,,,2,*,,2

(1.天津商業(yè)大學生物技術(shù)與食品科學學院,天津 300134;2.天津市食品生物技術(shù)重點實驗室,天津 300134)

斯皮諾素(2?-O-β-D-吡喃葡萄糖基當藥素,SPI)是酸棗仁中含量最高的黃酮類成分[1-2],且是《中國藥典》2010年版所規(guī)定的酸棗仁的活性成分,具有鎮(zhèn)靜催眠、抗氧化、抗抑郁等多種藥理作用[3],其結(jié)構(gòu)式如圖1所示。黃酮類化合物極性強且相對分子質(zhì)量較大,能被吸收入血的量很少;黃酮類化合物也可能以主動轉(zhuǎn)運的方式被吸收,相關(guān)蛋白是其相應(yīng)的轉(zhuǎn)運載體,而載體蛋白大多是能量依賴的,同時又有飽和性,能夠通過主動轉(zhuǎn)運吸收的數(shù)量并不多[4]。研究表明斯皮諾素生物利用度較低,僅為2.2%[5],選擇合適的劑型來提高SPI的生物利用度尤為必要。磷脂復合物(PLC)是某些藥物和磷脂通過電荷遷移作用或分子間作用力形成的相對穩(wěn)定的復合物。黃酮類化合物結(jié)構(gòu)中負電性較高的部位,在一定條件下可與磷脂帶正電荷的極性端發(fā)生相互作用,形成氫鍵或以分子間的疏水作用結(jié)合在一起形成磷脂復合物,且使得磷脂的兩性作用不被破壞[6]。迄今為止,國內(nèi)已有芒果苷、山楂葉總黃酮、芍藥苷以及柿葉黃酮等中藥成分制成磷脂復合物的相關(guān)報道[7-10],且磷脂復合物既可以增強水溶性藥物的脂溶性也可以增強脂溶性藥物的水溶性,從而增加藥物在胃腸道中的吸收,提高其生物利用度和療效。國外學者Bombardelli 等[11]在研究脂質(zhì)體的時候偶然發(fā)現(xiàn):天然黃酮類的化合物對磷脂有較強的親和力,二者可結(jié)合形成具有一定結(jié)構(gòu)的復合物,因此,結(jié)合斯皮諾素自身結(jié)構(gòu)特點,將其制成斯皮諾素磷脂復合物(SPI-PLC),并對斯皮諾素磷脂復合物(SPI-PLC)的制備及工藝優(yōu)化進行較為詳盡的研究,用紫外、紅外光譜表征復合物的形成,以期優(yōu)化出制備復合率(CR)較高的SPI-PLC的工藝條件,為實現(xiàn)SPI-PLC的工業(yè)化生產(chǎn)、改善斯皮諾素的口服吸收性能和提高生物利用度等相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。

圖1 斯皮諾素化學結(jié)構(gòu)式Fig.1 The chemical structural formula of spinosin

1 材料與方法

1.1材料與儀器

斯皮諾素 本實驗室提取、分離純化并采用紫外光譜、紅外光譜和質(zhì)譜等檢測方法對其進行表征,純度大于98%;大豆卵磷脂E200 上海艾韋特醫(yī)藥科技有限公司;無水乙醇、丙酮、三氯甲烷等試劑 均為分析純;水 為去離子水。

