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肝螺桿菌(Helicobacterhepaticus,H.h)是肝腸螺桿菌屬(EnterohepaticHelicobacterSpecies)中一員，可感染多種哺乳動物。1992年，F(xiàn)ox等人在Fredrick-Institute癌癥中心研究癌癥藥物作用時，從A/JCr小鼠肝臟中發(fā)現(xiàn)并分離出Hh，且該菌也是螺桿菌屬中第一個被報導(dǎo)可誘發(fā)肝癌的病原[1]。Hh自然宿主是鼠類嚙齒動物，大鼠和小鼠的感染率較高[2]，但在人類肝臟組織中也有檢出報導(dǎo)，猜測是一種細(xì)菌-肝炎-肝癌的發(fā)病模式[3]。用Hh感染小鼠，尤其是免疫缺陷鼠，引發(fā)慢性活動性肝炎、結(jié)腸炎、肝細(xì)胞癌和結(jié)腸癌，該癥狀與人類相關(guān)疾病極其相似，可為研究癌癥發(fā)生機(jī)制提供模型[4-6]。用CD41T細(xì)胞表達(dá)高水平CD45RB形成的CD45RBhighCD4+T細(xì)胞與Hh聯(lián)合感染小鼠可制備炎性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)模型，該模型與人類IBD病理特征類似[7]，其有利于研究人類慢性炎性腸病。

此外，Hh感染也與人類其它疾病相關(guān)。Tahereh等發(fā)現(xiàn)Hh可通過污染的水和食物侵入人體組織，產(chǎn)生致癌物并破壞正常細(xì)胞DNA結(jié)構(gòu)[4]。Hamada等采用膽汁標(biāo)本原位分析技術(shù)對膽結(jié)石、膽囊炎和膽囊息肉患者進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)膽汁中存在Hh，證實(shí)Hh可能與人類肝膽疾病有關(guān)[8]。血清流行病學(xué)調(diào)查顯示，健康人群血清中Hh陽性率為26.7%，肝膽疾病患者(乙肝和丙肝陰性)的Hh抗體陽性率為38.7%，乙肝或/和丙肝患者抗體陽性率在60%以上[9]，而膽結(jié)石和膽囊瘤患者的Hh陽性率分別高達(dá)82%和87.5%[10]，提示Hh感染可促成病毒性肝炎轉(zhuǎn)變成肝膽腫瘤。Hh還能引發(fā)乳腺癌，可能是宿主免疫失調(diào)導(dǎo)致癌細(xì)胞擴(kuò)散的結(jié)果[11]。Hh感染后，臨床表現(xiàn)的多樣性揭示其致病機(jī)制的復(fù)雜性，本文就Hh的毒力因子及其致病機(jī)制研究進(jìn)展作簡要概括。

1 細(xì)胞致死性腫脹毒素

細(xì)胞致死性腫脹毒素(Cytolethal distending toxin，CDT)是革蘭氏陰性菌的毒力因子，它是由cdtB基因編碼的A亞單位和cdtA、cdtC基因聯(lián)合編碼的B亞單位構(gòu)成的異源二聚體A-B2[12]。CDT的致病機(jī)制主要有兩方面：

1.1阻斷G2/M期cdtB是CDT的毒性基因，通過CdtA連接細(xì)胞膜上的脂筏，依靠動力將CdtB蛋白胞吞入膜內(nèi)，再由CdtC將CdtB移入胞核[13]。CdtB進(jìn)入核內(nèi)后，表達(dá)類似脫氧核糖核酸酶I的功能，導(dǎo)致DNA雙鏈斷裂[14-15]。斷裂后的DNA刺激ATM激酶，通過磷酸化作用激活Chk2激酶，活化的p-Chk2激活CDC25C磷酸酶，降低CDC25C磷酸酶的活性，使細(xì)胞G2/M期阻滯。同時，p-Chk2還參與激活p53，活化的p-p53加快細(xì)胞周期依賴性激酶抑制劑p21的合成，使p21與cyclin B/p-Cdk1形成復(fù)合體，阻止cyclin B/p-Cdk1脫磷酸化，導(dǎo)致G2期終止[16]。該機(jī)制由CDT損傷細(xì)胞DNA來阻斷細(xì)胞G2/M期，引起細(xì)胞凋亡。

