陸奕娜，魏建華，許 慨，張林田，陳建偉

（汕頭出入境檢驗檢疫局，汕頭515031）

海洋生物中砷化合物的含量較高，是人體攝入砷的重要來源［1］。常見的砷化合物有亞砷酸［As（Ⅲ）］、砷酸［As（Ⅴ）］、一甲基砷酸（MMA）、二甲基 砷 酸 （DMA）、砷 甜 菜 堿 （AsB）、砷 膽 堿（AsC）［2］、洛 克 沙 砷 （ROX）、4－氨 基 苯 砷 酸 （p－ASA）、2－氨基苯砷酸（o－ASA）［3］等。不同形態(tài)的砷毒性差異很大［4］，其中無機砷 As（Ⅲ）和As（Ⅴ）毒性最大［5］，甲基胂酸（MMA）和二甲基胂酸（DMA）等有機胂的毒性較小，而砷甜菜堿（AsB）、砷膽堿（AsC）通常被認為無毒［6－7］。

有機胂劑（洛克沙胂、阿散酸）具有抗寄生蟲病、促進動物生長［8］、改善動物生產(chǎn)品質(zhì)等多重作用，在畜牧養(yǎng)殖業(yè)中被大量使用。這些含砷的排泄物或以有機肥料進入農(nóng)田，或直接排至魚塘、河流、海洋［9］。2004年，在中國則有6×106kg的砷進入環(huán)境中［10］，并隨著食物鏈進入水產(chǎn)品中。

目前，砷形態(tài)分析大多采用高效液相色譜和電感耦合等離子體質(zhì)譜聯(lián)用技術［11］。本工作利用高效液相色譜和電感耦合等離子體質(zhì)譜聯(lián)用技術，建立同時快速測定海產(chǎn)品中9種砷形態(tài)化合物的分析方法，以期為海產(chǎn)品的質(zhì)量控制提供技術支持。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1100型高效液相色譜儀，配四元泵及自動進樣器；Agilent 7700X型電感耦合等離子體質(zhì)譜儀；CBL C9860A型超聲波萃取儀；Hettich型高速離心機；BUCHI型多平行樣品蒸發(fā)儀；Milliplus 2150型超純水處理系統(tǒng)。

砷標準物質(zhì)：As（Ⅲ）［GBW 0866，（124.3±2.0）mg·L－1］、As（Ⅴ）［GBW 08667，（32.4±0.7）mg·L－1］、MMA［GBW 08668，（46.2±1.5）mg·L－1］、DMA［GBW 08669，（97.4±3.3）mg· L－1］、AsB［GBW 08670，（92.2±2.7）mg·L－1］、AsC［GBW 08671，（91.6±3.7）mg· L－1］、ROX （16820200）、p－ASA（10300250）、o－ASA（F58WD－HK），均購于國家標準物質(zhì)研究中心，使用前用水配制成1.00mg·L－1標準儲備溶液，于0～5℃避光保存。

乙二胺四乙酸二鈉（EDTA）溶液：200mmol·L－1，稱取EDTA 7.444 8g溶于100mL水中。

1.2 儀器工作條件

1）ICP－MS條件 射頻功率1 450W，測質(zhì)量數(shù)75（As），采樣周期為0.8s，采集時間為1 200s，載氣為高純氬氣，同心霧化器，載氣流量為1.00L·min－1。

2）HPLC條件 Hamilton PRP－X100陰離子分析柱（250mm×4mm，10μm）；流動相 A 為0.5mmol·L－1（NH4）2CO3溶液－甲醇（99＋1），用氨水調(diào)pH 至8.5，流動相B為50mmol·L－1（NH4）2CO3溶液－甲醇（99＋1），用甲酸調(diào)pH 至8.5；進樣量25μL。梯度洗脫程序：0min時，A為100%，流量為1.0mL·min－1；1～8min，B 為100%，流量為1.0mL·min－1；9～18min時，B為100%，流量為1.1mL·min－1；19～20min時，A為100%，流量為1.0mL·min－1。

