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(山西省醫(yī)藥與生命科學研究院,山西太原 030006)

表1 刺玫果樣品信息Table 1 Sample informations of Rosa davurica

刺玫果為薔薇科薔薇屬植物刺玫的成熟果實,又名薔薇果、刺莓果,分山刺玫(RosadavuricaPall.)和黃刺玫(RosaxanthinaLindl.)兩種,廣泛分布于山西、河北、東北和內(nèi)蒙古等[1]。山西省以黃刺玫為主,主要分布在呂梁山脈、太行山脈、五臺山、中條山等山區(qū),資源豐富、產(chǎn)量高,是一種經(jīng)濟價值高、食藥同源的野生果類,民間大量采食用于泡茶、泡酒等[2]。《中藥大辭典》記載其有健脾理氣、養(yǎng)血調(diào)經(jīng)的作用[3]?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn),刺玫果含有豐富的維生素、氨基酸、黃酮、皂苷和植物超氧化物歧化酶(SOD)等活性成分[4],具有預防心血管病變和抗衰老的作用,其中黃酮類物質(zhì)對高血脂和抗氧化療效顯著。目前,以野生刺玫果為主要原料的食品、保健品和功能性飲料日益受到重視并廣泛開發(fā)[5]。

近年來指紋圖譜技術得到了廣泛應用,但是僅以相似度并不能對中藥質(zhì)量做出較全面的評價。化學模式識別技術是根據(jù)物質(zhì)所含化學成分的信息,利用計算機對其進行分類或描述的方法,能夠較好的滿足復雜化學成分信息的模糊性和整體性的要求[6-7]。目前化學模式識別技術已廣泛應用于食品和藥品的分類和質(zhì)量評價,尤其以主成分分析和聚類分析居多,如馬赟[8]等人應用聚類分析和主成分分析對甜味絞股藍黃酮類成分進行研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn)其成分差異與產(chǎn)地生態(tài)環(huán)境、采集加工方法等因素有關;Dongnan Li[9]等人采用液相色譜-質(zhì)譜法結(jié)合主成分分析對藍莓中花色苷成分進行研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn)地域差異是影響藍莓中花色苷成分的主要因素。目前雖有文獻對刺玫果指紋圖譜進行了探討[10-11],但僅以相似度為評價指標,并未對其品種進行分類,也未對共有特征峰進行統(tǒng)計學分析,信息量非常有限。本研究采用高效液相色譜法(HPLC)建立了以刺玫果黃酮類成分為基礎的指紋圖譜,考察了30批不同產(chǎn)地、不同品種刺玫果的相似度,并基于指紋圖譜信息綜合運用主成分分析(Principal component analysis,PCA)和系統(tǒng)聚類分析(Hierarchical cluster analysis,HCA)進行化學模式識別研究,為刺玫果的品種鑒別和質(zhì)量評價提供較全面的評價方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

刺玫果樣品 共30批樣品信息見表1(其中S1和S13為人工栽培,其余均為野生),樣品經(jīng)山西省醫(yī)藥與生命科學研究院王曉燕高級工程師分別鑒定為薔薇科植物:黃刺玫(RosaxanthinaLindl.)和山刺玫(RosadavuricaPall.);蘆丁對照品 中國食品藥品檢定研究院,批號100080-201409;金絲桃苷對照品 中國食品藥品檢定研究院,批號:111521-201004;槲皮素對照品 成都普思生物科技股份有限公司,批號PS0605-0025;乙腈 色譜純,西隴化工有限公司;磷酸、95%乙醇 分析純，天津登豐化學品公司;超純水自制。

Agilent 1200型高效液相色譜儀(配DAD檢測器) 美國安捷倫科技公司;AB104.N 型分析天平 上海托利-梅特勒儀器有限公司;UPHW-I-90T型優(yōu)普系列超純水系統(tǒng) 成都超純科技有限公司;XA-1型多功能粉碎機 山東省青州市益康中藥機械有限公司;MH-500電子調(diào)溫電熱套 北京科偉儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 對照品溶液的制備 分別精密稱取對照品蘆丁2.0 mg、金絲桃苷2.0 mg和槲皮素1.0 mg,置于10 mL容量瓶中,用甲醇溶解并稀釋至刻度,配成濃度分別為0.2、0.2和0.1 g/L的混合對照品貯備液,經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾后,進HPLC分析。