1.2激活NF-κB信號通路 NF-κB是由p50和p65組成的二聚體，HhCDT可激活NF-κB信號通路引發(fā)炎癥。靜息狀態(tài)時，胞漿中NF-κB與抑制因子IκB結(jié)合形成三聚體p50-p65-IκB。CDT進(jìn)入胞漿激活聚合物，IκB解離，p50上轉(zhuǎn)移信號將NF-κB轉(zhuǎn)入核內(nèi)，p65暴露結(jié)合位點(diǎn)，與DNA結(jié)合。IBD患者結(jié)腸細(xì)胞中的NF-κB通路被CDT激活，并進(jìn)入核內(nèi)與DNA的κB位點(diǎn)結(jié)合，引發(fā)炎癥，結(jié)合若不被及時終止，炎癥則無法消退，暗示Hh感染會影響IBD發(fā)展[14]。NF-κB還可調(diào)節(jié)白細(xì)胞介素、腫瘤壞死因子、凋亡抑制因子等多基因表達(dá)，參與炎癥、腫瘤、發(fā)育不良等多種病理生理過程[17]。例如造血細(xì)胞中NF-κB的p50亞基能與IL-10抗體聯(lián)合抑制結(jié)腸炎發(fā)展，提示在先天免疫中，NF-κB的亞基能促進(jìn)IL-10抗體抑制腸炎[18]。

2 抗氧化酶

氧化應(yīng)激(oxidative stress)是機(jī)體受外來物質(zhì)刺激時，高活性分子如活性氧自由基產(chǎn)生過多，氧化物無法將其徹底清除，高活性分子可破壞細(xì)胞膜并損傷細(xì)菌核酸結(jié)構(gòu)，使骨架單雙鏈斷裂，引入外來堿基和糖基，交聯(lián)其他分子，使細(xì)胞復(fù)制中止。Hh進(jìn)化過程中產(chǎn)生的過氧化氫酶和氫化酶可催化活性分子，抵抗宿主氧化反應(yīng)。

2.1過氧化氫酶 過氧化氫是一種由宿主細(xì)胞釋放的活性氧自由基，使細(xì)菌氧化應(yīng)激死亡。研究表明，感染Hh的小鼠，體內(nèi)的8-氧鳥嘌呤和脂質(zhì)過氧化水平會顯著升高，說明其氧化大分子數(shù)量會在感染期間增加[19]。Hh的過氧化氫酶KatA，可將宿主細(xì)胞產(chǎn)生的過氧化氫分解成氧氣和水，從而減少細(xì)菌的氧化應(yīng)激效應(yīng)。細(xì)菌通過該方式可持續(xù)侵襲宿主，導(dǎo)致機(jī)體免疫力降低。過氧化氫酶常存在于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞間質(zhì)中，但只有細(xì)胞間質(zhì)中過氧化氫酶具有分解過氧化氫的能力并傳遞免疫應(yīng)答信號[1]。

2.2氫化酶 氫化酶是Hh內(nèi)含鎳金屬酶，可催化氫氣氧化成質(zhì)子和電子，并產(chǎn)生能量儲存于菌體中。其能量會被用于合成其他毒力因子或酶來誘發(fā)肝炎、腸炎和腸壞疽等疾病[20]。已知Hh氫化酶亞基有四種，分別為HyaA、HyaB、HyaC、HyaD，其中HyaB蛋白含量最高。研究表明，在含氫的液態(tài)環(huán)境中，野生型Hh與敲除hyaB基因的突變株相比，前者的生長狀況更好，表明hyaB基因參與氫化酶氧化氫氣的過程[20]。而同時敲除hyaA和hyaB基因，氫化酶便喪失活性，提示該基因在呼吸酶中起重要作用[21]。

2.3鐵蛋白DPS DPS(DNA binding protein from starved cells，DPS)屬于鐵蛋白家族，它是細(xì)菌復(fù)雜防御系統(tǒng)的一部分，用于保護(hù)細(xì)菌DNA免受氧化損傷。YANG等報導(dǎo)：野生型Hh在含5%氧的條件下也生長良好，而敲除dps基因的突變株在含3%氧的條件下都無法生長[22]。DPS易形成α螺旋，在其首個N端富含大量賴氨酸殘基，是DNA的結(jié)合位點(diǎn)。盡管所有DPS均能與亞鐵離子結(jié)合，但它們不能連接DNA，無法起保護(hù)DNA的作用[23]。HhDPS在鐵離子參與下能增強(qiáng)對DNA的結(jié)合能力，而在缺乏鐵離子的情況下，DPS蛋白會聚合在一起形成低聚物，導(dǎo)致結(jié)合DNA的能力減弱[22]。DPS與細(xì)菌的DNA結(jié)合，其復(fù)合物可保護(hù)Hh免受氧化應(yīng)激，以適應(yīng)宿主環(huán)境逃避免疫攻擊。

