黎桂妃 貢一峰,2 金 言 金 立 季黎明

1(中國(guó)科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院 生物醫(yī)藥技術(shù)研究所 深圳 518055)

2(上海大學(xué)生命學(xué)院 上海 200444)

3(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬同仁醫(yī)院老年科 上海 200336)

4(上海市靜安區(qū)市北醫(yī)院內(nèi)分泌科 上海 200443)

1 引 言

非編碼小 RNA(Small Noncoding RNAs，sncRNA)是物種間高度保守的、不編碼蛋白質(zhì)的 RNA，長(zhǎng)度在 17～250 個(gè)核苷酸[1-3]。非編碼小 RNA 具有廣泛的調(diào)節(jié)功能：如微小RNA(microRNA，miRNA)和小干擾 RNA(smallinterfering RNA，siRNA)等通過(guò) RNA 誘導(dǎo)沉默復(fù)合體到靶位點(diǎn)，發(fā)揮調(diào)控功能；如染色質(zhì)模型、轉(zhuǎn)錄后抑制和與 mRNA 3＇端配對(duì)后導(dǎo)致的mRNA 失穩(wěn)等[4]。

T 淋巴細(xì)胞是機(jī)體重要的免疫細(xì)胞[5]。研究顯示，非編碼小 RNA 參與了 T 細(xì)胞從發(fā)育、活化及功能行使等多個(gè)生物過(guò)程的調(diào)節(jié)[6]。因此，對(duì) T 細(xì)胞進(jìn)行非編碼小 RNA 的相關(guān)操作，對(duì)炎性疾病[7,8]、腫瘤[9]和感染[10]等疾病的基礎(chǔ)研究和臨床實(shí)踐都具有重大意義。但是，至今仍缺乏針對(duì) T 細(xì)胞，尤其是原代 T 淋巴細(xì)胞的小 RNA有效遞送方法。

目前，T 細(xì)胞對(duì) RNA 的攝取方法有間接和直接兩種。其中，間接方法主要通過(guò)病毒載體，如腺病毒和慢病毒[11]轉(zhuǎn)入相應(yīng)質(zhì)粒，進(jìn)而在感染細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行 RNA 表達(dá)。但病毒介導(dǎo)的導(dǎo)入受限于目標(biāo)細(xì)胞的擴(kuò)增，并且在突變、炎癥和免疫應(yīng)答等方面存在潛在風(fēng)險(xiǎn)。直接方法有電穿孔和核轉(zhuǎn)染(Nucleofector)，可直接對(duì) T 細(xì)胞進(jìn)行 RNA導(dǎo)入。該類(lèi)方法通過(guò)高電壓下 T 細(xì)胞細(xì)胞膜瞬時(shí)通透，小 RNA 可由此進(jìn)入，改變電轉(zhuǎn)參數(shù)可有效提高 RNA 轉(zhuǎn)染的效率。但是，電擊后細(xì)胞存活率過(guò)低[12]是這類(lèi)方法的主要缺陷。此外，還有合成載體，如陽(yáng)離子聚合物[13]、多肽[14]、脂質(zhì)體[15]等直接遞送技術(shù)，其可與 RNA 結(jié)合成帶正電荷的載體復(fù)合物，增加與帶負(fù)電荷的細(xì)胞膜之間的相互作用，進(jìn)而提高細(xì)胞的內(nèi)吞作用。以上間接與直接方法轉(zhuǎn)染效率均不高，并且材料載體對(duì)細(xì)胞具有較大毒性。Liu 等[16]嘗試構(gòu)建了納米遞載系統(tǒng)，對(duì)人類(lèi) T 細(xì)胞系及外周血 T 細(xì)胞進(jìn)行siRNA 傳遞。初步研究發(fā)現(xiàn)，單層壁碳納米管可有效將 siRNA 遞送至人源 T 細(xì)胞內(nèi)，但材料對(duì)細(xì)胞的毒性和效率都尚未闡述[17]。

T 細(xì)胞細(xì)胞膜表面存在唾液酸化修飾。通過(guò)唾液酸轉(zhuǎn)移酶來(lái)進(jìn)行唾液酸修飾，加上敲除小鼠模型的表型表明，唾液酸修飾參與 T 細(xì)胞成熟、分化、遷移和死亡過(guò)程的調(diào)控[18]。本研究利用 Ji 等[19]設(shè)計(jì)的選擇性靶向唾液酸的納米載體PEI-PBA——共軛連接了苯硼酸(Phenylboronic Acid，PBA)的小分子量(1.8 k)聚乙烯亞胺(Polyethylenimine，PEI)，介導(dǎo) T 淋巴細(xì)胞攝取miRNA 和 siRNA，并研究 T 細(xì)胞不同亞群對(duì)小RNA 攝取之間的差異。

