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(1.廣東食品藥品職業(yè)學院食品學院,廣東廣州 510220;2.華南理工大學食品科學與工程學院,淀粉與植物蛋白深加工教育部工程研究中心,廣東廣州 510640)

在食品中蛋白質糖基化的主要方法是基于Maillard反應機理的非酶糖基化,屬于蛋白質化學改性范疇,通過蛋白質糖基化作用,不僅拓寬了蛋白質包括大豆蛋白質在某些食品體系中的應用,而且提升了蛋白質的某些功能特性。在此反應中,蛋白質與糖發(fā)生共價結合,不需要添加任何化學試劑作為催化劑,僅加熱就可使反應自發(fā)進行,因此是比較安全的蛋白質改性方法。對于以Maillard為反應機理的蛋白質和多糖的糖基化接枝方法而言,主要是干熱法和濕熱法,這兩種方法在反應條件、產(chǎn)物性質方面各有優(yōu)劣。干熱法和濕熱法糖基化反應的差異主要是由反應的水分活度和加熱強度不同造成[1-2],干熱法反應物在固相體系中進行,反應條件比較溫和,反應時間較長多則幾天甚至幾周,反應溫度較低[3-5]。濕熱法在水分活度和加熱強度方面均明顯高于干熱法的條件[6-8],另一方面,在比干熱法反應條件劇烈的情況下,蛋白質分子和多糖分子相互碰撞、互相接觸的機會也會多于干熱法[9-10],導致了二者反應時間、反應產(chǎn)物和反應機制存在差異性。近些年研究者也在不斷開發(fā)新的接枝方法,如微波輔助法[11]、有機溶劑輔助法[12]、脈沖電場輔助[13]、超聲輔助法[14]等,這些方法多是利用相應技術手段輔助濕熱法,但是由于所采用的設備、試劑而限制了實現(xiàn)工業(yè)化的可能性,因此和傳統(tǒng)方法一樣難以實現(xiàn)過程的可控性。

蛋白質和多糖這兩類生物大分子本身所具有的復雜性,以及Maillard反應的復雜化,使得這兩種方法都難以很好地實現(xiàn)過程的可控性和生產(chǎn)的工業(yè)化,并且兩種方法目前缺乏系統(tǒng)地比較,二者反應機制的分析探討也不夠深入,因此開展相關方面的研究對于傳統(tǒng)糖基化接枝方法的改進及應用具有十分重要的意義。本研究選用大豆蛋白中主要儲藏蛋白之一的大豆7S球蛋白作為研究對象,利用跨學科的思路,采用化工合成方面廣泛應用的水熱法,并進行相應的改進,研究了這種改進的加壓輔助濕熱法(即水熱法)和干熱法、濕熱法在大豆7S球蛋白和多糖糖基化反應的應用,對傳統(tǒng)的兩種糖基化接枝方法和改進方法從糖基化反應程度進行系統(tǒng)比較,探討不同糖基化方法之間的機理差異,并對產(chǎn)物氨基酸組成進行分析,為相關研究提供方法依據(jù)和理論信息。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

低溫脫脂大豆胚片(蛋白干基含量55%) 山東禹王蛋白廠;透析袋(截留相對分子量10±2 kDa) 上海君創(chuàng)生物科技有限公司;中分子量范圍蛋白Marker 廣州鼎國生物技術有限公司;葡聚糖(分子量為67 kDa)、鄰苯二甲醛(OPA) Sigma公司;賴氨酸,硼砂,β-巰基乙醇,鹽酸等均為分析純。本研究用水均為去離子水。

Rapid N cube Analyze杜馬斯定氮儀 Germany Elementar Inc.;CR22GII型高速冷凍離心機 日立(Hitachi)公司;Scientz-18N型冷凍干燥機 寧波新芝生物股份有限公司;TU-1810型紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司;M510型HPLC氨基酸自動分析儀 美國Waters公司;F4500型熒光光譜儀 日立(Hitachi)公司。

1.2實驗方法

1.2.1 大豆7S球蛋白分離制備及純度測定 大豆7S球蛋白依照Nagano等[15]的方法分離制備。采用杜馬斯燃燒定氮法[16]測定分離制備出的大豆7S球蛋白含量,測定結果為三次測量的平均值,采用SDS-PAGE法檢測大豆7S球蛋白的純度,利用軟件Gel Pro Analyzer(Quantity One 2.0,Bio Red.)對膠片成像進行光密度分析確定大豆7S球蛋白的純度。

