(沈陽理工大學(xué),遼寧沈陽 110159)

葉酸(folic acid)又稱VB9,是一種重要的B族維生素,是維持人體正常物質(zhì)代謝和某些特殊生理功能不可缺少的一類低分子有機(jī)化合物,在人體生長(zhǎng)、代謝、發(fā)育過程中發(fā)揮著重要的作用[1-3]。運(yùn)動(dòng)飲品是根據(jù)人體運(yùn)動(dòng)的生理消耗而配制的,主要含有碳水化合物、電解質(zhì)、維生素和氨基酸等營(yíng)養(yǎng)成分。人體飲用運(yùn)動(dòng)飲品后能合理補(bǔ)充所需的營(yíng)養(yǎng)成分,平衡新陳代謝,提高機(jī)體的抗疲勞能力4-5]。國(guó)標(biāo)GB 15266-2009《運(yùn)動(dòng)飲料》中[6],僅針對(duì)維生素C、硫胺素和核黃素這3種維生素作出了限量要求,并未對(duì)葉酸含量作出限量要求,但是針對(duì)特殊人群的飲品,有必要了解其葉酸的含量,以便保障人們科學(xué)、定量地?cái)z入此種維生素。

國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)中檢測(cè)葉酸的方法有紫外分光光度法、熒光法、液相色譜法、氣質(zhì)聯(lián)用和高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用等[7-13]。國(guó)標(biāo)方法中,GB/T 5009.211-2008《食品中葉酸的測(cè)定》和GB 5413.16-2010《嬰幼兒配方食品和乳品中葉酸(葉酸鹽活性)測(cè)定》中對(duì)食品、嬰兒食品和乳制品中葉酸的測(cè)定采用微生物法[14-15],此方法周期長(zhǎng)、步驟繁瑣、重復(fù)性差,影響因素多。本研究利用質(zhì)譜的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式的選擇性和特異性,結(jié)合運(yùn)動(dòng)飲品的基質(zhì)成分相對(duì)簡(jiǎn)單的特點(diǎn),簡(jiǎn)化了樣品的前處理過程,建立一種超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定運(yùn)動(dòng)飲品中葉酸的方法,靈敏度高、線性范圍寬,極大地提高了檢測(cè)效率,推廣可行性較高,為運(yùn)動(dòng)飲品中葉酸含量的測(cè)定提供技術(shù)支持和參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

標(biāo)準(zhǔn)品葉酸 美國(guó)Sigma公司;乙腈、甲醇 色譜純,美國(guó)Fisher Scientific公司;甲醇、乙醇、亞鐵氰化鉀、乙酸鋅 分析純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;超純水 由Mmi-Q Advantage A10超純水機(jī)制得。

超高效液相色譜儀 美國(guó)安捷倫公司;四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀 美國(guó)AB公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 超高效液相色譜條件的優(yōu)化 本實(shí)驗(yàn)先對(duì)色譜條件中的色譜柱及流動(dòng)相進(jìn)行優(yōu)化。色譜柱比較了C18(2.1 mm×150 mm,3 μm)和T3(2.1 mm×150 mm,3 μm)這2種常用的色譜柱[16-18];對(duì)甲醇(A)-水(B)、甲醇(A)-0.1%甲酸水溶液(B)以及10%甲醇水溶液(A)-0.1%甲酸水溶液(B)3種流動(dòng)相進(jìn)行優(yōu)化選擇,流動(dòng)相梯度洗脫程序見表1。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program of mobile phase