2 材料與方法

2.1 材料

聚乙烯-苯硼酸(PEI-PBA)由中國(guó)科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院馬軼凡實(shí)驗(yàn)室合成；miRNA-FAM (miR01204)和 siRNA-FAM(siR05815)購(gòu)自廣州市銳博生物科技有限公司；人源外周血單核細(xì)胞(Peripheral Blood Mononuclear Cell，PBMC)培養(yǎng)細(xì)胞所用培養(yǎng)基為 AIM-V Medium CTS(購(gòu)自Gibco by life，貨號(hào)為 1860610)；刺激細(xì)胞所用磁珠為 Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28(購(gòu)自 Gibco by Thermo Fisher Scientific，貨號(hào)為00347615)；細(xì)胞增殖示蹤羥基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺脂(5(6)-Carboxyfluorescein Diacetate N-Succinimidyl Ester，CFSE)熒光探針(C1031)購(gòu)自碧云天生物科技有限公司；CCK-8 試劑盒(Cell Counting Kit，CK04)購(gòu)自 DOJINDO；流式分析抗體 anti-human CD3、anti-human CD8、anti-human CD4、anti-human TCRγ/δ、anti-human TCR Vδ2 及鼠源的 anti-mouse CD3、anti-mouse CD8a、anti-mouse CD4、anti-mouse TCRγ/δ、antimouse NK-1.1 購(gòu)自 Biolegend 公司。人外周血從 8位健康志愿者(21～25 歲，男性 6 位，女性 2 位)手臂抽取靜脈血獲得，所有操作均符合中國(guó)科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院人體倫理管理協(xié)議 SIATIRB-170305-H0415；C57BL/6 小鼠由廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心購(gòu)得，所有操作均符合中國(guó)科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院動(dòng)物倫理管理協(xié)議 SIAT-IRB-170306-YYS-JINY-A0321。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 人外周血 T 細(xì)胞培養(yǎng)

將采集的人外周血單核細(xì)胞(PBMC)用淋巴細(xì)胞分離液分離后，重懸于含 200 U/mL IL-2(白細(xì)胞介素 2)的(細(xì)胞治療級(jí))無(wú)血清細(xì)胞(AIM-V)培養(yǎng)基，置于 37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。用磁珠(Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28)刺激培養(yǎng)至第 6 天、第 8 天分別進(jìn)行相應(yīng)試驗(yàn)。

2.2.2 小鼠 T 細(xì)胞的培養(yǎng)

取 6～8 周 C57BL/6 小鼠胸腺和脾臟淋巴細(xì)胞，用含 10% FBS(胎牛血清)的 RPMI-1640 培養(yǎng)基(含 200 U/mL IL-2)重懸，置于 37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

2.2.3 CCK-8 測(cè)定

將用磁珠刺激培養(yǎng)至第 8 天的人源 T 細(xì)胞，鋪板于 96 孔板(每孔 2×104個(gè)細(xì)胞)，實(shí)驗(yàn)組加入 PEI-PBA(終濃度 8 ng/mL)培養(yǎng) 24 h 后，按照 CCK-8 試劑(DOJINDO，CK04)說(shuō)明書(shū)操作于 450 nm 處紫外分光光度計(jì)(BioTek)檢測(cè)吸光度值。

2.2.4 熒光染料 CFSE 測(cè)定

將磁珠刺激培養(yǎng)至第 6 天的人源 T 細(xì)胞：首先，用終濃度為 5 μmol/L 的熒光染料——羥基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺脂(CFSE)工作液避光染色 3 min；其次，用 1×PBS(磷酸鹽緩沖液)洗滌兩遍，重懸于 AIM-V 培養(yǎng)系統(tǒng)，以每孔 5×104個(gè)細(xì)胞鋪板于 24 孔板中，并加入材料PEI-PBA(終濃度 8 ng/mL)進(jìn)行培養(yǎng)；最后，培養(yǎng) 3 天后收集細(xì)胞，同時(shí)加入相應(yīng)抗體染色，待用 4% 多聚甲醛固定后，使用 FACS CANTO II(BD)進(jìn)行流式分析。