1.2.2 供試品溶液的制備 取適量刺玫果適當粉碎,精密稱取粗粉10.0 g,置于圓底燒瓶中,加入70%的乙醇溶液100 mL,回流提取1 h,過濾,取續(xù)濾液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾,作為供試品溶液。

1.2.3 色譜條件 安譜Athena-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),流速:1.0 mL/min;柱溫:25 ℃;檢測波長:360 nm;進樣量:20 μL。流動相:乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液(B),梯度洗脫程序:0～10 min,12%～16% A;10～26 min,16%～16% A;26～44 min,16%～28% A;44～53 min,28%～30% A;53～58 min,30%～35% A;58～60 min,35%～12% A。

1.2.4 方法學考察

1.2.4.1 精密度實驗 取刺玫果粗粉10.0 g,按“1.2.2”項下方法制備供試品溶液,連續(xù)進樣6次,按“1.2.3”項下色譜條件進行測定,記錄指紋圖譜,計算各共有峰相對峰面積和相對保留時間的RSD值。

1.2.4.2 重復性實驗 稱取同一批刺玫果粗粉6份,每份10.0 g,按“1.2.2”項下方法制備供試品溶液,按“1.2.3”項下色譜條件進行測定,記錄指紋圖譜,計算各共有峰相對峰面積和相對保留時間的RSD值。

1.2.4.3 穩(wěn)定性實驗 取同一供試品溶液分別于制備后 0、4、8、12、18、24 h,按“1.2.3”項下色譜條件進行測定,記錄指紋圖譜,計算各共有峰相對峰面積和相對保留時間的RSD值。

1.2.4.4 加樣回收率實驗 取已知蘆丁、金絲桃苷和槲皮素含量的刺玫果粗粉6份,每份10.0 g,置于圓底燒瓶中,加入70%的乙醇溶液99 mL,同時加入混合對照品溶液1 mL(相當于提取液中含蘆丁2.0 mg/L、金絲桃苷2.0 mg/L和槲皮素1.0 mg/L),按“1.2.2”項下方法制備供試品溶液,按“1.2.3”項下色譜條件進行測定,計算蘆丁、金絲桃苷和槲皮素的加樣回收率。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 22.0 軟件以不同品種產(chǎn)地刺玫果共有峰的峰面積為初始數(shù)據(jù),經(jīng)標準化處理后以主成分的方差貢獻率和特征值為依據(jù),進行主成分分析;采用SPSS 22.0 軟件對共有峰數(shù)據(jù)進行標準化處理,采用組間連接法、歐氏距離平方作為樣品測度,對不同品種產(chǎn)地的刺玫果的共有峰進行系統(tǒng)聚類分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件考察

實驗初期考察了不同的流動相系統(tǒng),包括甲醇-0.1%磷酸、乙腈-0.1%磷酸、乙腈-0.2%乙酸和乙腈-0.2%甲酸。有報道[12]采用甲醇-乙腈-四氫呋喃-0.5%醋酸系統(tǒng),由于四氫呋喃會對儀器管路造成一定的腐蝕,因此沒有考慮此系統(tǒng)。結(jié)果表明乙腈-0.1%磷酸系統(tǒng)的各色譜峰分離情況和峰形均較好。根據(jù)3D全波長掃描圖譜,選擇性考察了210、254、270 和360 nm波長下的色譜圖,結(jié)果表明波長為360 nm時基線較穩(wěn),色譜峰較多且分離效果良好,因此選擇360 nm為檢測波長。

2.2 方法學考察

精密度實驗結(jié)果相似度大于0.99,各共有峰的相對保留時間RSD小于0.9%,相對峰面積RSD小于2.9%;重復性實驗結(jié)果相似度大于0.99,各共有峰的相對保留時間RSD小于1.0%,相對峰面積RSD小于4.1%;穩(wěn)定性實驗結(jié)果相似度大于0.99,各共有峰的相對保留時間RSD小于1.0%,相對峰面積RSD小于4.9%;加樣回收率實驗結(jié)果顯示,蘆丁、金絲桃苷和槲皮素的加樣回收率分別為97.3%±1.2%,96.2%±1.9%和98.2%±1.1%,RSD分別為3.2%、2.4%和2.6%。結(jié)果表明儀器精密度良好,方法重復性、準確度良好,供試品溶液在室溫下24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好,符合指紋圖譜的要求。

