顧啟濱， 鄧立明,*， 鐘誠(chéng)

骨肉瘤是常見的原發(fā)骨惡性腫瘤，在中國(guó)每年發(fā)病率約為3／100萬(wàn)，預(yù)后較差，多發(fā)生在10～20歲青少年，死亡率較高，給社會(huì)和家庭帶來(lái)了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)及生活負(fù)擔(dān)［1］。目前傳統(tǒng)的治療方法存在很多缺陷，如不良反應(yīng)嚴(yán)重及容易復(fù)發(fā)等。牛蒡子苷元是我國(guó)傳統(tǒng)中藥牛蒡子果實(shí)中提取分離而來(lái)的木脂素類化合物，在臨床研究中具有悠久的歷史，除了作為傳統(tǒng)中藥治療風(fēng)熱感冒、癰腫瘡毒等［2］，牛蒡子苷元還具有抗炎、抗病毒、抗腫瘤等多重功效［3－4］。已證實(shí)牛蒡子苷元可通過(guò)介導(dǎo)乳腺癌MDA－MB－231細(xì)胞的凋亡來(lái)抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，通過(guò)觸發(fā)線粒體凋亡途徑導(dǎo)致Bax相關(guān)蛋白的上調(diào)和Bcl－2相關(guān)蛋白表達(dá)水平的下調(diào)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡信號(hào)的產(chǎn)生，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［5］。同時(shí)牛蒡子苷元能夠抑制結(jié)腸癌CT26細(xì)胞血管生成，能夠降低VEGFR－2的基因水平［6］。牛蒡子苷元對(duì)人骨肉瘤細(xì)胞系MG－63的增殖及凋亡作用尚未見報(bào)道，本研究探討不同濃度的牛蒡子苷元對(duì)骨肉瘤細(xì)胞MG－63增殖及凋亡作用的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 人骨肉瘤細(xì)胞系MG－63購(gòu)自美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)（ATCC），于本研究室液氮中保存；RPMI－1640培養(yǎng)基購(gòu)買自Hyclone公司 （美國(guó)）；胰蛋白酶 （Trypsin），青霉素＆鏈霉素（Penicillin－Streptomycin， P.S.） 及胎牛血清 （FBS） 購(gòu)買自 Gibco公司 （美國(guó)）；二甲基亞砜 （DMSO），DEPC水購(gòu)買自索萊寶公司 （北京）；甲醛、丙二醇、無(wú)水乙醇、氯仿、異丙醇購(gòu)自廣州化學(xué)試劑廠 （廣州）；Prime Script RT reagent Kit－RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒，SYBR Premix Ex Taq熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自TAKARA公司 （日本）；牛蒡子苷元購(gòu)于上海晶都生物技術(shù)有限公司；PEG400購(gòu)于上海生物工程股份有限公司；Annexin V－FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、 Cell Counting Kit－8 （CCK－8試劑盒）均購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)有限公司；RNA提取試劑盒購(gòu)于北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2 牛蒡子苷元配制 稱取適量的牛蒡子苷元溶于DMSO中，充分溶解后配置成1 mg／mL濃度的母液，將母液用50 mM醋酸鈉溶液分別稀釋成為 3 個(gè)工作濃度 （10 μg／mL、 50 μg／mL、100 μg／mL）， 溶液中包括 40%PEG400， 調(diào)節(jié) pH 值至 5.0， 過(guò)濾除菌后－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 人骨肉瘤細(xì)胞MG－63的培養(yǎng) 將人骨肉瘤細(xì)胞系MG－63用含 10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基 （含 100 μg／mL青霉素、100 μg／mL鏈霉素）于37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)基中培養(yǎng)，細(xì)胞融合度達(dá)到70%～80%時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化傳代。

1.4 細(xì)胞增殖分析 細(xì)胞增殖的分析按照CCK－8試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作試驗(yàn)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MG－63細(xì)胞，在96孔板中每孔加入100微升2 000個(gè)細(xì)胞，分別加入10 μL配置好的不同濃度的牛蒡子苷元溶液，藥物對(duì)照為含DMSO的緩沖液，再加入10 μL CCK－8溶液，空白對(duì)照為加入100 μL細(xì)胞培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)做三個(gè)重復(fù)。于37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)基中培養(yǎng)，分別在0 h、12 h、24 h、48 h、72 h時(shí)加入CCK8試劑，孵育1 h后酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm吸光值，進(jìn)行結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析。

1.5 流式檢測(cè)MG－63細(xì)胞凋亡 取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的MG－63細(xì)胞，按照1×105／mL鋪于48孔板，過(guò)夜生長(zhǎng)后加入不同濃度（10 μg／mL、 50 μg／mL、 100 μg／mL） 牛蒡子苷元， 對(duì)照為牛蒡子苷元配置緩沖液，實(shí)驗(yàn)做三個(gè)重復(fù)。細(xì)胞用藥物刺激24 h后，把細(xì)胞培養(yǎng)液吸出至一合適離心管內(nèi)，PBS洗滌貼壁細(xì)胞一次，加入適量胰酶細(xì)胞消化液 （不含EDTA）消化細(xì)胞。加入 5 μL Annexin V－FITC， 輕輕混勻。 加入 10 μL碘化丙啶染色液，混勻后待測(cè)。室溫 （20℃～25℃）避光孵育10～20分鐘，隨后置于冰浴中，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析細(xì)胞凋亡情況。