1.2.2 大豆7S球蛋白糖基化產(chǎn)物的制備干熱法 參照Kato等人方法[17],將大豆7S球蛋白與葡聚糖以1∶1 (w/w)比例,和水溶解均勻后冷凍干燥。凍干粉過100目篩后放置于干燥器(底部放置飽和KBr溶液)中,保持RH 79%,60 ℃恒溫反應1周,取樣分析。

濕熱法[18]:將大豆7S球蛋白與葡聚糖以1∶1 (w/w)比例混合溶于0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液中(pH7.2,大豆7S球蛋白濃度4 mg/mL),在密閉容器中不加壓,100 ℃分別反應1、2、3、4、5、6 h,反應液冷卻至室溫,2000 g離心20 min除去不溶物,上清液透析24 h,凍干后分析。

加壓輔助濕熱法(又稱水熱法):大豆7S球蛋白與葡聚糖以1∶1 (w/w)比例混合溶于0.2 M磷酸鹽緩沖液中(pH7.2,大豆7S球蛋白濃度4 mg/mL),帶有攪拌槳壓力反應釜中,壓力設置為10 MPa,100 ℃分別反應1、2、3、4、5、6 h,反應液冷卻至室溫,2000×g離心20 min除去不溶物,上清液透析24 h,凍干后分析。

1.2.3 褐變程度的測定 準確稱取25 mg待測品溶于5 mL水中,以水作空白樣,于420 nm下測定吸光值[19]。

采用XRF法[15]檢測樣品（NaCl、城市固體廢棄物模擬組分和廚余沼渣）中的Cl含量；取約3 g樣品，分別將硼酸和樣品用壓片機（10 MPa下恒壓30 s）壓制成片放入 XRF儀器中，測定其中的 Cl含量。

1.2.4 接枝度的測定 準確稱取40 mg的OPA溶解于1 mL的甲醇中,分別加入20%(w/V)的SDS 2.5 mL、0.1 mol/L的硼砂25 mL、100 μLβ-巰基乙醇,最后用蒸餾水定容至50 mL。此為OPA試劑。測定時,取OPA試劑4 mL于試管中,分別注入200 μL樣品液,混勻后于35 ℃反應2 min,340 nm下測其吸光值A1,以在OPA試劑中加入200 μL水為空白樣,二者之差ΔA為自由氨基的凈吸光值[20]。以賴氨酸作出標準曲線(y=11.387x-0.0226,R2=0.9915),根據(jù)ΔA計算樣品中自由氨基的含量C。

接枝度(DG,%)=(A0-A1)/A0×100

1.2.4 氨基酸分析 稱取一定量的樣品置于消解管中,加入6 mol/L HCl溶液,在110 ℃下密封水解24 h。用Waters美國高效液相色譜儀進行氨基酸自動分析除色氨酸以外的氨基酸含量,采用PICO.TAG氨基酸分析柱,柱溫38 ℃,檢測波長為254 nm,流速1 mL/min。

1.2.5 內(nèi)源熒光光譜分析 參考文獻方法[21],有少許改動。用10 m mol/L的磷酸緩沖液(pH7.0)配制不同方法制備的糖基化產(chǎn)品待測液(蛋白濃度1 mg/mL),使用熒光分光光度計分別在激發(fā)波長為334 nm處進行發(fā)射波長掃描(350～500 nm)。

1.2.6 統(tǒng)計分析 實驗中所有數(shù)據(jù)都是三次測定的平均值,利用一維方差分析的LSD比較樣品平均值之間的差異顯著性。

2 結果與分析

2.1大豆7S球蛋白的純度

分離純化的大豆7S球蛋白圖譜見圖1,從圖1可以看出,大豆7S球蛋白的α′、α、和β亞基被明顯分離出來,并且泳道上大豆11S球蛋白的亞基條帶非常弱,說明大豆7S球蛋白組份的純度較高,光密度分析結果顯示,大豆7S球蛋白的純度在90%以上,并且利用杜馬斯燃燒定氮法測定出的大豆7S球蛋白含量為:92.56%±1.21%(干基含量,N×5.71),可以滿足本研究所用純度。