2.3 指紋圖譜的構(gòu)建

分別取30批刺玫果樣品,按“1.2.2”項下方法制備供試品溶液,另取混合對照品溶液20 μL,按“1.2.3”項下色譜條件進行測定,記錄樣品和對照品的色譜圖。樣品譜圖導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2012.1版)》軟件,剪切前5 min溶劑峰后,采用多點校正進行數(shù)據(jù)匹配,選用均值法生成刺玫果共有模式的對照指紋圖譜(R),結(jié)果見圖1、圖2。由于刺玫果中大部分化學成分尚且未知且實驗條件有限,未能對其共有峰進行定性研究,通過與已有標準品對照得知,圖2中5號峰為蘆丁,7號峰為金絲桃苷,13號峰為槲皮素。

表2 30批刺玫果中蘆丁、金絲桃苷和槲皮素含量測定結(jié)果(μg/g)Table 2 Determination results of rutin,hyperoside and quercetin in 30 batches of Rosa davurica(μg/g)

圖1 混合對照品的色譜圖Fig.1 The chromatogram of hybrid reference substance注:1.蘆丁;2.金絲桃苷;3.槲皮素。

圖2 刺玫果樣品的對照圖譜Fig.2 The reference fingerprint chromatogram of Rosa davurica samples

2.4 含量測定結(jié)果

刺玫果中黃酮類成分蘆丁、金絲桃苷和槲皮素的含量測定結(jié)果見表2。由結(jié)果可見,刺玫果中蘆丁的含量參差不齊,較高值在60.56～69.51 μg/g之間,包括S1、S19和S22,這3批樣品分別來自山西省的太原市、臨汾市和呂梁市,其中蘆丁含量最高的樣品為冷凍鮮果;山刺玫果中金絲桃苷的含量遠高于黃刺玫果,是黃刺玫果的幾十倍甚至上百倍,而槲皮素的含量也普遍高于黃刺玫果,這2種成分含量最高的樣品來自黑龍江加格達奇。由此可見,黃刺玫果與山刺玫果的黃酮類成分在含量上存在一定的差異。

表3 刺玫果樣品的相似度評價結(jié)果Table 3 Similarity evaluation results of rose fruits

2.5 指紋圖譜相似度評價

中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)分析得到30批刺玫果樣品的相似度結(jié)果,并確定了15個共有峰。圖3為30批樣品匹配后的色譜圖,相似度計算結(jié)果見表3。根據(jù)相似度結(jié)果可將30批刺玫果大致分為2類:第1類相似度在0.95～1.00之間,包括S1～S22,均為黃刺玫果,此類樣品的產(chǎn)地主要為山西省、河北省和陜西省;第2類相似度在0.77～0.94之間,包括S23～S30,該樣品均為山刺玫果,產(chǎn)地分別為黑龍江省、吉林省、遼寧省和內(nèi)蒙古地區(qū)。由上述結(jié)果可見,不同品種刺玫果之間化學成分存在較大的差異,而不同產(chǎn)地和不同年份之間差異較小。

圖3 30批刺玫果樣品匹配后的色譜圖Fig.3 The matched chromatogram of 30 batches of Rosa davurica samples

表4 共有峰的相對峰面積Table 4 Relative peak areas of common peaks

2.6 主成分分析

主成分分析(PCA)是在盡可能保留原有信息的基礎上,將高維數(shù)空間的信息映射到低維數(shù)的幾個主成分上,使數(shù)據(jù)簡化,降低維數(shù),以揭示數(shù)據(jù)的結(jié)構(gòu)特征。該法具有信息損失量小、相關性優(yōu)等特點[13-14]。在所得指紋圖譜中,6號峰為所有樣品共有,分離度較好、峰位相對居中而且峰面積較大,所以確定6號峰為參比峰。以各共有峰對6號峰的峰面積之比為相對峰面積,得到30批樣品的15個色譜峰的標準化數(shù)據(jù)(見表4),采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行主成分分析。

主成分個數(shù)的提取原則是取主成分對應的特征值大于1的2個主成分,其累計方差貢獻率為80.3%(見表5),表明該2個主成分能夠代表15個指標在30批樣品中80.3%的信息。旋轉(zhuǎn)后的因子載荷矩陣見表6,由此可知每個載荷量表示主成分與對應變量的相關系數(shù)[15]。以2個主成分的得分向量建立坐標系得到主成分的得分圖(見圖4),由圖4可見30批樣品大致被分為兩大類,即黃刺玫果和山刺玫果。結(jié)果顯示黃刺玫果多聚集在PC1坐標的負值區(qū)域,而山刺玫果多聚集在PC1坐標的正值區(qū)域和PC2坐標的中心區(qū)域,分類結(jié)果與相似度結(jié)果較一致,表明通過15個特征峰的相對峰面積可識別黃刺玫果和山刺玫果。