4 尿素酶

大約有40%的肝腸螺桿菌可產(chǎn)生尿素酶，包括Hh[24]。Hh尿素酶是一種以金屬鎳為輔因子的多聚體脲酶，其包含兩個結(jié)構(gòu)基因(ureAB)，編碼尿素酶的結(jié)構(gòu)蛋白和五個輔助基因(ureIEFGH)，編碼輔助蛋白。尿素酶活性是由活性部位鎳含量決定的，而提高鎳含量則需輔助蛋白將Ni2+插入到活性部位。研究表明，分別敲除ureF、ureG、ureH基因會使尿素酶失活，而敲除ureE基因僅降低其活性[25]，表明ureE是尿素酶的非活性成分表達(dá)所必需基因。Hh尿素酶ureI基因上游無啟動子，其必然會影響轉(zhuǎn)錄，提示該系統(tǒng)可能僅協(xié)助氮水平代謝和提供銨鹽的儲存場所[26]。盡管如此，尿素酶可水解尿素產(chǎn)生氨，由于Hh對酸敏感，其尿素酶也無法適應(yīng)酸性條件，而尿素酶水解尿素產(chǎn)生的氨與酸中和，為Hh生長提供適宜環(huán)境[27]。且氨也具有細(xì)胞毒性，可阻止氫離子進(jìn)入粘膜組織，并大量聚集于粘膜外側(cè)，造成細(xì)胞損傷。

5 鞭毛蛋白

Hh具有兩級鞭毛，其結(jié)構(gòu)是由flaA和flaB基因編碼的兩個鞭毛蛋白FlaA和FlaB。鞭毛是Hh的運(yùn)動器官，鞭毛蛋白也是一種重要的毒力因子。鞭毛既可促進(jìn)細(xì)菌運(yùn)動，也能吸附于粘膜表面[6]，對機(jī)體造成損傷。其中由等位基因flaA1和flaA2編碼的FlaA蛋白起吸附作用[28]，F(xiàn)ox等表明，flaA-基因突變株的Hh無運(yùn)動性且不能定植于粘膜表面，而flaA1基因在細(xì)菌運(yùn)動中起主要作用。Hh的FlaB蛋白是僅由T細(xì)胞介導(dǎo)的抗原，具有一定的保守性，于是可利用flaB基因作為鑒定Hh的特異性基因[29]。

6 黏附素和外膜蛋白

黏附素(Adhesins)是細(xì)菌表面具有附著作用的集合體，宿主細(xì)胞中存在由糖蛋白和糖脂組成的黏附受體，黏附素可直接將Hh黏附在宿主細(xì)胞表面[30]。不同細(xì)菌黏附上皮細(xì)胞的過程有所差別，但主要經(jīng)過兩個步驟：首先依靠靜電力、疏水作用力、粘膜接觸等趨化作用，與上皮細(xì)胞發(fā)生非特異性接觸，再借助分子間化學(xué)鍵使細(xì)菌與受體發(fā)生特異性結(jié)合[31]。Hh黏附上皮細(xì)胞，為其在宿主內(nèi)繁殖、引起疾病創(chuàng)造良好條件，但具體黏附機(jī)制仍不清楚。

外膜蛋白(Outer membrane proteins)是僅存于革蘭氏陰性菌中的特殊蛋白，可與其他物質(zhì)協(xié)同作用增強(qiáng)致病性。與Hh相關(guān)的外膜蛋白是由11個基因編碼的Hor蛋白家族，該蛋白具體功能尚不明[1]。研究表明，外膜蛋白和黏附素能促進(jìn)細(xì)菌定植于宿主細(xì)胞具有相同原理[32]，且外膜蛋白可引起細(xì)胞因子釋放，如IL-1、IL-17、TNF-α等，引發(fā)炎癥[33]。

7 脂多糖

脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁中的特殊成分，屬內(nèi)毒素。HhLPS的毒性成分為短鏈脂肪酸構(gòu)成的脂質(zhì)A，是固有免疫最強(qiáng)的誘導(dǎo)劑[34]。LPS具有高效的生物學(xué)活性，不僅能激活T、B淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞，還能促進(jìn)細(xì)胞因子生成。研究顯示，在感染鼠體內(nèi)，Hh的LPS可協(xié)助其逃避胃粘膜的固有免疫，造成全身性炎癥等綜合反應(yīng)[28]。細(xì)胞膜上的CD14分子，可與LPS結(jié)合轉(zhuǎn)入膜內(nèi)，產(chǎn)生后續(xù)效應(yīng)。還有報道表明由LPS組成的復(fù)合物作為配體可與膜表面TLR4受體相連參與激活NF-κB通路，引發(fā)炎癥，但該復(fù)合物具體結(jié)構(gòu)仍未可知[35]。

8 毒力相關(guān)基因

Hh毒力基因(virulence-associated genes)存在于其染色體和質(zhì)粒中，編碼相關(guān)毒力基因的區(qū)域叫毒力島，同時該基因還兼有編碼與侵襲力相關(guān)的T6SS系統(tǒng)功能。