圖1 大豆7S球蛋白組分SDS-PAGE分析Fig.1 SDS-PAGE analysis for soybean 7S fraction

2.2.1 濕熱法和加壓輔助濕熱法反應時間對于反應程度的影響 圖2顯示的是反應時間對于濕熱法和加壓輔助濕熱法褐變程度和接枝度的影響,結果顯示:反應時間的延長有利于糖基化反應的進行,并且反應在0～1 h時,褐變程度和接枝度增長最快,褐變程度由吸光值0.095增加至吸光值0.24,接枝度由零增加至10.60%,在2～3 h時,褐變程度和接枝度出現(xiàn)第二個增長較快區(qū),褐變程度由吸光值0.29增加至吸光值0.368,接枝度由12.5%增加至19.61%,反應程度增加較快。

圖2 時間對接枝度和褐變程度的影響Fig.2 Effect of time on the DG and the browning

從圖2還可以發(fā)現(xiàn),隨著反應時間的進行,壓力體系的褐變程度始終略低于不加壓的體系,這說明低壓能夠抑制反應物的褐變程度。在接枝度的檢測中發(fā)現(xiàn),壓力體系的接枝度始終略高于不加壓的體系,隨著反應時間的延長,壓力體系褐變程度的增加卻始終低于不加壓體系,一些資料報道[22-23],高靜壓能夠加速Maillard反應的初級階段但是延遲了高級階段有色物質的產(chǎn)生,說明在10 MPa較低的壓力體系中這種作用依然存在,而這種作用正是所期望的蛋白質和多糖糖基化理想的反應程度,也就是抑制功能特性較差以及產(chǎn)生較多有害物質的Maillard高級階段產(chǎn)物的形成,使得反應產(chǎn)物集中在功能特性好以及有害物質較少的初級階段末期和中級階段。

為了更確切地比較三種制備產(chǎn)物的性質和結構,本研究選擇接枝度接近于干熱法產(chǎn)物的濕法產(chǎn)物和水熱法產(chǎn)物,最終濕熱法和水熱法產(chǎn)物選擇的反應時間為3 h,三者接枝度分別是:干熱法為18.70%±0.32%;濕熱法為19.61%±0.21%;水熱法為21.65%±0.23%。

2.2.2 加壓輔助濕熱法中壓力對于反應程度的影響 本研究對濕熱法反應體系通過充入氮氣施加壓力,從圖3可以看出,壓力從0～10 MPa過程中,褐變程度隨著壓力的增加而略有下降,吸光值從0.325下降至0.303,接枝度從19.61%升高至21.6%,接枝度在6 MPa以后升高較快,有可能是壓力在0～6 MPa之間,壓力過小對于反應的加速作用不明顯,圖3也顯示,低壓仍有助于反應的進行,這可能是由于在反應體系壓力和溫度的作用下,蛋白質肽鏈有利于展開[24],暴露更多的游離氨基于肽鏈表面而促使更多的游離氨基和糖鏈發(fā)生共價結合。因此,壓力體系中根據(jù)壓力反應釜的壓力范圍最終選用10 MPa作為加壓輔助濕熱法所用壓力值。

圖3 壓力對接枝度及褐變程度的影響Fig.3 Effect of pressure on the DG and the browning

2.3糖基化產(chǎn)物反應程度的比較

利用褐變程度、接枝度來反映三種糖基化方法的反應程度,見圖4。圖4表明,在接枝度接近的情況下,干熱法糖基化產(chǎn)物褐變程度明顯低于另外兩種方法的糖基化產(chǎn)物,有顯著性差異(p<0.05),這說明在干法相對濕法溫和的反應條件下,干法能夠抑制產(chǎn)物的褐變,即抑制了高級階段產(chǎn)物的形成。

圖4 三種制備產(chǎn)物褐變程度和接枝度的比較Fig.4 Effect of glycosylation methods on the DG and the browning注:1-未反應的大豆7S球蛋白;2-干熱法糖基化產(chǎn)物;3-濕熱法糖基化產(chǎn)物;4-加壓輔助濕熱法產(chǎn)物;不同小寫字母代表差異顯著(p<0.05)。

