可以調(diào)控細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)間的相互作用，還可用做信號轉(zhuǎn)換器，激活細(xì)胞內(nèi)信號通路等。膠原作為天然的生物材料也被應(yīng)用于 3D 打印領(lǐng)域，但膠原具有溫度敏感性，在大多數(shù)滅菌過程中容易發(fā)生降解，因此膠原支架往往需要交聯(lián)或與其他材料復(fù)合使用。Yeo 等[36]使用同軸擠出生物打印技術(shù)制備了膠原和人成骨肉瘤細(xì)胞為內(nèi)層、海藻酸為外層的核殼支架，獲得的細(xì)胞活性高達(dá)(92±3)%；對照組為含人成骨肉瘤細(xì)胞的海藻酸支架且細(xì)胞活性為(83±4)%。結(jié)果表明，當(dāng)海藻酸作為外層支撐材料時，內(nèi)層的膠原更有利于保持細(xì)胞活性。另一組實(shí)驗(yàn)證明使用該支架載人脂肪干細(xì)胞，具有更好的誘導(dǎo)其向成肝組織分化的能力。同樣地，Ashwini 等[37]也制備了以膠原為核層、海藻酸為殼層的支架，經(jīng)過京尼平交聯(lián)后，支架具有更好的力學(xué)性能。Koch 等[38]利用激光生物打印的方法制備了含成纖維細(xì)胞和角質(zhì)細(xì)胞的膠原支架，并用于皮膚組織工程修復(fù)。該實(shí)驗(yàn)采用分層打印的支架模擬天然皮膚組織細(xì)胞的分布情況，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明該支架具有較好的細(xì)胞相容性。Xu 等[39]配置了含平滑肌細(xì)胞的重組膠原蛋白溶液，使用噴墨生物打印制備了生物芯片，細(xì)胞的活性高達(dá) 94%。Daniela 等[40]使用噴墨生物打印制備了含間充質(zhì)干細(xì)胞的膠原-瓊脂糖支架，在培養(yǎng) 21 天后細(xì)胞存活率高達(dá)99%。雖然膠原具有較好的生物相容性，但膠原難以形成黏度合適的搭載細(xì)胞的生物墨水，支架強(qiáng)度低且對金屬蛋白酶非常敏感，需要進(jìn)一步地探索以膠原為核心的復(fù)合生物墨水。

表1 構(gòu)建生物墨水常用材料Table 1 Materials for construction of bioink

3.2 明膠

明膠作為膠原的水解產(chǎn)物，具有很好的生物相容性、高吸水率且無免疫原性，同時明膠在體溫下具有流動性，在低溫下形成的凝膠能夠很好地懸浮細(xì)胞[41,42]。Yan 等[43]采用明膠和殼聚糖復(fù)合體系與肝臟細(xì)胞混合懸浮后，經(jīng)三維打印成型構(gòu)建了具有肝臟組織結(jié)構(gòu)的活性支架體系，最后通過戊二醛交聯(lián)固定成型。然而，明膠與殼聚糖組成的凝膠作為支架的骨架材料，力學(xué)強(qiáng)度較低，容易塌陷。盡管凝膠體系形狀固定率經(jīng)戊二醛交聯(lián)后有顯著提高，且支架形態(tài)孔隙保持完好，但戊二醛的使用又會降低支架的生物相容性。基于明膠的這種特性，純明膠通常被用做三維打印中的犧牲材料，即隨著打印后培養(yǎng)時間的延長，明膠逐漸溶于培養(yǎng)基中并在三維支架中形成通道，該通道有利于氧氣以及營養(yǎng)物質(zhì)的傳輸，從而有利于細(xì)胞的生存、增殖甚至分化。為了保留明膠原有的生物相容性同時提高力學(xué)強(qiáng)度，對明膠進(jìn)行改性并使用紫外光交聯(lián)吸引了大量研究者關(guān)注[44-47]。Schuurman等[48]合成了甲基丙烯酰胺化的明膠，包裹軟骨細(xì)胞并用于擠出生物打印。支架打印完成后使用紫外光交聯(lián) 15 min，一天后細(xì)胞活性維持在(83±13)%，三天后細(xì)胞活性降至(73±2)%。復(fù)合了透明質(zhì)酸和明膠甲基丙烯酰胺的生物墨水對細(xì)胞活性的維持得更好，在三天后細(xì)胞活性仍然有(82±8)%。Skardal 等[49]將明膠甲基丙烯酰胺和透明質(zhì)酸-甲基丙烯酰胺作為生物墨水，分別搭載了人肝癌細(xì)胞、正常腸上皮細(xì)胞和小鼠胚胎成纖維細(xì)胞，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明均具有較高的細(xì)胞活性。Ma 等[50]使用噴墨打印了含牙周韌帶干細(xì)胞的明膠甲基丙烯酰胺-聚乙二醇二甲基丙烯酸陣列，并使用紫外光交聯(lián) 30 s，細(xì)胞活性高達(dá)94%。進(jìn)一步的研究需要聚焦在縮短紫外光交聯(lián)時間，同時提高支架的力學(xué)性能，使其符合臨床標(biāo)準(zhǔn)。