EMS-2型加熱定時磁力攪拌器 天津歐諾儀器儀表有限公司;UV-7504型單光束紫外-可見分光光度計 上海欣茂儀器有限公司;NEXUS 670型傅里葉紅外光譜儀 美國Thermo Nicolet公司;Bettensize 納米粒度儀 丹東百特儀器有限公司;KQ-500B型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;XSE105型1/100000電子分析天平 上海Mettler-Toledo儀器有限公司;V-700型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 瑞士Buchi公司;ALPHA 1-2LD PLUS型真空冷凍干燥機 德國Marin Christ 公司;DH-101型電熱恒溫鼓風干燥箱 天津市中環(huán)實驗電爐有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1 斯皮諾素磷脂復合物的制備 按照所需比例精密稱取一定量的斯皮諾素和磷脂,置于50 mL具塞燒瓶中,加入適量反應(yīng)溶劑(無水乙醇、丙酮、氯仿),在一定的溫度和攪拌速度下反應(yīng)一段時間,50 r/min轉(zhuǎn)速下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)(無水乙醇:浴鍋溫度56 ℃,壓力184 mbar;氯仿:浴鍋溫度58 ℃,壓力492 mbar;丙酮:浴鍋溫度61 ℃,壓力578 mbar),除去反應(yīng)溶劑。向殘余物中再次加入5 mL溶劑,充分溶解后減壓抽濾,收集濾餅,即得粗斯皮諾素磷脂復合物。

1.2.2 制備工藝的質(zhì)量評價 以SPI-PLC的復合率CR為指標來評價復合物的制備工藝。斯皮諾素水溶性較好,在水、甲醇、乙醇等溶劑中均可溶解,但不溶于氯仿。利用斯皮諾素在氯仿中不溶,而SPI-PLC溶于氯仿這一特性,向制備的粗產(chǎn)物中加入10 mL氯仿,充分溶解未結(jié)合的磷脂及形成的復合物,抽濾,收集濾液和沉淀。濾液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后得磷脂復合物;沉淀于40 ℃烘箱下干燥,分析天平稱重,得未與磷脂結(jié)合的斯皮諾素(W),斯皮諾素初始加藥量(W0)與沉淀量(W)之差即為和磷脂結(jié)合的斯皮諾素的量,因而SPI-PLC的CR值計算公式如下:CR=(W0-W)/W0。

1.2.3 單因素實驗

1.2.3.1 反應(yīng)溶劑的考察 設(shè)定SPI與磷脂的投料比為1∶15 (g/g),反應(yīng)溫度為40 ℃,反應(yīng)時間為3 h,攪拌速度為800 r/min,以SPI-PLC的CR為評估標準,對無水乙醇、二氯甲烷、氯仿、丙酮和四氫呋喃進行考察,優(yōu)選出可以達到較高CR值的反應(yīng)溶劑[12-14]。

1.2.3.2 反應(yīng)溫度的考察 一般來說,反應(yīng)溫度越高,反應(yīng)速度越快,反應(yīng)更加完全,但據(jù)文獻報道磷脂及形成的磷脂復合物在高溫環(huán)境下易被氧化和破壞[8],故本實驗以丙酮為反應(yīng)溶劑,考察反應(yīng)溫度為20、30、40、50、60 ℃對磷脂復合物復合率的影響,其余實驗條件同“1.2.3.1”。

1.2.3.3 藥脂比考察 固定反應(yīng)溫度為40 ℃,分別按質(zhì)量比為1∶1、1∶5、1∶10、1∶15、1∶20的比例稱取一定量的斯皮諾素與大豆磷脂,按“1.2.3.2”的實驗條件制備磷脂復合物,測定復合物的CR值。

1.2.3.4 攪拌速度的考察 設(shè)定斯皮諾素與大豆磷脂質(zhì)量比為1∶15,考察磁力攪拌速度為200、400、800、1200和1400 r/min時對復合物CR的影響,其余實驗條件同“1.2.3.3”。

1.2.3.5 反應(yīng)時間的考察 設(shè)定攪拌速度為800 r/min,其余實驗條件同“1.2.3.4”,考察反應(yīng)時間分別為1、2、3、4、5 h時對磷脂復合物復合率的影響。