直觀分析這兩類樣品色譜峰的相對峰面積發(fā)現(xiàn),山刺玫果的7、12、13、14和15號共有峰的相對峰面積明顯大于黃刺玫,而黃刺玫果中的主要峰2、4、6、8和9號峰的峰面積明顯大于山刺玫,初步猜測這可能是造成這兩種樣品分類的主要原因。

表5 主成分方差分析Table 5 Analysis of variance for PCA

表6 旋轉(zhuǎn)后的因子載荷矩陣Table 6 Rotated component matrixa

圖4 主成分得分圖Fig.4 PCA scores plot

2.7 聚類分析

聚類分析法(HCA)是以“物以類聚”為基本原則來研究事物分類的一種多元統(tǒng)計分析的方法[16]。在判別中藥質(zhì)量的過程中,經(jīng)常和PCA聯(lián)合應用,即先通過PCA排除化學數(shù)據(jù)中微量和無效的干擾信息,再通過HCA進行分類和質(zhì)量評估[17]。本研究采用 SPSS 22.0 統(tǒng)計分析軟件,以系統(tǒng)聚類法中的組間連接法、歐氏距離平方作為樣品測度,對30批刺玫果進行聚類分析,并繪制樹狀圖(見圖5)。結(jié)果顯示,當閾值T=25時,30批樣品被劃分為2類,其中S23～S30自成一類,即山刺玫組,其他22批黃刺玫被分為一類;隨著閾值的減小,22批黃刺玫繼續(xù)被劃分為2類,其中S2～S12和S15一類,其余10批樣品一類。分類結(jié)果與PCA的結(jié)果基本一致。

直觀分析被分為兩類的黃刺玫果的相對峰面積發(fā)現(xiàn),S2～S12和S15的色譜圖中2、4、8和9號共有峰的相對峰面積明顯小于其他樣品,而S2～S12均為曬干樣品,猜測可能是這4種化學組分性質(zhì)不穩(wěn)定,在曬干過程中受熱而發(fā)生了降解致峰面積變小,因此黃刺玫果因不同干燥方法被分為兩類,即陰干組和曬干組。而陰干組與S1冷凍鮮果的組分比較接近而被分為了一類,可見在陰干的過程中樣品中的化學成分相對比較穩(wěn)定。S15雖然也是陰干,但可能是因為儲存時間較長(2013年采集),樣品中不穩(wěn)定成分發(fā)生了降解而被分到了曬干組。由此可見,相同種類、不同產(chǎn)地樣品之間化學成分差異并不明顯,而不同干燥方法和儲存時間對樣品的影響較大。

圖5 系統(tǒng)聚類樹狀圖Fig.5 Dendrogram for the systematic clustering

3 結(jié)論

本研究以高效液相色譜指紋圖譜數(shù)據(jù)為基礎,結(jié)合化學模式識別技術,綜合運用相似度評價、主成分分析和聚類分析對30批不同品種、產(chǎn)地和干燥方法的刺玫果樣品進行了研究。從化學成分上揭示了不同品種和不同干燥方法的刺玫果之間的差異,并客觀地反映了刺玫果內(nèi)在質(zhì)量。結(jié)果30批刺玫果可根據(jù)品種不同快速被分為兩大類,然后黃刺玫又進一步被分為陰干和曬干兩類。結(jié)果表明3種分析方法的結(jié)果基本一致,驗證了化學模式識別用于品種鑒定和歸類的可行性。該方法不僅可以用于刺玫果的品種鑒別和質(zhì)量評價,還可為下一步制定刺玫果的質(zhì)量標準提供參考。

通過研究發(fā)現(xiàn),相同品種、不同產(chǎn)地的刺玫果化學成分較為一致,且人工栽培與野生黃刺玫果的品質(zhì)無顯著差異,這說明刺玫果具有較好的產(chǎn)地適應性。而聚類分析結(jié)果可看出刺玫果可進一步細分,表明不同干燥方法及儲存時間的刺玫果內(nèi)在化學成分及含量差異較大。天然產(chǎn)物化學成分普遍比較復雜,其對照品大多較難獲得[18],本研究采用化學模式識別的方法,無需對照品指認色譜峰,為刺玫果的品種鑒定及質(zhì)量評價提供了參考。而刺玫果的藥理作用和化學成分的差異及相關性有待今后進一步深入研究。

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