3.3 海藻酸

海藻酸是由古羅糖醛酸和甘露糖醛酸組成的天然存在的、無毒的、可生物降解的和非免疫原性的線性多糖[51]。海藻酸鹽最常用的凝膠成型方式就是在三維打印后采用氯化鈣(CaCl2)溶液作為螯合劑引發(fā)海藻酸鹽交聯(lián)固化，同時這一方法也能較好地保持打印后支架的生物相容性，因此被廣泛用于三維生物打印[52]。Khalil 和 Sun[53]通過擠出三維打印和鈣離子交聯(lián)得到了搭載鼠心臟內(nèi)皮細(xì)胞的海藻酸支架，細(xì)胞具有較高的活性，達(dá) 83%。為了進(jìn)一步增強(qiáng)海藻酸支架的力學(xué)性能，Dolati 等[54]在海藻酸漿料中加入碳納米管，并用來搭載平滑肌細(xì)胞。結(jié)果顯示，支架的彈性模量得到了顯著性的提高，同時細(xì)胞的活性沒有受到太大影響，復(fù)合了碳納米管的支架細(xì)胞活性下降至 72.2%(相對于對照組的 75.6% 并沒有顯著差異)。Luo 等[55]在以海藻酸作為基質(zhì)材料，摻雜生物活性玻璃制備骨修復(fù)支架。生物活性玻璃中的二價離子能提高海藻酸的打印穩(wěn)定性，支架具有更優(yōu)異的力學(xué)性能以及促進(jìn)干細(xì)胞成骨分化的能力。Zhang 等[19]設(shè)計了微流體裝置，外層流通含軟骨祖細(xì)胞的海藻酸溶液，內(nèi)層流通氯化鈣交聯(lián)溶液，通過擠出打印制備了管狀結(jié)構(gòu)的海藻酸支架。該管內(nèi)徑約為 186 μm，適合用于微血管組織工程，細(xì)胞平均生存率為 62.7%?；趬弘婒?qū)動的噴墨生物打印，Arai 等[56]制備了含海拉細(xì)胞的海藻酸支架：通過液滴逐層堆積形成金字塔型后進(jìn)行活死染色。結(jié)果顯示，每層的細(xì)胞生存率均較高。Xiong 等[57]使用激光三維生物打印技術(shù)制得搭載小鼠成纖維細(xì)胞的海藻酸支架，該支架設(shè)計為直管狀和“Y”型，并使用鈣離子進(jìn)行物理交聯(lián)。結(jié)果顯示，打印后細(xì)胞的活性為 63.8%，培養(yǎng)一天后細(xì)胞的存活率上升至 68.2%。雖然鈣離子能夠快速交聯(lián)海藻酸支架，但在生理環(huán)境下容易和鈉離子發(fā)生置換，從而導(dǎo)致支架的降解和后續(xù)力學(xué)性能的下降。而且只有在海藻酸鈉濃度較低時，細(xì)胞打印的存活率才能有效提高，而此時獲得的支架力學(xué)強(qiáng)度較差。另外，由于純海藻酸鈉支架具有良好的親水性特點(diǎn)，細(xì)胞很難在材料內(nèi)部相互作用、增殖甚至分化。因此，對海藻酸鈉進(jìn)行改性，如氧化海藻酸鈉，或者修飾 RGD 多肽以及膠原等[58]，來改善細(xì)胞在海藻酸鈉支架上的黏附、伸展以及增殖情況，成為目前用海藻酸鈉進(jìn)行三維細(xì)胞打印的趨勢。