1.2.2 質(zhì)譜檢測(cè)器參數(shù)的優(yōu)化 采用針泵連續(xù)進(jìn)樣的方式,在正離子模式(ESI+)下,對(duì)濃度為100 ng/mL的葉酸的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行母離子全掃描,確定其分子離子,優(yōu)化母離子的錐孔電壓。再在上述母離子的基礎(chǔ)上,對(duì)其子離子進(jìn)行全掃描,選擇兩組豐度最高的離子,較高的作為定量離子,次之的為定性離子,并對(duì)噴霧電壓、離子源溫度、碰撞氣、掃描停滯時(shí)間、去簇電壓及碰撞電壓等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制 稱取一定量的葉酸標(biāo)準(zhǔn)品,配制成濃度為2.0、10.0、20.0、50.0、100.0 ng/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液,現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2.4 樣品前處理?xiàng)l件的優(yōu)化 運(yùn)動(dòng)飲品若直接上樣測(cè)定其中的葉酸含量,樣品中的干擾成分太多會(huì)影響測(cè)定結(jié)果,故要對(duì)運(yùn)動(dòng)飲品中的一些干擾基質(zhì)進(jìn)行沉淀以達(dá)到凈化的效果。在對(duì)葉酸目標(biāo)物提取的過程中,目標(biāo)成分為水溶性維生素,容易在提取過程中被破壞或被樣品中沉淀物所吸附[19],本實(shí)驗(yàn)參考相關(guān)文獻(xiàn)[20-23],結(jié)合葉酸是水溶性物質(zhì)的特性以及樣品為運(yùn)動(dòng)飲品的特性,本實(shí)驗(yàn)結(jié)合葉酸成分的化學(xué)性質(zhì)以及運(yùn)動(dòng)飲品的特性,比較了亞鐵氰化鉀溶液(106 g/L)+乙酸鋅溶液(219 g/L)混合液、10%甲醇、10%乙醇、10%乙腈等4種提取液對(duì)目標(biāo)物的提取效果。分別稱取10 g的運(yùn)動(dòng)飲料,加入10 mL提取溶液,用去離子水定容至50 mL,劇烈震搖1 min,以5000 r/min的速度離心5 min,取上清液過0.45 μm濾膜后進(jìn)行上機(jī)檢測(cè)。

1.2.5 加標(biāo)回收及與國(guó)標(biāo)方法對(duì)比實(shí)驗(yàn) 以已知目標(biāo)成分含量的運(yùn)動(dòng)飲品為基質(zhì),加入葉酸標(biāo)準(zhǔn)溶液,選擇優(yōu)化后的條件上機(jī)檢測(cè),并與現(xiàn)有國(guó)標(biāo)方法(GB/T 5009.211-2008)的測(cè)定結(jié)果對(duì)比,檢驗(yàn)其方法的有效性。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜柱及流動(dòng)相的選擇

食品中葉酸的檢測(cè)比較常用的色譜柱有C18柱和T3柱,葉酸在反相C18柱上的保留能力較弱,目標(biāo)物總離子流圖的分析效果不理想;但是在T3柱上保留效果較好,原因是由于以離子形態(tài)存在的葉酸組分能與T3柱上基團(tuán)的離子鍵形成氫鍵,這種結(jié)合力比C18反相柱上的分子間作用力更強(qiáng),在分離時(shí)更具有優(yōu)勢(shì),目標(biāo)物的分離效果更好,所以本實(shí)驗(yàn)選擇T3柱作為葉酸的分析色譜柱。

在選擇T3柱作為葉酸分析色譜柱的前提下,參考相關(guān)文獻(xiàn)[24-28],考察甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸水以及10%甲醇-0.1%甲酸3種流動(dòng)相對(duì)葉酸分析結(jié)果的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),10%甲醇-0.1%甲酸作為流動(dòng)相時(shí),葉酸的分離效果最好,分離度高,峰形尖銳,基線穩(wěn)定。

2.2 質(zhì)譜檢測(cè)器參數(shù)的優(yōu)化

優(yōu)化后的質(zhì)譜參數(shù)為:噴霧電壓4000 V、離子源溫度400 ℃、氮?dú)饬髁?0 L/min、掃描停滯時(shí)間50 ms,其他質(zhì)譜參數(shù)見表2。

表2 葉酸的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)掃描模式的質(zhì)譜參數(shù)Table 2 Mass spectrometric parameters of a multi reaction monitoring scan for folic acid

注：“*”定量離子(Quantitative ion)。

依照表2所設(shè)定的質(zhì)譜條件,以及超高效液相色譜的條件,選擇多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM)進(jìn)行檢測(cè),葉酸與其他成分能在5 min內(nèi)快速分離,葉酸的MRM圖如圖1所示,子離子掃描圖如圖2所示。

圖1 葉酸的MRM圖Fig.1 MRM chromatogram of folic acid

表3 葉酸的保留時(shí)間、標(biāo)準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)、檢出限與定量限Table 3 Retention time,standard curve,correlation coefficient,detection limit and quantitative limit of folic acid

表4 方法的回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=5)Table 4 Recoveries and relative standard deviations(RSD)of the method(n=5)

圖2 葉酸的離子掃描質(zhì)譜圖 Fig.2 Ion scan of folic acid

注：“結(jié)果1”為按本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化后條件測(cè)定的加標(biāo)回收結(jié)果,“結(jié)果2”為按國(guó)標(biāo)GB/T 5009.211-2008 《食品中葉酸的測(cè)定》測(cè)定的加標(biāo)回收結(jié)果。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,葉酸在2.0～100.0 ng/mL內(nèi)均具有良好的線性關(guān)系(R2>0.999),目標(biāo)組分的檢出限為1.0 μg/kg,定量限為3.0 μg/kg,結(jié)果見表3。