1.2.4 Box-Behnken設(shè)計-響應(yīng)面法優(yōu)化SPI-PLC制備工藝 由單因素實驗結(jié)果可知,藥脂比、攪拌速度和反應(yīng)時間對SPI-PLC的CR影響具有顯著性,因此采用Box-Behnken設(shè)計如表1所示的3因素3水平的實驗,以CR為評價指標,進行多元線性回歸和二項式方程擬合。根據(jù)擬合方程的相關(guān)系數(shù)判斷模型擬合程度是否良好,進而確定該模型是否可用。繪制效應(yīng)指標CR與其中任意2個自變量的三維圖,從而優(yōu)化SPI-PLC的制備工藝,得到最佳工藝條件。

表1 響應(yīng)面實驗因素水平表Table 1 Factors and levels table of response surface experiment

1.2.5 斯皮諾素磷脂復合物的結(jié)構(gòu)表征

1.2.5.1 紫外分光光度法 配制斯皮諾素、磷脂、物理混合物(斯皮諾素與磷脂按質(zhì)量比1∶16.42混合)、SPI-PLC的無水乙醇溶液。以無水乙醇為空白,于200～400 nm波長區(qū)進行紫外掃描,記錄紫外吸收圖譜。

1.2.5.2 紅外光譜分析 將磷脂、斯皮諾素、物理混合物(斯皮諾素與磷脂質(zhì)量比1∶16.42混合)以及SPI-PLC分別與溴化鉀混合壓片。其中,上述各組分與溴化鉀均以1∶200的比例于石英研缽中同一方向充分研勻,然后進行壓片,用空白溴化鉀窗片進行背景采集,得各組分紅外吸收光譜圖。

1.2.5.3 粒徑和多分散指數(shù)分析 室溫下,取斯皮諾素磷脂復合物20 mg,用3 mL 雙蒸水混懸并渦旋10 min,得到半透明狀膠體溶液,再用雙蒸水稀釋至溶液光子數(shù)在20～50 K范圍內(nèi),超聲5 min,置于納米激光粒度儀中測定其平均粒徑和多分散指數(shù)(PDI)。

1.2.5.4 表觀油水分配系數(shù)的測定 精密稱量斯皮諾素適量,經(jīng)甲醇溶解并制備濃度為1 mg/mL的儲備液,用正辛醇飽和的水溶液稀釋成2、5、10、20、50、100 μg/mL的系列濃度梯度,測定335 nm處的吸光度(A),以A對濃度C進行線性回歸,得回歸方程。采用搖瓶法測定SPI-PLC的表觀油水分配系數(shù),量取正辛醇飽和的水溶液5 mL于具塞離心管中,分別加入適量的斯皮諾素、斯皮諾素與磷脂物理混合物和SPI-PLC,37 ℃,100 r/min振搖24 h至溶解平衡(預(yù)實驗表明平衡時間為24 h),靜置取上清液2 mL置于5 mL于具塞離心管中,分別加入正辛醇2 mL,37 ℃,100 r/min振搖至溶解平衡,靜置。分別取水相和正辛醇相,稀釋適當倍數(shù)進行測定。水相和油相中的溶解度分別記為CW和CO,可由公式P=log(CO/CW)計算出表觀油水分配系數(shù)(P)。

1.3數(shù)據(jù)處理

單因素實驗相關(guān)數(shù)據(jù)運用SPSS軟件進行方差分析和獨立樣本T-test,采用Design-Expert 8.0.7.1實驗設(shè)計軟件分析響應(yīng)面實驗結(jié)果。

2 結(jié)果與討論

2.1單因素實驗

單因素實驗中各因素對磷脂復合物CR值影響如圖2所示。

圖2(a)結(jié)果表明,溶劑為無水乙醇、二氯甲烷和四氫呋喃時效果不佳,而在丙酮和氯仿中的CR值均較高且和其他三種試劑相比具有顯著性差異,但由于氯仿毒性大,腐蝕性強,故本實驗選用丙酮作為后續(xù)實驗的反應(yīng)溶劑。

圖2(b)顯示,反應(yīng)溫度為20、30、40、50和60 ℃時的CR值分別為 80.06%、81.57%、82.49%、80.37%和79.13%,且T-test表明三者之間無顯著性差異,因此反應(yīng)溫度對復合物的CR影響較小,因此選用反應(yīng)溫度為40 ℃的條件進行后續(xù)實驗。