2.2.5 PEI-PBA 材料介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染系統(tǒng)在 T 細(xì)胞中對(duì)小 RNA 的轉(zhuǎn)染

首先，將相應(yīng)的 miRNA-FAM 或 siRNAFAM(終濃度 100 nmol/L)與 PEI-PBA 材料(終濃度 8 ng/mL)進(jìn)行混勻，在室溫孵育 10 min；其次，將前述混合材料體系移入對(duì)應(yīng)的 T 細(xì)胞(人源和鼠源)培養(yǎng)系統(tǒng)進(jìn)行培養(yǎng)，24 h 后收集細(xì)胞，用相應(yīng)抗體染色后，采用 FACS CANTO II(BD)流式分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 PEI-PBA 對(duì) T 淋巴細(xì)胞的細(xì)胞毒性試驗(yàn)

理想的載體本身不應(yīng)對(duì) T 淋巴細(xì)胞的生物表型及生物過(guò)程具有干擾。Ji 等[19]的研究已表明，PEI-PBA 材料本身對(duì)腫瘤細(xì)胞不具備細(xì)胞毒性。為了解 PEI-PBA 對(duì)正常的淋巴細(xì)胞，尤其是對(duì)T 淋巴細(xì)胞是否存在影響，本文以人類(lèi)外周血單核細(xì)胞為研究對(duì)象，首先將用 anti-CD3/CD28 磁珠刺激第 6 天進(jìn)入指數(shù)級(jí)擴(kuò)增的人外周血 T 淋巴細(xì)胞，采用活細(xì)胞熒光標(biāo)記染料 CFSE 工作液脈沖標(biāo)記后進(jìn)行培養(yǎng)(3 天)；其次，對(duì) 2 種處理的細(xì)胞：納米載體 PEI-PBA 處理和未處理(NC)細(xì)胞的增殖能力進(jìn)行了測(cè)定，并用流式分析顯示CD3+T 細(xì)胞的 CSFE 染色狀態(tài)。CFSE 實(shí)驗(yàn)的結(jié)果如圖1(a)所示：與空白對(duì)照組相比，PEI-PBA處理并不影響 T 細(xì)胞的增殖。

我們進(jìn)而通過(guò) CCK-8 實(shí)驗(yàn)測(cè)定了納米載體PEI-PBA 對(duì)細(xì)胞的毒性情況，CCK-8 效應(yīng)如圖1(b)所示。實(shí)驗(yàn)對(duì) anti-CD3/CD28 磁珠刺激第 8天的人外周血 T 淋巴細(xì)胞進(jìn)行測(cè)定。其中，NC為不加 PEI-PBA 材料的空白對(duì)照組，PEI-PBA 為終濃度 8 ng/mL 的 PEI-PBA 材料處理的樣品。結(jié)果顯示，當(dāng)空白對(duì)照組相對(duì)數(shù)值為 100% 時(shí)，PEI-PBA 平均值為 72.40%，二者無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。綜上所述，PEI-PBA 材料對(duì) T 淋巴細(xì)胞不具有明顯的細(xì)胞毒性作用。

3.2 非擴(kuò)增原代人外周血 T 淋巴細(xì)胞中 PEI-PBA介導(dǎo)的 miRNA 遞送效率

miRNA 是重要的調(diào)節(jié)分子，參與 T 細(xì)胞多種與細(xì)胞擴(kuò)增無(wú)關(guān)或偶聯(lián)的生物過(guò)程調(diào)控。對(duì)參與擴(kuò)增偶聯(lián)的 T 細(xì)胞而言，現(xiàn)有方法如慢病毒感染可實(shí)現(xiàn)對(duì)擴(kuò)增 T 細(xì)胞進(jìn)行基因操作的目的，從而替代 miRNA 的直接轉(zhuǎn)導(dǎo)。對(duì)非擴(kuò)增狀態(tài)下的 T 淋巴細(xì)胞而言，miRNA 遞送效率則更為低下。因此，本文以原代外周血 T 細(xì)胞為非擴(kuò)增模型，以 anti-CD3/CD28 刺激 PBMC 擴(kuò)增的 T 細(xì)胞為擴(kuò)增模型，分別考察了 PEI-PBA 介導(dǎo)的小 RNA 的攝取效率。

在人外周血原代外周血非擴(kuò)增模型中，與空白對(duì)照組相比，PEI-PBA 介導(dǎo)的 T 細(xì)胞 miRNA轉(zhuǎn)染效率明顯升高，具體結(jié)果如圖2(a)、2(b)所示。結(jié)果顯示，CD3+T 細(xì)胞的效率總體提高至 5.99%。其中，細(xì)胞亞群 CD4+T 細(xì)胞提高5.31%；CD8+T 細(xì)胞提高 6.66%；γδT 細(xì)胞的效率達(dá)到 11.10%，為原代 T 細(xì)胞中 miRNA 遞送效率最高的一種 T 細(xì)胞。