2.4 樣品前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

4種提取液對(duì)葉酸回收率的影響如圖3所示,其中10%乙腈為提取液時(shí),運(yùn)動(dòng)飲品中的葉酸回收率最高,然后依次為10%乙醇、10%甲醇和混合沉淀劑;當(dāng)提取液為亞鐵氰化鉀溶液(106 g/L)+乙酸鋅溶液(219 g/L)混合沉淀劑時(shí),雖然樣品中的基質(zhì)沉淀效果明顯,但是葉酸的回收率不高,可能是混合沉淀劑對(duì)運(yùn)動(dòng)飲品中的葉酸有一定的吸附作用;其中10%乙醇提取率雖不及10%乙腈的提取效果好,但是考慮到乙腈的毒性比乙醇大,以及成本問題,所以本實(shí)驗(yàn)選擇10%乙醇作為運(yùn)動(dòng)飲品葉酸成分的提取液。

圖3 提取液對(duì)葉酸的平均回收率的影響Fig.3 The effect of extract solution on the average recovery rate of folic acid

樣品經(jīng)過前處理與未經(jīng)前處理的色譜圖對(duì)比如圖4所示,我們可以很直觀的看出來,樣品經(jīng)10%乙醇處理后,可以有效地去除掉一些雜質(zhì)干擾峰,減少基質(zhì)效應(yīng)的干擾,能夠更準(zhǔn)確的定量目標(biāo)化合物。

圖4 兩種處理方式的色譜圖比較Fig.4 The chromatograms of two treatment methods for comparison

2.5 加標(biāo)回收及與國(guó)標(biāo)方法對(duì)比實(shí)驗(yàn)

在上述優(yōu)化后的條件下,利用已測(cè)定葉酸含量的運(yùn)動(dòng)飲品進(jìn)行加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn),分別添加50、100、200 μg/100 g 3個(gè)梯度濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液,每個(gè)濃度平行測(cè)定5次,測(cè)定結(jié)果見表4。

由表4可見,結(jié)果1葉酸的加標(biāo)回收率為91.9%～98.0%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為2.6%～3.2%,說明本實(shí)驗(yàn)所建立的方法具有可靠的準(zhǔn)確度和精密度。與結(jié)果2對(duì)比發(fā)現(xiàn),本實(shí)驗(yàn)的測(cè)定結(jié)果與國(guó)標(biāo)方法基本一致,符合檢測(cè)要求。

3 結(jié)論

本文建立了一種超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)運(yùn)動(dòng)飲品中葉酸含量的分析方法。結(jié)果表明,通過優(yōu)化后的色譜及質(zhì)譜條件,在MRM掃描模式下,樣品經(jīng)過10%乙醇提取后,可有效去除運(yùn)動(dòng)飲品中的復(fù)雜基質(zhì),可實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)化合物的凈化,能準(zhǔn)確、快速、有效地檢測(cè)運(yùn)動(dòng)飲品中的葉酸成分。本方法具有快速、簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、靈敏等特點(diǎn),可對(duì)較寬濃度范圍內(nèi)的葉酸含量進(jìn)行分析,有助于提高食品檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室的分析效率,降低成本,為運(yùn)動(dòng)飲品中葉酸的測(cè)定提供參考。

[1]蒲明清,戴舒春,張連龍,等.超高效液相色譜法測(cè)定保健食品中的多種水溶性維生素[J].現(xiàn)代食品科技,2012,28(7):886-889.

[2]Aslam J,Khan S H,Khan S A. Quantification of water soluble vitamins in six date palm(Phoenix dactylifera L.)cultivar’s fruits growing in Dubai,United Arab Emirates,through high performance liquid chromatography[J]. Journal of Saudi Chemical Society,2013,17(1):9-16.

[3]Beitane I,Ciprovica I. The study of added prebiotics on B group vitamins concentration during milk fermentation[J]. AC Romanian Biotechnology Letters,2011,16(6):92-96.

[4]蔣俊樹,趙彬.高效液相色譜法測(cè)定能量飲料中多種水溶性維生素[J].食品科學(xué),2008,29(12):635-637.