圖2(c)結(jié)果顯示,藥脂比為1∶1、1∶5、1∶10、1∶15、1∶20時的復合率分別是48.01%、79.05%、84.63%、88.31% 和82.09%,且和最小值相比具有顯著性差異(p<0.05),這表明在一定范圍內(nèi),復合物的CR值隨磷脂比例的升高而增大,但當藥脂比為1∶20時,CR值有所降低,這可能是因為藥物分子中能夠與磷脂結(jié)合的位點已達到飽和。而藥脂比1∶1時,CR值偏離其他結(jié)果較多,證明最優(yōu)藥脂比不在1∶1～1∶5范圍內(nèi),因此在設(shè)計實驗時不再考察1∶1～1∶5范圍內(nèi)的藥脂比,而通過響應(yīng)面實驗對1∶10～1∶20這一范圍進一步優(yōu)化。

由圖2(d)可知,攪拌速度對磷脂復合物的復合率影響較大,且攪拌速度為200、400、800、1200和1400 r/min時的CR值分別為71.17%、87.85%、93.92%、78.96%和70.05%,因此轉(zhuǎn)速在400～1200 r/min的范圍內(nèi)效果較好。

圖2(e)表明反應(yīng)時間對復合物的CR值有一定影響,在1～3 h范圍內(nèi),隨時間的延長,CR值增大,隨后CR值降低,但在2～4 h的范圍的CR值較高,因此需通過響應(yīng)面實驗在2～4 h范圍內(nèi)優(yōu)化反應(yīng)時間。

2.2Box-Behnken設(shè)計-響應(yīng)面法優(yōu)化SPI-PLC制備工藝

圖2 不同因素對復合物CR的影響(n=3)Fig.2 Effects of different factors on the CR of complex(n=3)

2.2.1 實驗設(shè)計及結(jié)果 單因素結(jié)果表明,藥脂比(A)、攪拌速度(B)、反應(yīng)時間(C)是影響最為顯著的三個因素,3因素3水平的Box-Behnken 實驗安排及結(jié)果見表2。

表2 Box-Behnken 實驗安排及結(jié)果Table 2 Arrangement and results of Box-Behnken design

2.2.2 二次回歸方程的建立 使用Design-Expert 8.0.7.1軟件對實驗數(shù)據(jù)進行處理,多元線性回歸和方程擬合結(jié)果表明,CR用二項式回歸最優(yōu),其二次多元回歸方程為CR=90.49+5.22A+0.93B+3.71C+2.33AB+2.44AC-1.30BC-10.67A2-6.74B2-8.05C2(R2=0.9955,p<0.0001)。

2.2.3 方差分析和顯著性檢驗 二項式回歸方程系數(shù)顯著性檢驗的結(jié)果見表3。表3數(shù)據(jù)顯示R2為0.9955,且回歸模型極顯著(p<0.0001),而失擬項(p=0.0593>0.05)是不顯著的,故模型擬合度較好,可用來對斯皮諾素磷脂復合物的制備工藝進行初步分析和預(yù)測。回歸方程中各因素的一次項A、C和二次項A2、B2、C2以及交互項AB、AC對SPI-PLC的復合率CR影響都是極顯著的,一次項B和交互項BC是顯著的,說明各因素對SPI-PLC的復合率CR都有非常大的影響。根據(jù)各因素F值的大小,可以看出3個因素對SPI-PLC復合率CR的影響大小依次是 A>C>B,即藥脂比>反應(yīng)時間>攪拌速度。

2.2.4 優(yōu)選處方的預(yù)測與驗證 利用Design-Expert 8.0.7.1實驗設(shè)計軟件繪制的效應(yīng)指標CR與其中任意2個實驗因素的三維效應(yīng)曲面圖如圖3所示。