1.3 試驗方法

稱取均質(zhì)后的樣品1.000 0g于50mL離心管中，加入流動相A 38mL混勻，超聲萃取2h，再加乙酸2mL，加水定容至50mL，混勻。于4℃冰箱中靜止10min后，取清液以14 000r·min－1轉(zhuǎn)速離心15min，吸取上清液過0.22μm濾膜至進樣小瓶供HPLC－ICP－MS測定。如果離心后的溶液出現(xiàn)渾濁現(xiàn)象，則將離心機溫度設置為6℃重新離心，樣品中的油脂分層凝固在離心管上層，用小勺小心去除；或離心完成后將離心管置于冰箱冷藏保存2～3h以上，取出后去除上層油脂層，取1mL溶液再過0.22μm 濾膜至進樣小瓶供 HPLC－ICP－MS測定，上機前加入200mmol·L－1的EDTA溶液50μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

試驗考察了淋洗液流量為0.8～1.3mL·min－1對保留時間和分離度的影響。結(jié)果表明：隨淋洗液流量的增加，保留時間縮短，流量為0.8mL·min－1時，9種砷形態(tài)化合物的完全出峰時間太長，需要25min才能洗脫完畢；流量為1.0mL·min－1時，23min內(nèi)完全出峰。由于前7種砷形態(tài)化合物的出峰時間比較短，流量不用設置太大，前期流量設置為1.0mL·min－1。后兩種砷形態(tài)化合物的出峰時間較長，因此將后期的流量加快，分別設置為1.1mL·min－1、1.3mL·min－1、1.5mL·min－1，對應的色譜圖見圖1。

由圖1可知：加快流量能加快后兩種砷形態(tài)化合物的出峰，1.1mL·min－1流量比1.0mL·min－1流量能明顯加快后兩種砷化合物的出峰，但是當流量提高至1.3mL·min－1及1.5mL·min－1時，出峰時間加快效果不明顯，從保護色譜柱及色譜儀的角度出發(fā)，試驗將流量設置為前期的1.0mL·min－1及后期的1.1mL·min－1。最終9種砷形態(tài)化合物在20min內(nèi)達到基線完全分離。

圖1 不同流量下9種砷形態(tài)化合物的色譜圖Fig.1 Chromatograms of nine arsenic species under different flow rates

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

2.2.1 射頻功率

試驗考察了射頻功率分別為 1 000，1 050，1 100，1 150，1 200，1 250，1 300，1 350，1 400，1 450，1 500，1 550，1 600W 對靈敏度及氧化物、雙電荷的影響，結(jié)果見圖2，圖3。

圖2 射頻功率對靈敏度的影響Fig.2 Effects of radio frequency power on sensitivity

由圖2可知：Y89的計數(shù)即靈敏度隨著射頻功率的增加呈現(xiàn)先增后略減的趨勢，當射頻功率在1 450～1 500W 時，Y89的靈敏度最高。從圖3可以看出：隨著射頻功率的增加，氧化物急劇減少而雙電荷先減后增，其原因是隨著射頻功率的增加，矩管中心溫度升高，導致氧化物解離和雙電荷形成。射頻功率為1 450～1 600W 時，靈敏度、氧化物和雙電荷都能滿足調(diào)諧要求。為了減少質(zhì)譜干擾，試驗選擇射頻功率為1 450W。

圖3 射頻功率對氧化物、雙電荷的影響Fig.3 Effects of radio frequency power on oxides and double－charges

2.2.2 載氣流量

試驗考察了載氣流量分別為0.80，0.85，0.90，0.95，1.00，1.05，1.10，1.15，1.20mL·min－1對靈敏度及氧化物、雙電荷的影響，結(jié)果見圖4，圖5。

由圖4可知：隨著載氣流量的增加，靈敏度呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢，當流量在1.00～1.05mL·min－1時靈敏度最大。由圖5可知：載氣對雙電荷的干擾呈現(xiàn)先略少后增加的趨勢，氧化物的干擾則也是先略少后急劇增加。載氣流量設置在1.00～1.05mL·min－1時，儀器靈敏度、氧化物、雙電荷均最佳。為了在提高靈敏度的同時減少氧化物的干擾，試驗選擇載氣流量為1.00mL·min－1。