3.4 其他

其他具有較好生物相容性的材料也被廣泛應(yīng)用于三維生物打印領(lǐng)域。Murphy 等[59]對各類凝膠的可打印性和生物相容性進(jìn)行研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)建的凝膠和可光交聯(lián)的細(xì)胞外基質(zhì)凝膠具有最好的細(xì)胞活性，分別高達(dá) 97%和 96%；而聚乙二醇丙烯酸酯凝膠的細(xì)胞活性下降至 95%；殼聚糖凝膠由于使用乙酸溶解，其細(xì)胞活性最低，為 93%。甲基丙烯酸酯化這一方法使得很多材料能夠用于三維生物打印。Kesti 等[60]將透明質(zhì)酸和硫酸軟骨素功能化，分別制備了可光交聯(lián)的甲基丙烯酸酯化透明質(zhì)酸、甲基丙烯酸酯化硫酸軟骨素和熱敏性的聚(N-異丙基丙烯酰胺)化透明質(zhì)酸。結(jié)果顯示，牛軟骨細(xì)胞在聚(N-異丙基丙烯酰胺)化透明質(zhì)酸生物墨水中的存活率最高，為 98%，優(yōu)于甲基丙烯酸酯化透明質(zhì)酸。而甲基丙烯酸酯化硫酸軟骨素不利于細(xì)胞黏附，細(xì)胞培養(yǎng)一段時間后從凝膠中脫落。其他材料，如絲素、瓊脂糖、結(jié)冷膠等也逐漸有研究者將其用于制備生物墨水[61-63]。Schacht等[64]制備了蛛絲蛋白生物墨水，細(xì)胞存活率較低，僅為 (70.1±7.6)%。但該生物墨水不需要其他材料輔助成型和后續(xù)交聯(lián)處理，同時蛛絲蛋白也促進(jìn)了細(xì)胞在支架中的黏附。由上述可知，單一生物墨水的限制性較大。因此，為了滿足更多的性能需求，構(gòu)建復(fù)合型的生物墨水是目前三維生物打印的發(fā)展趨勢之一。

4 三維生物打印趨勢

三維打印技術(shù)在制備組織工程支架中具有無可比擬的優(yōu)勢。其中，生物打印技術(shù)可將細(xì)胞精確排布于支架的內(nèi)部，為細(xì)胞提供了類似細(xì)胞外基質(zhì)的生長環(huán)境，使得復(fù)雜組織和器官的體外培育成為可能。雖然在過去 10 年間取得了很多的研究成果，但生物打印技術(shù)和生物墨水的構(gòu)建尚有很大的提升空間。

4.1 打印技術(shù)的提升

與傳統(tǒng)的三維打印技術(shù)相比，三維生物打印技術(shù)具有明顯的優(yōu)勢，但也存在需要提升的方面，具體見表2。擠壓式三維生物打印技術(shù)打印速度較快，易于實(shí)現(xiàn)大規(guī)模打印。除了常規(guī)載有細(xì)胞的凝膠以及細(xì)胞聚集體外，擠出式還能打印載有細(xì)胞的微球以及細(xì)胞外基質(zhì)。細(xì)胞密度可控，即使打印墨水中的細(xì)胞密度較高，也不會造成碰頭堵塞的情況。擠出式打印過程對細(xì)胞造成的損傷較小，是目前使用最為廣泛的方法。但該打印方式的精度較差，最小打印尺寸僅可控制在100 μm 左右。因此，細(xì)胞在精準(zhǔn)定位方面存在一定的誤差；對生物墨水的要求也較高，不僅具有剪切變稀的特性，還需要在線條打印出來后能夠迅速成型。使用噴墨式打印技術(shù)得到的細(xì)胞活性較高且成本較低，但無法打印黏度較高的生物墨水，細(xì)胞在培養(yǎng)液中的分散程度也不可控，而且效率較低。擠出和噴墨生物打印機(jī)在簡單性、靈活性和低成本方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢。然而，這兩種方法也有局限性。首先，由于剪切應(yīng)力和用于輸送生物油墨的噴嘴的小孔直徑，這兩種方法都存在細(xì)胞損傷和死亡以及細(xì)胞沉淀和聚集[65]。此外，打印分辨率受到噴嘴的物理限制，打印結(jié)構(gòu)的完整性也是另一個障礙。因此，主要挑戰(zhàn)是在保持細(xì)胞活力和打印速度的同時又能降低壓力或者減小噴嘴尺寸。激光輔助的生物打印雖然解決了生物墨水的黏度限制，分辨率也提高至 5 μm，但也同樣存在著效率較低的問題。此外，激光容易損傷細(xì)胞，且該方法不利于多種細(xì)胞的混合打印，效率也較低。