圖3(a)顯示,在反應(yīng)時間C為3 h的條件下,藥脂比A和攪拌速度B對SPI-PLC的CR值的影響。 SPI-PLC的CR隨著B的增加先升高后降低,隨著A的增加亦先升后降,交互影響顯著。圖3(b)顯示,在B為800 r/min的條件下,A和C對SPI-PLC的CR值的影響。CR隨著C和A的增加先升后降,交互影響顯著。圖3(c)顯示,在A為1∶15的條件下,B和C對SPI-PLC的CR的影響,規(guī)律同上。

按各指標的期望設(shè)定目標,得到的優(yōu)選處方條件是藥脂比為1∶16.42,攪拌速度為836 r/min,反應(yīng)時間為3.27 h。依據(jù)該處方制備3批SPI-PLC,測定各批CR值。實際測量CR為 90.75%±0.64%(n=3),模型對指標的預(yù)測值為91.77%。結(jié)果顯示實測值與預(yù)測值之間沒有顯著性差異(相對誤差=1.1%),表明該模型預(yù)測性良好,因此該制備處方切實可行。

2.3斯皮諾素磷脂復合物的結(jié)構(gòu)表征

表3 二項式回歸方程系數(shù)顯著性檢驗Table 3 Significance of coefficients in second order regression equation

圖3 各因素對響應(yīng)值影響的三維效應(yīng)曲面圖Fig.3 3D Response surface plot for effects of each factor

注:*:p<0.05,顯著;**:p<0.01,極限著。

2.3.1 紫外分光光度法 斯皮諾素、磷脂、物理混合物(斯皮諾素與磷脂按質(zhì)量比1∶14.5混合)、SPI-PLC的無水乙醇溶液在200～400 nm波長區(qū)的紫外吸收圖譜如圖3所示。黃酮類化合物因分子中存在桂皮?；氨郊柞；M成的交叉共軛體系,故在200～400 nm的區(qū)域內(nèi)存在兩個主要的吸收帶,稱為峰帶Ⅰ(300～400 nm)及峰帶Ⅱ(220～280 nm)。一般來說,黃酮類化合物帶Ⅱ的峰位主要受A-環(huán)氧取代程度的影響,而黃酮母核的取代情況影響帶Ⅰ的峰位,實驗過程中,為了定量更加精確,通常選擇帶Ⅰ的峰值作為最大吸收波長。由圖4可知,斯皮諾素的兩個峰帶分別為335 nm和275 nm,因此335 nm為SPI的最大吸收波長。磷脂在285 nm 處有最大吸收,其余波長處均無吸收,故磷脂對斯皮諾素的測定無干擾作用,可用于SPI-PLC的制備。從圖中還可以看出,斯皮諾素物理混合物與新形成的磷脂復合物的紫外圖譜形狀均呈現(xiàn)出斯皮諾素的特征,都在335 nm 處有最大吸收峰。紫外圖譜結(jié)果表明磷脂復合物中斯皮諾素發(fā)色團的結(jié)構(gòu)并未發(fā)生改變,即反應(yīng)后沒有新的化合物的形成。

圖4 磷脂、斯皮諾素、斯皮諾素磷脂物理混合物及SPI-PLC的紫外吸收光譜圖Fig.4 Ultraviolet absorption spectrum of phospholipids(A),spinosin(B),physical mixture(C),and SPI-PLC(D)

2.3.2 紅外光譜分析 磷脂、斯皮諾素、物理混合物(斯皮諾素與磷脂質(zhì)量比1∶14.5混合)以及SPI-PLC的紅外吸收光譜圖如圖5所示。從譜圖中可看出,形成復合物后,斯皮諾素1716和1733 cm-1處的C=O的伸縮振動峰向高頻區(qū)移動,移至1735 cm-1處,而且峰形也發(fā)生了一定變化,由雙峰變成了單峰;1075 cm-1峰為與苯環(huán)相連的C=O伸縮振動峰,形成磷脂復合物后變?yōu)?053和1088 cm-1的雙峰,而磷脂的1718 cm-1峰為C=O伸縮振動峰,向低頻區(qū)移動,移至1651 cm-1。將物理混合物的吸收峰與復合物的吸收峰做對比,復合物在1239、1465 cm-1以及 874、722 cm-1出現(xiàn)新的吸收峰。結(jié)果表明形成的復合物并不是磷脂分子與斯皮諾素簡單的物理混合。磷脂復合物可能是由分子間相互作用形成的,而這種相互作用是磷脂分子與斯皮諾素特定官能團能夠緊密結(jié)合的原因。