2.2.3 輔助氣流量

試驗考察了輔助氣流量對靈敏度及氧化物、雙電荷的影響，結(jié)果見圖6，圖7。

圖4 載氣流量對靈敏度的影響Fig.4 Effects of gas flow rate on sensitivity

圖5 載氣流量對氧化物、雙電荷的影響Fig.5 Effects of carrier gas flow on oxides and double charges

圖6 輔助氣流量對靈敏度的影響Fig.6 Effects of auxiliary gas flow rate on sensitivity

由圖6可知：隨著輔助氣流量的增加，靈敏度呈現(xiàn)下降的趨勢，輔助氣流量為0的情況下，靈敏度最大。由圖7可知，輔助氣對雙電荷及氧化物的干擾隨著流量的增加而增加。因此，試驗不使用輔助氣。

圖7 輔助氣流量對氧化物、雙電荷的影響Fig.7 Effects of auxiliary gas flow rate on oxides and double charges

2.3 前處理的優(yōu)化

2.3.1 萃取時間

對萃取時間做單因素試驗，取藍圓鲹及方斑東風螺樣品，按萃取時間分別為 30，60，90，120，150min進行萃取，測定結(jié)果見圖8和圖9，由于As（Ⅲ）、MMA、As（Ⅴ）、p－ASA、ROX及o－ASA不同萃取時間的測定結(jié)果均小于檢出限，圖中只對檢出項目AsC、AsB、DMA、p－ASA（方斑東方螺檢出）進行對比。由試驗結(jié)果可知：120min為萃取的最佳時間，既可保證最大提取效率，又可節(jié)約試驗時間。

圖8 萃取時間對砷化合物提取效率的影響Fig.8 Effects of extraction time on extraction efficiency of arsenic species

2.3.2 萃取溫度

為了驗證萃取溫度是否造成砷形態(tài)之間的轉(zhuǎn)化及損失，對萃取溫度做了單因素試驗。在空白樣品（羅非魚）中添加40μg·kg－1的9種砷形態(tài)化合物標準物質(zhì)進行超聲，通過加入冰塊將萃取溫度控制在20，30，40，50℃及不加入冰塊不控制溫度（實測最高55℃）進行120min萃取，與不超聲直接上機測定的結(jié)果作比較，測定結(jié)果見表1。

表1 超聲萃取溫度對砷形態(tài)化合物測定結(jié)果的影響Tab.1 Effects of ultrasonic extraction temperatures on determination results of arsenic species μg·kg－1

由表1可知：萃取溫度在2h內(nèi)對9種砷形態(tài)化合物的測定沒有明顯的影響，不會造成砷形態(tài)之間的互相轉(zhuǎn)化。

2.3.3 萃取次數(shù)

在萃取過程中，萃取次數(shù)對回收率有著重要影響，萃取次數(shù)如不夠，萃取不完全，目標物損失較多，而萃取次數(shù)過多，既造成試劑浪費又造成檢測時間太長，工作效率低。以檢出砷形態(tài)化合物種類較多的三疣梭子蟹為研究對象，按試驗方法萃取3次，比較3次提取液中各砷形態(tài)化合物的測定值，結(jié)果見表2。

表2 萃取次數(shù)對測定結(jié)果的影響Tab.2 Effects of extraction times on determination results μg·kg－1

由表2可知：按照2h超聲萃取一次，被測物基本已經(jīng)萃取完全，有很少一部分被測物殘留在殘渣里，比例不到2%，主要是萃取后的殘渣沒有瀝干，殘渣吸附的液體中含有極少的砷化合物。第三次提取液中9種砷形態(tài)化合物均為未檢出?？紤]到試驗時間及萃取效率，且第二次萃取的殘留量極低，試驗確定的萃取次數(shù)為一次。