打印技術(shù)的提升主要體現(xiàn)在提升打印的精度、提高搭載細(xì)胞的活性以及加大效率?；跀D出式的打印方式和靜電紡絲技術(shù)，發(fā)展出熔融3D 電紡打印技術(shù)[66-68]，極大地縮小了打印絲束的尺寸，但不利用結(jié)合細(xì)胞進(jìn)行生物打印。通過設(shè)計新的輔助打印模塊，有希望在進(jìn)一步提高擠出式打印精度的同時保證細(xì)胞的存活。壓電驅(qū)動的噴墨方式降低了熱驅(qū)動可能的局部高溫對細(xì)胞活性的影響，進(jìn)一步提升壓電驅(qū)動器的性能使其更加適用于黏度較大的材料是研究方向之一。對生物墨水采取屏蔽的措施來降低激光的損傷，使用多束激光和梯度化的生物墨水有希望提高激光輔助打印的效率和解決細(xì)胞單一的問題[28]。

三維打印支架雖然在宏觀尺度上滿足了個性化組織工程的需求，但支架內(nèi)部的結(jié)構(gòu)對整體力學(xué)性能以及調(diào)控細(xì)胞行為上有著重要的意義。Schacht 等[64]研究了三維打印支架內(nèi)部的結(jié)構(gòu)對性能的影響，通過對結(jié)構(gòu)的調(diào)控可以調(diào)節(jié)支架的孔隙率、比表面積和力學(xué)性能等，從而進(jìn)一步在微觀尺度上模擬天然的骨組織[69]。

4.2 復(fù)合型生物墨水

單一材料構(gòu)成的生物墨水在可打印性、可交聯(lián)性、力學(xué)性能和誘導(dǎo)干細(xì)胞增殖分化等方面往往難以滿足組織和器官打印的要求。且與打印技術(shù)相比，生物墨水的組成對支架的成型和性能至關(guān)重要。因此，目前的研究重心在于研究各方面性能更好的生物墨水。

表2 不同生物打印技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)Table 2 Advantage and disadvantage of different bioprinting technology

膠原與纖維蛋白復(fù)合的生物墨水具有可控的黏度、更短的凝膠時間和忽略不計的支架收縮率[59,70]。種植于其上的角質(zhì)細(xì)胞顯示出更快的增殖速率，而種植間充質(zhì)干細(xì)胞的移植物具有更好的傷口愈合率和血管化程度。膠原、海藻酸和細(xì)胞外基質(zhì)組成的混合生物墨水通過海藻酸與鈣離子結(jié)合快速交聯(lián)成型，而膠原顯著地提高了支架的細(xì)胞相容性，細(xì)胞外基質(zhì)成分提高了支架的力學(xué)性能[71]。相對于天然生物材料，人為設(shè)計的生物相容性聚合物水凝膠具有更好的力學(xué)性能和交聯(lián)性能。N-丙烯?；拾滨０穯误w具有快速光交聯(lián)的特性，通過復(fù)合黏土顆粒的三維打印支架被應(yīng)用于骨組織修復(fù)。該支架具有很好的應(yīng)變恢復(fù)性能和高度穩(wěn)定性，同時黏土釋放的鎂硅離子有利于干細(xì)胞的成骨分化[32]。另有研究者使用雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠作為生物墨水搭載細(xì)胞，不僅提高了水凝膠前驅(qū)體的黏度使其適合打印，而且提高了交聯(lián)成型之后的力學(xué)性能，支架的穩(wěn)定性更高。Hong 等[72]將雙鍵修飾的聚乙二醇與海藻酸鈉混合，并將其應(yīng)用于三維細(xì)胞打印中。結(jié)果顯示，該雙網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的水凝膠結(jié)合了聚乙二醇以及海藻酸鈉兩種水凝膠的優(yōu)勢，具有良好的力學(xué)性能，斷裂能可達(dá)到 1 500 J/m2，同時細(xì)胞存活率在打印 7 天后可以達(dá)到(75.5±11.6)%。生物墨水最常搭載的細(xì)胞是間充質(zhì)干細(xì)胞，其具有多向分化的能力，在不同的物理和化學(xué)因素誘導(dǎo)下能夠?qū)崿F(xiàn)定向分化[73]。因此，在應(yīng)用于不同的組織和器官修復(fù)時往往需要考慮生物墨水構(gòu)建的微環(huán)境對細(xì)胞的影響[74]。Gao 等[75]將納米級的羥基磷灰石與二甲基丙烯酸修飾的聚乙二醇(PEG-MA)混合，并將其應(yīng)用于人間充質(zhì)干細(xì)胞的三維打印技術(shù)中，細(xì)胞存活率可以達(dá)到 80%，且納米級羥基磷灰石的加入明顯提高了三維支架的力學(xué)性能，納米級羥基磷灰石作為骨的基礎(chǔ)成分之一促進(jìn)了人間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞的分化。Lee 等[71]構(gòu)建了聚己內(nèi)酯作為支撐材料，接枝 RGD 多肽的海藻酸作為生物墨水的一體化支架，并用于椎體骨修復(fù)。結(jié)果顯示，聚己內(nèi)酯極大地提高了支架的壓縮模量，接枝了 RGD 多肽促進(jìn)了細(xì)胞在海藻酸凝膠內(nèi)部的黏附[72,76]。除了在成分上對天然組織進(jìn)行仿生外，細(xì)胞所處的三維支架微環(huán)境為細(xì)胞提供了適宜的力學(xué)和表面結(jié)構(gòu)，在細(xì)胞增殖、分化和發(fā)揮細(xì)胞功能上起關(guān)鍵的作用[77-79]。Fattahi 等[80]用 3D 近場電紡技術(shù)制備了規(guī)整的聚甲基丙烯酸甲酯網(wǎng)絡(luò)，并用膠原凝膠搭載人間充質(zhì)干細(xì)胞，纖維的取向結(jié)構(gòu)極大地影響了細(xì)胞的取向和鋪展。多細(xì)胞相互作用也是目前的研究熱點(diǎn)之一[81]，基于同軸 3D 打印技術(shù)，Costantini等[82]成功構(gòu)建了海藻酸和聚乙二醇/纖維蛋白原生物墨水，分別搭載成纖維細(xì)胞和成肌細(xì)胞。而Jang 等[83]對心臟組織脫細(xì)胞，構(gòu)建了基于細(xì)胞外基質(zhì)生物墨水，分別搭載心臟祖細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞/血管內(nèi)皮生長因子。打印的支架空間結(jié)構(gòu)增強(qiáng)了兩種干細(xì)胞之間的相互交流，血管內(nèi)皮生長因子促進(jìn)了在體外的預(yù)先血管化作用，構(gòu)建出適宜細(xì)胞增殖和分化的微環(huán)境。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，該仿生支架增強(qiáng)了心肌的功能，減少心肌肥大和纖維化，同時促進(jìn)了細(xì)胞往心肌梗死區(qū)域遷移。優(yōu)秀的生物墨水必須具有可控的黏度，原料合成簡易，且能夠在常溫常態(tài)下進(jìn)行打印。同時還要提供適宜細(xì)胞增殖和分化微環(huán)境，從而構(gòu)建功能完整的組織工程支架。