3.3 非擴(kuò)增原代人外周血 T 淋巴細(xì)胞中 PEI-PBA介導(dǎo)的 siRNA 遞送效率

siRNA 是重要的分子生物學(xué)研究方法和治療手段。本文檢測(cè)了 PEI-PBA 介導(dǎo) siRNA 對(duì)原代 T細(xì)胞的遞送效率，結(jié)果如圖2(c)、2(d)所示。在未擴(kuò)增的人外周血 T 細(xì)胞中，PEI-PBA 對(duì) CD3+T細(xì)胞的 siRNA 遞送效率達(dá)到 6.34%。其中，細(xì)胞亞群 CD4+T 細(xì)胞 4.85%，CD8+T 細(xì)胞 6.22%，γδT 細(xì)胞 14.45%。

總體而言，在未擴(kuò)增的原代 T 細(xì)胞體系中，PEI-PBA 介導(dǎo)的 siRNA 遞送效率與 miRNA的相當(dāng)，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)原代 T 細(xì)胞進(jìn)行小 RNA 水平操縱。

圖1 PEI-PBA 對(duì) T 細(xì)胞安全性評(píng)估Fig. 1 Cytotoxicity of PEI-PBA in T cell

圖2 PEI-PBA 材料介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染系統(tǒng)的人外周血 T 細(xì)胞未擴(kuò)增時(shí)各亞群對(duì)小 RNA 的攝取率Fig. 2 Uptake of small RNAs in T cell subsets of human PBMC by PEI-PBA

3.4 擴(kuò)增狀態(tài)下人源 T 淋巴細(xì)胞中的 PEI-PBA介導(dǎo)的 miRNA 遞送效率

隨后我們對(duì)經(jīng)過(guò) anti-CD3/CD28 磁珠刺激(8 天)并進(jìn)入指數(shù)級(jí)擴(kuò)增的人外周血 T 淋巴細(xì)胞進(jìn)行了 PEI-PBA 包裹的 miRNA 遞送效率檢測(cè)，結(jié)果如圖3(a)、3(b)所示。結(jié)果顯示，T細(xì)胞(CD3+T 細(xì)胞)整體攝入 miRNA 比例達(dá)到18.43%。其中，細(xì)胞亞群 CD4+T 細(xì)胞 14.59%，CD8+T 細(xì)胞 18.99%，γδT 細(xì)胞 25.98%?？梢?jiàn)，PEI-PBA 對(duì) CD3/CD28 活化擴(kuò)增至第 8 天的人外周 T 細(xì)胞顯示出有效的 miRNA 遞送能力，顯著高于非擴(kuò)增狀態(tài)的 T 細(xì)胞各亞群細(xì)胞。

3.5 擴(kuò)增狀態(tài)下人源 T 淋巴細(xì)胞中的 PEI-PBA介導(dǎo)的siRNA 遞送效率

與 PEI-PBA 介導(dǎo) miRNA 遞送效率不同的是，在 anti-CD3/CD28 磁珠刺激的人外周血 T淋巴細(xì)胞中，與非擴(kuò)增性原代 T 細(xì)胞組相比，PEI-PBA 介導(dǎo)的 siRNA 遞送效率并沒(méi)有發(fā)生顯著改變，結(jié)果如圖3(c)、3(d)所示。CD3+T 細(xì)胞的 siRNA 轉(zhuǎn)染效率為 5.52%。其中，細(xì)胞亞群 CD4+T 細(xì)胞 4.12%，CD8+T 細(xì)胞 5.82%，γδT細(xì)胞13.67%。T 細(xì)胞是否活化和擴(kuò)增，對(duì)各個(gè)亞群的 siRNA 轉(zhuǎn)染效率無(wú)關(guān)。

3.6 PEI-PBA 介導(dǎo)的原代鼠源 T 淋巴細(xì)胞小 RNA遞送效率

為檢測(cè) PEI-PBA 系統(tǒng)是否適用于鼠源 T 細(xì)胞，本文對(duì) C57BL/6 小鼠脾臟和胸腺 T 淋巴細(xì)胞進(jìn)行了 PEI-PBA 包裹小 RNA 的轉(zhuǎn)染：將終濃度為 100 nmol/L 的 miRNA 或 siRNA，與終濃度為8 ng/mL 的材料 PEI-PBA 共孵育后移入 C57BL/6小鼠脾臟和胸腺T細(xì)胞中培養(yǎng)24h并進(jìn)行流式分析。圖4 與附錄(圖Ⅰ、Ⅱ)結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，PEI-PBA 納米載體僅對(duì)小鼠脾臟 CD8+T細(xì)胞具有遞送效率，對(duì) miRNA 和 siRNA 的攝取效率分別提高至 1.72 % 和 1.85%，并具有顯著差異。