2.4糖基化產(chǎn)物氨基酸分析

對三種糖基化產(chǎn)物進行氨基酸分析,結果見表1。通過對氨基酸含量進行分析,在糖基化反應過程中,大豆7S球蛋白氨基酸中主要是賴氨酸和精氨酸含量減少,這是由于賴氨酸和精氨酸的側鏈上存在自由氨基,參與了大豆7S球蛋白和葡聚糖的糖基化反應,在表1中也發(fā)現(xiàn),干熱法產(chǎn)品精氨酸含量從7.86%減少至6.79%,濕熱法產(chǎn)品和加壓輔助濕熱法產(chǎn)品分別減少至7.66%和7.61%,說明干熱法與其他兩種方法相比有利于精氨酸自由氨基的反應,然而干熱法產(chǎn)品賴氨酸含量減少幅度沒有其他兩種方法大,干熱法產(chǎn)品賴氨酸含量從4.77%減少至3.37%,濕熱法產(chǎn)品和加壓輔助濕熱法產(chǎn)品分別減少至2.58%和2.45%,表明濕熱法產(chǎn)品和加壓輔助濕熱法產(chǎn)品有利于賴氨酸自由氨基參與反應。

表1 大豆7S球蛋白和糖基化產(chǎn)物的氨基酸組成(g/100 g氨基酸)Table 1 Amino acid compositions of β-conglycinin and glycated products(g/100 g amino acid)

2.5糖基化產(chǎn)物內(nèi)源熒光光譜分析

有色物質的形成是Maillard反應中一個顯著又重要的特征,在Maillard反應中產(chǎn)生的熒光物質和有色物質并非完全相同[25],研究發(fā)現(xiàn)[26]熒光物質是有色物質的前體物。因此可以對三種產(chǎn)物的熒光強度進行比較,以進一步對三種產(chǎn)物的反應程度進行比較,在對三種糖基化產(chǎn)物進行熒光分析時,選定激發(fā)波長為334 nm,所得熒光光譜掃描圖如圖5所示,大豆7S球蛋白在430 nm處有最大熒光強度,而糖基化產(chǎn)品在400 nm左右處有最大熒光強度,符合Maillard產(chǎn)物具有的熒光特征。對三種產(chǎn)物的熒光光譜圖比較,發(fā)現(xiàn)濕熱法產(chǎn)品的熒光光譜圖譜高于其它兩種方法,三種產(chǎn)物在400 nm處熒光強度高低順序為:濕熱法產(chǎn)品>水熱法產(chǎn)品>干熱法產(chǎn)品,并且濕熱法和水熱法兩種產(chǎn)品在400 nm處的熒光強度明顯高于干熱法,這說明在水相體系中的糖基化反應程度高于干熱法的反應程度,反應易向高級階段進行,在水相體系中壓力對于生成熒光物質具有抑制作用,即壓力反應程度沒有不加壓的濕熱法高,也印證了2.2.1的結論。

圖5 大豆7S球蛋白和糖基化產(chǎn)物熒光光譜Fig.5 Fluorescence spectra of β-conglycinin and glycated products

3 結論

對大豆7S球蛋白和葡聚糖的糖基化產(chǎn)物從反應程度、氨基酸組成等方面進行研究可知三種制備方法反應程度的差異,干熱法反應環(huán)境擁擠,反應條件溫和,產(chǎn)物主要形成于Maillard反應的初期末期和中期初期,即理想的反應階段,而濕熱法反應劇烈,易于發(fā)生蛋白質肽鏈的聚集和展開,加速了Maillard反應的進行,產(chǎn)物較多形成于Maillard反應的高級階段,壓力能夠對Maillard反應的進行具有一定的抑制作用,可以控制反應向理想階段進行。并且氨基酸分析發(fā)現(xiàn),大豆7S球蛋白和葡聚糖的糖基化主要發(fā)生在蛋白質肽鏈上的賴氨酸和精氨酸側鏈上的自由氨基,而干熱法與其它兩種方法相比糖鏈更有易于和精氨酸側鏈上的自由氨基發(fā)生共價交聯(lián),而濕熱法和加壓輔助濕熱法相比糖鏈更易于和賴氨酸側鏈上的自由氨基發(fā)生共價交聯(lián)。壓力作為糖基化反應的一種技術輔助手段,對于以Maillard反應為機理的蛋白質糖基化反應的可控性及工業(yè)化實現(xiàn)，均具有實際應用價值。

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