5 結(jié)論與展望

如何使細(xì)胞在打印后具有高存活率，并將其應(yīng)用于組織或器官的修復(fù)和功能重建，仍面臨著很多挑戰(zhàn)。筆者認(rèn)為以下兩點(diǎn)至關(guān)重要：構(gòu)建物質(zhì)自由交換、保持細(xì)胞活性和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的生物墨水，以及在微觀和宏觀尺度上均對天然組織或器官進(jìn)行結(jié)構(gòu)上的仿生，從而誘導(dǎo)不同區(qū)域細(xì)胞的特向分化。在目前已發(fā)表的研究中，使用的生物墨水均取得了較高的細(xì)胞存活率，但僅有少數(shù)研究涉及到仿生的成分和結(jié)構(gòu)對細(xì)胞行為的影響。生物墨水除了搭載細(xì)胞，其本身具有的仿生成分對細(xì)胞黏附、遷移、增殖和功能化等均具有很重要的意義。更進(jìn)一步地，生物墨水凝膠后內(nèi)部形成的凸起和溝槽等表面結(jié)構(gòu)都能調(diào)控細(xì)胞的行為。針對不同的組織與器官，細(xì)胞對應(yīng)的微環(huán)境也不盡相同。此外，選擇用于生物打印的細(xì)胞種類以及細(xì)胞空間分布狀態(tài)也均需要進(jìn)一步研究。體內(nèi)組織中的細(xì)胞是動態(tài)的，隨時可對外界環(huán)境的刺激做出響應(yīng)。如何構(gòu)建合適的組織培養(yǎng)器，從而充分模擬體內(nèi)組織與器官中細(xì)胞的生理狀態(tài)，使得細(xì)胞自行進(jìn)行重新分布，也是三維生物打印支架體外培養(yǎng)成熟的要點(diǎn)之一。

總之，生物打印功能化的組織和器官需要制造技術(shù)、材料科學(xué)、生物學(xué)和醫(yī)學(xué)等多個領(lǐng)域跨學(xué)科交叉結(jié)合。整個打印系統(tǒng)工藝還需要進(jìn)行生物安全性的評估和相應(yīng)法規(guī)標(biāo)準(zhǔn)考核。通過生物打印實(shí)現(xiàn)組織或器官的修復(fù)和功能重建，是一項(xiàng)極具科學(xué)挑戰(zhàn)的工作，需要廣大科研工作者的不懈努力。

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