8.1毒力島 毒力島(Pathogenicity Island，PAI)是由Hh染色體組編碼的多個相關(guān)毒力因子，它們DNA的G+C含量有明顯差異[30]。大多數(shù)毒力島與tRNA基因有關(guān)，它們與細(xì)菌染色體組tRNA保守區(qū)高度毗連，兩翼各有一段可識別切割酶的正向重復(fù)序列(direct repeats，DR)。Hh基因組區(qū)域中有一個71 kb大小的HHGI1基因，該基因也呈現(xiàn)Hh毒力島的功能特點(diǎn)[30]，但研究發(fā)現(xiàn)HHGI1與tRNA無關(guān)，兩翼也無DR存在。用雄性A/JCr小鼠感染敲除完整或部分HHGI1基因的突變株，肝炎的發(fā)病率均降低[36]。敲除同源基因組HhPAId1的Hh接種于IL-10-/-的B6.129小鼠，與接種Hh標(biāo)準(zhǔn)株的對照小鼠相比，前者在腸內(nèi)有更高的表達(dá)水平，但盲腸結(jié)腸炎和組織增生的發(fā)病率卻降低[37]，而血清學(xué)調(diào)查也顯示突變株的Th1型免疫相關(guān)IgG2c抗體含量明顯低于野生型抗體含量，提示宿主激活免疫應(yīng)答抑制Hh盲腸和結(jié)腸mRNA對促炎因子如IFN-γ、TNF-α、IL-17a的表達(dá)水平[6]，證明HHGI1是Hh毒力基因，可調(diào)節(jié)細(xì)胞因子炎性介質(zhì)。

8.2Ⅵ型分泌系統(tǒng)(T6SS)基因組 Chow等[38]發(fā)現(xiàn)，HHGI1為一組由12個基因(HH0237、HH0242-HH0245、HH0247-HH0252、HH0291)編碼的一系列蛋白組成的分泌機(jī)制，這些蛋白包括結(jié)構(gòu)蛋白、效應(yīng)蛋白、調(diào)節(jié)蛋白和分子伴侶蛋白，該機(jī)制稱為細(xì)菌的Ⅵ型分泌系統(tǒng)(T6SS)以倒置形式鑲嵌于細(xì)胞膜[39]。T6SS通過絲/蘇氨酸激酶和磷酸酶途徑信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，利用結(jié)構(gòu)蛋白將效應(yīng)蛋白由細(xì)菌內(nèi)膜—周質(zhì)—外膜路徑轉(zhuǎn)運(yùn)到宿主細(xì)胞[40]。效應(yīng)蛋白可在Hcp管道中通過，由一種類似“針頭結(jié)構(gòu)”的VgrG三聚體協(xié)助下穿透細(xì)菌細(xì)胞膜，將效應(yīng)蛋白釋放到宿主體內(nèi)，引起免疫反應(yīng)[41]。將HhT6SS中HH0252基因敲除，感染該突變株比野生型表達(dá)IL-17、IL23、TNF-α、IFN-γ等細(xì)胞因子的水平更高[38]，患結(jié)腸炎概率也更高。目前對T6SS的研究甚少，且T6SS的復(fù)雜性遠(yuǎn)高于前5種分泌系統(tǒng)，同時還能影響細(xì)菌與機(jī)體間相互作用，所以需要更為深入研究。

9 討 論

從最初發(fā)現(xiàn)Hh到對其致病性研究已有20多年，近幾年，人類腸道疾病逐漸成為研究熱點(diǎn)。在腸道性疾病中，微生物感染起主要作用，而腸炎又能引發(fā)腫瘤性疾病，這對人類生命安全造成巨大威脅。目前IBD是人類最為關(guān)注的腸道疾病之一，但因其病程長，病因復(fù)雜，涉及多方面因素，因此該病發(fā)生發(fā)展難以得到有效控制且治療效果不理想。

本文從免疫角度出發(fā)，通過介紹Hh毒力因子，以期理解人類機(jī)體炎性腸病以及惡性腫瘤的發(fā)生機(jī)制，從而研發(fā)能治療或預(yù)防慢性肝炎以及炎性腸病的新藥物。對于Hh研究主要應(yīng)用于嚙齒類動物，利用Hh構(gòu)建小鼠IBD模型可促進(jìn)理解人類腸道疾病發(fā)生經(jīng)過以及病理變化，為拓寬IBD研究思路提供新方向。

我國罹患肝炎、炎性腸病人數(shù)眾多，且傳播迅速。Hh毒力因子研究表明，微生物在致病過程的影響力越來越大，而人體中某些蛋白可作為免疫學(xué)中的重要監(jiān)視者，存在于大多數(shù)細(xì)胞，能控制基因參與炎癥反應(yīng)，因此必須了解蛋白功能，才能想出應(yīng)對疾病難題的方法。

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