圖3 PEI-PBA 材料介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染系統(tǒng)的人外周血 T 細(xì)胞擴(kuò)增后各亞群對(duì)小 RNA 的攝取率Fig. 3 Uptake of small RNAs in T cell subsets of stimulated human PBMC by PEI-PBA

圖4 PEI-PBA 介導(dǎo)的原代鼠源脾臟 CD8+ T 淋巴細(xì)胞小RNA 遞送效率Fig. 4 Uptake of small RNAs in CD8+ T cell subsets of spleen from C57BL/6 mice by PEI-PBA

4 討論與小結(jié)

作為近來(lái)工程細(xì)胞治療的熱點(diǎn)細(xì)胞，T 細(xì)胞的轉(zhuǎn)染尤其是小 RNA 的轉(zhuǎn)染始終是領(lǐng)域中的技術(shù)難點(diǎn)。前期 Liu 等[16]和 Freeley 等[17]報(bào)道對(duì)人源 T 細(xì)胞進(jìn)行 siRNA 傳遞的納米管遞載系統(tǒng)，因缺乏對(duì)細(xì)胞毒性和效率的評(píng)估而無(wú)法進(jìn)行實(shí)際應(yīng)用。目前 siRNA 最廣泛應(yīng)用的 Nucleofector 系統(tǒng)，雖然核轉(zhuǎn)染效率較高，但轉(zhuǎn)染 24 h 內(nèi)細(xì)胞死亡率過(guò)高，僅 17% 的 T 細(xì)胞可以存活[20]。由于Nucleofector 的操作步驟復(fù)雜且昂貴，由死亡率反推要求大量的起始細(xì)胞數(shù)量，極大地限制了 T細(xì)胞中 siRNA 及小 RNA 的應(yīng)用和研究。

與腫瘤細(xì)胞一樣，T 細(xì)胞具有細(xì)胞膜表面唾液酸化修飾的細(xì)胞特征。選擇性靶向唾液酸的納米材料 PEI-PBA 在高唾液酸修飾的腫瘤細(xì)胞系統(tǒng)中已證明了安全性和有效性?；?T 細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞不同的代謝及修飾途徑，本文在 T 細(xì)胞系統(tǒng)中再次檢測(cè)了 PEI-PBA 的生物安全性。經(jīng) PEIPBA 處理的 T 細(xì)胞存活率達(dá) 72% 以上，并且對(duì)后續(xù)的 T 細(xì)胞增殖無(wú)影響，體現(xiàn)了較好的生物應(yīng)用價(jià)值。并且 PEI-PBA 介導(dǎo)的小 RNA 轉(zhuǎn)染方法對(duì)起始細(xì)胞數(shù)沒(méi)有要求，可對(duì)低細(xì)胞數(shù) T 細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作，操作方法步驟簡(jiǎn)單、快速，結(jié)合其較高的轉(zhuǎn)染效率，如對(duì)人外周血 CD3+T 細(xì)胞18.43% 的小 RNA 轉(zhuǎn)染效率，可有效地滿足研究和應(yīng)用的需求。

本文工作系統(tǒng)地比對(duì)了人、鼠兩種來(lái)源 T 細(xì)胞的不同亞群，以及不同類(lèi)型小 RNA(miRNA和 siRNA)攝取之間的差異。結(jié)果顯示，納米載體 PEI-PBA 可以簡(jiǎn)單、安全、有效地介導(dǎo)人源 T淋巴細(xì)胞小 RNA 轉(zhuǎn)染，但對(duì)鼠源 T 淋巴細(xì)胞基本無(wú)效。就人源 T 淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)染而言，PEI-PBA可有效介導(dǎo) miRNA 的轉(zhuǎn)染，且效率在活化擴(kuò)增后有顯著提高；而 PEI-PBA 介導(dǎo)的 siRNA 轉(zhuǎn)染效率則不受 T 細(xì)胞狀態(tài)影響。在不同的 T 細(xì)胞群體，如 CD4+T 細(xì)胞、CD8+T 細(xì)胞和γδT 細(xì)胞中，PEI-PBA 介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染效率不同，其中對(duì)γδT細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率最高。這可能與不同細(xì)胞亞群細(xì)胞膜表面的唾液酸水平相關(guān)。另外，由于個(gè)體差異，轉(zhuǎn)染效率在不同志愿者中差異較大，導(dǎo)致結(jié)果的統(tǒng)計(jì)方差也較大。

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