圖5 磷脂(A)、斯皮諾素(B)、斯皮諾素磷脂物理混合物(C)及SPI-PLC(D)的紅外光譜圖Fig.5 FTIR Patterns of phospholipids(A),spinosin(B),physical mixture(C),and SPI-PLC(D)

2.3.3 粒徑和多分散指數(shù)分析 納米激光粒度儀測得SPI-PLC的水分散體的平均粒徑為(542.1±12.5) nm,PDI為0.167±0.024,見圖6。游離斯皮諾素因其本身分子量較小,不能用納米激光粒度儀測定粒徑大小。而由于磷脂的雙親結(jié)構(gòu),在水中可以形成具有脂質(zhì)雙分子層的囊泡結(jié)構(gòu),當藥物被包裹于其中就形成了通常的脂質(zhì)體,故形成了具有一定粒徑的磷脂復合物,且分散較為均勻,穩(wěn)定性好。

圖6 SPI-PLC的水分散體粒徑圖Fig.6 Diameter distribution of aqueous dispersion of SPI-PLC

2.3.4 表觀油水分配系數(shù)的測定 實驗所得標準曲線回歸方程為A=0.0172 C-0.0346,R2=0.9999,結(jié)果表明斯皮諾素在2～100 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,可用于斯皮諾素含量的計算。斯皮諾素、物理混合物和SPI-PLC在正辛醇-水系統(tǒng)中的表觀分配系數(shù)如表4所示。結(jié)果表明SPI-PLC在水和正辛醇中的溶解度均大于原藥及物理混合物,且形成磷脂復合物后表觀油水分配系數(shù)P值也增大。一方面可能是其無定型的狀態(tài)及在水中形成膠團的增溶作用使水溶性有所增加,另一方面則可能是由于藥物極性基團與磷脂締合,使藥物極性基團受到屏蔽,表現(xiàn)出較強的脂溶性。從物理混合物的實驗結(jié)果表明,磷脂的存在只是有限地改善了SPI在水中和正辛醇中的溶解性能。

表4 斯皮諾素、物理混合物和SPI-PLC在正辛醇-水系統(tǒng)中的表觀分配系數(shù)(n=3)Table 4 Apparent partition coefficient of SPI,physical mixture,and SPI-PLC in octyl alcohol-water system(n=3)

3 結(jié)論

采用溶劑揮發(fā)法成功制備了SPI-PLC,并得出最優(yōu)工藝條件。以丙酮作為反應(yīng)溶劑,藥脂比為1∶16.42,攪拌速度、反應(yīng)溫度和反應(yīng)時間分別為836 r/min、40 ℃和3.27 h制備的SPI-PLC的復合率可達 90.75%±0.64%(n=3),且制備工藝操作簡便。工藝驗證實驗表明,選擇的工藝條件穩(wěn)定,基本可行。UV、IR圖譜表明SPI-PLC并不是磷脂分子與斯皮諾素簡單的物理混合,而可能是分子間相互作用形成的。表觀油水分配實驗表明,形成的具有一定粒度的磷脂復合物既增加了斯皮諾素的水溶性,又增加了其脂溶性,因此預(yù)測可提高生物利用度。后期通過Caco-2細胞模型跨膜轉(zhuǎn)運實驗和生物利用度測定實驗進一步研究SPI-PLC的膜滲透性和生物利用度的改善情況。

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