[5]王榮艷,賈麗,錢春燕. HPLC-PDA法同時(shí)測(cè)定功能性飲料中9種水溶性維生素[J].現(xiàn)代科學(xué)儀器,2010,8(4):98-101.

[6]中華人民共和國(guó)國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局,中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì).GB/T 15266-2008 運(yùn)動(dòng)飲料[S]. 北京:中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社,2008

[7]劉莉治,羅曉燕,周洪偉,等.高效液相色譜柱后衍生法測(cè)定嬰幼兒食品中的葉酸[J]. 中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,2007,17(7):1179-1180.

[8]聶啟興,馮蕾,張媛媛,等.高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定發(fā)酵前后果蔬中4種水溶性維生素[J].食品科學(xué),2015,36(20):101-104.

[9]陳新,張風(fēng),李健.反相離子對(duì)高效液相色譜法測(cè)定啤酒中的B族維生素[J].釀酒科技,2015(12):119-121.

[10]葉翠平,譚兆平,區(qū)碩俊.反相離子色譜法同時(shí)檢測(cè)皮炎軟膏中的6種水溶性維生素成分含量[J].食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào)，當(dāng)代化工,2016(8):2050-2053.

[11]Champagne C P,Tompkins T A,Buckley N D,et al. Effect of fermentation by pure and mixed cultures of Streptococcus thermophilus and Lactobacillus helveticus on isoflavone and B-vitamin content of a fermented soy beverage[J]. Food Microbiology,2010,27(7):968-972.

[12]任丹丹,謝云峰,劉佳佳,等.高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定食品中9種水溶性維生素[J].食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào)，2014(3):899-903.

[13]張志清,白琦,湛珺雯. RP-HPLC法測(cè)定功能性飲料水溶性維生素含量[J]. 食品科學(xué),2010,31(14):212-215.

[14]國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局. GB/T 5009.211-2008 食品中葉酸的測(cè)定[S]. 北京:中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社,2008.

[15]國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局.GB 5413.16-2010 嬰幼兒食品和乳品中葉酸的測(cè)定[S].北京:中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社,2010.

[16]周圍,王波,劉倩倩,等.超高效合相色譜法同時(shí)測(cè)定復(fù)合維生素片中11種脂溶性維生素及其衍生物[J].分析化學(xué),2015,43(1):115-120.

[17]張榕杰,蘇永恒,王愛月.超高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定維生素強(qiáng)化食品中多種水溶性維生素[J].中國(guó)衛(wèi)生工程學(xué),2008,7(1):34-36.

[18]賀利民,呂岱竹,蘇貽娟. 高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定多種水溶性維生素[J].海南大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2004,22(1):54-60.

[19]榮琳,邵麗華,王淑娥,等. HPLC-二極管陣列檢測(cè)器同時(shí)測(cè)定保健品中7種水溶性維生素[J].衛(wèi)生研究,2009,38(5):541-542.

[20]白靖,向柏,申磊,等. HPLC法同時(shí)測(cè)定復(fù)合維生素口服液中4種水溶性維生素的含量[J]. 中國(guó)藥房,2011,22(29):2747-2749.

[21]李強(qiáng),李揮,龐坤,等.功能性飲料中11種水溶性維生素的高通量檢測(cè)技術(shù)研究[J].河北省科學(xué)院學(xué)報(bào),2012,29(3):44-48.

[22]宋萍萍,劉書慧.反相高效液相色譜法測(cè)定果醋中的8種維生素[J].食品科學(xué),2012,33(12):181-184.

[23]華晶忠,劉笑笑,武巍,等.苜蓿中維生素C含量測(cè)定及變化規(guī)律[J]. 食品研究與開發(fā),2016(1):45-47.

[24]郭玉華,郁有祝.高效液相色譜法測(cè)定茶葉中五種水溶性維生素[J].食品研究與開發(fā),2012(8):138-140.

[25]李克,王華娟,潘朝暉,等. 離子對(duì)反相高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定復(fù)合維生素片中4種水溶性維生素[J].色譜,2013,21(1):66-68.

[26]黃力,張寶川.HPLC法測(cè)定多維片中的水溶性維生素[J].中國(guó)藥事,2007,21(4):255-257.

[27]高旭,李淑娟,安娟,等.高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定食品中8種水溶性維生素[J].中國(guó)醫(yī)藥指南,2008,6(19):36-38.

[28]張曉娜,校瑞,牛家華,等. HPLC同時(shí)測(cè)定維生素B片中4種水溶性維生素的含量[J].河南大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版,2016(9):583-586.