2.4 標準曲線及測定下限

移取 0，1.0，5.0，10，20，40，80，100mL 的AsC、As（Ⅲ）、DMA、MMA、As（Ⅴ）、p－ASA、ROX、o－ASA（AsB 再添加 200，400mL）質(zhì)量濃 度為1.00mg·L－1的各標準儲備溶液，用水定容至1L，配制成0，1.0，5.0，10，20，40，80，100μg·L－1（AsB增加200，400μg·L－1兩個級別）的混合標準溶液系列，上機前加入200mmol·L－1的EDTA溶液50μL，按儀器工作條件進行測定，以峰面積對各砷形態(tài)化合物的質(zhì)量濃度進行線性回歸。結(jié)果表明，9種砷形態(tài)化合物的質(zhì)量濃度在100μg·L－1內(nèi)與對應峰面積呈線性關系，線性回歸方程及相關系數(shù)見表3。

采用 1.0μg·L－1的 AsC、AsB、As（Ⅲ）、DMA、MMA、As（Ⅴ）、p－ASA 及2.0μg·L－1的ROX、o－ASA共9種砷形態(tài)化合物混合標準溶液的色譜圖，選取一段噪聲，以峰對峰計算信噪比。以10倍信噪比計算測定下限。確定 HPLC－ICP－MS聯(lián)用技術檢測魚類、蝦類、貝類、蟹類等水產(chǎn)品中AsC、AsB、As（Ⅲ）、DMA、MMA、As（Ⅴ）、p－ASA的測定下限為50μg·kg－1，ROX、o－ASA的測定下限為100μg·kg－1。

2.5 精密度與回收試驗

試驗同時選擇羅非魚陰性樣品在測定下限的1，2，10倍添加標準溶液，按試驗方法進行測定，回收率在74.0%～109%之間，6次測定結(jié)果的相對標準偏差在5.4%～13%之間。

表3 線性參數(shù)與測定下限Tab.3 Linearity parameters and lower limits of determination

2.6 樣品分析

按試驗方法同時測定汕頭市海域附近的魚、蝦、蟹類等海產(chǎn)品中9種砷形態(tài)化合物的含量，結(jié)果見表4。

表4 海產(chǎn)品中9種砷形態(tài)化合物測定結(jié)果Tab.4 Determination results of 9arsenic species in marine products μg·kg－1

由表4可知：樣品中的砷主要以砷甜菜堿（AsB）形式存在，較多的樣品含有少量的 AsC，DMA及 MMA檢出較少，毒性較大的As（Ⅲ）、As（Ⅴ）含量較低，且無機砷含量即 As（Ⅲ）與As（Ⅴ）總和均小于GB 2762－2012《食品安全國家標準 食品中污染物限量》［12］中無機砷的限量要求，樣品基本不含有有機胂制劑p－ASA、ROX、o－ASA。

本工作通過對質(zhì)譜、色譜條件的優(yōu)化，使AsC、AsB、As（Ⅲ）、DMA、MMA、As（Ⅴ）、p－ASA、ROX及o－ASA等9種砷形態(tài)化合物在20min內(nèi)得以分離，基線平穩(wěn)，是目前文獻分離項目較多的方法之一。其中AsC、AsB、As（Ⅲ）、DMA、MMA、As（Ⅴ）在8min內(nèi)得以完全分離，是目前文獻中出峰速率最快的。同時采用適當簡便的前處理技術提取樣品中9種砷形態(tài)化合物，該方法能快速地分析水產(chǎn)品中9種砷形態(tài)化合物。試驗收集到的樣品中，所有樣品均檢出AsB，且含量占絕對優(yōu)勢，即采集到的樣品中砷主要以無毒的AsB形式存在，與文獻［13－17］報道相符；較多的樣品含有AsC；毒性較大的As（Ⅲ）、As（Ⅴ）較少檢出且含量比較低；MMA及DMA檢出同樣較少；基本不含有有機胂制劑p－ASA、ROX、o－ASA。

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