1.6 熒光定量PCR檢測(cè)相關(guān)基因表達(dá) 對(duì)基因Bax（引物Forward： CCCGAGAGGTCTTTTTCCGAG； Reverse： CCAGCCCAT GATGGTTCTGAT）、 Bcl－2 （引物 Forward： GGTGGGGTCATGTGTGTGG； Reverse： CGGTTCAGGTACTCAGTCATCC） 和 VEG FR－2 （引物 Forward： GGCCCAATAATCAGAGTGGCA； Reverse：CCAGTGTCATTTCCGATCACTTT）進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)。收集藥物處理24 h后的MG－63細(xì)胞，用RNA提取試劑盒提取細(xì)胞RNA。RNA反轉(zhuǎn)錄采用Prime Script反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行。在4℃環(huán)境或者冰上，向RNase－Free的 8連管 （Axygen，200 μL容量） 中加入 2 μL 5× Prime Script Buffer， 0.5 μL RT Enzyme Mix， 0.5 μL Oligo dT Primer （50 μM）， 0.5 μL Random 6 mers（100 μM）， RNA 500 ng， RNase－Free H2O 調(diào)整至 10 μL， 混勻后離心。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為：37℃15分鐘 （反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)），85℃5秒 （反轉(zhuǎn)錄酶的失活反應(yīng)）。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)采用SYBR Premix Ex Taq試劑盒 （Takara公司）進(jìn)行。在冰上或4℃操作環(huán)境下配制20 μL PCR反應(yīng)液：10 μL SYBR Premix Ex Taq （2× ）， 0.4 μL Forward Primer （10 μM） ， 0.4 μL Reverse Primer （10 μM）， 2 μL DNA 模板 （100 ng）， 7.2 μL ddH2O。 混勻，離心后，用Bio－Rad CFX96熒光定量PCR儀中進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)選用兩步法程序，退火溫度60℃。基因的表達(dá)差異通過(guò)分析實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組的目的基因和管家基因，經(jīng)2－△△CT方法進(jìn)行比較；每個(gè)樣本的每個(gè)基因均做三個(gè)重復(fù)，取平均值進(jìn)行最后的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用兩因素的方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 牛蒡子苷元對(duì)骨肉瘤細(xì)胞MG－63增殖的影響 實(shí)驗(yàn)在細(xì)胞水平檢測(cè)了不同濃度牛蒡子苷元對(duì)人骨肉瘤細(xì)胞MG－63增殖的影響 （圖1），隨著細(xì)胞生長(zhǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，MG－63細(xì)胞處于增殖狀態(tài)。而與對(duì)照相比較發(fā)現(xiàn)，牛蒡子苷元對(duì)細(xì)胞MG－63增殖具有明顯的抑制作用，并且隨著藥物劑量的增加，其抑制效率更加明顯。

圖1 牛蒡子苷元對(duì)骨肉瘤細(xì)胞MG－63增殖的影響

2.2 牛蒡子苷元對(duì)骨肉瘤細(xì)胞MG－63凋亡的影響 用不同濃度的牛蒡子苷元處理骨肉瘤細(xì)胞MG－63，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)其對(duì)細(xì)胞凋亡的影響 （圖2），從結(jié)果中發(fā)現(xiàn)隨著牛蒡子苷元濃度的增加，凋亡的MG－63細(xì)胞明顯增加。該結(jié)果提示牛蒡子苷元對(duì)骨肉瘤細(xì)胞MG－63細(xì)胞增殖的影響可能與其凋亡有關(guān)。從圖中看出在對(duì)照組中發(fā)生凋亡的細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的1.88%；在 1 μg／mL 藥物濃度下， 凋亡細(xì)胞上升至 8.83%； 在 5 μg／mL藥物濃度下，凋亡細(xì)胞上升至15.9%；在 10 μg／mL藥物濃度下，凋亡細(xì)胞上升至36.0%。藥物處理組與對(duì)照相比較凋亡細(xì)胞百分比具有顯著差異。

圖2 流式檢測(cè)牛蒡子苷元對(duì)骨肉瘤細(xì)胞MG－63凋亡的影響

2.3 熒光定量PCR檢測(cè)牛蒡子苷元對(duì)相關(guān)基因表達(dá)的影響 進(jìn)一步對(duì)不同濃度牛蒡子苷元處理過(guò)的MG－63細(xì)胞提取其RNA，反轉(zhuǎn)錄后對(duì)Bcl－2、Bax、VEGFR－2基因進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè) （圖3）。隨著牛蒡子苷元濃度的增加，基因Bcl－2的表達(dá)水平呈下降趨勢(shì)，Bcl－2具有抑制細(xì)胞凋亡的作用，這提示著牛蒡子苷元能夠下調(diào)Bcl－2基因的表達(dá)，從而促進(jìn)MG－63細(xì)胞的凋亡。同時(shí)檢測(cè)了促凋亡基因Bax的表達(dá)水平，結(jié)果顯示隨著藥物濃度的增加，其Bax的表達(dá)水平明顯上升，這提示著藥物能夠增加對(duì)細(xì)胞凋亡的影響。血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體2（VEGFR－2）能夠促進(jìn)血管的生成，隨著牛蒡子苷元濃度的增加，VEGFR-2基因的表達(dá)下降，提示藥物具有抑制骨肉瘤細(xì)胞MG－63血管生成的作用。

圖3 熒光定量PCR檢測(cè)牛蒡子苷元對(duì)Bcl－2、Bax和VEGFR－2基因表達(dá)的影響

3 討論

天然藥物作為抗腫瘤藥物研發(fā)的重要來(lái)源被廣大學(xué)者廣泛關(guān)注。天然抗腫瘤藥物具有其特有的治療機(jī)制，同時(shí)臨床效果明顯、毒副作用弱，已經(jīng)被越來(lái)越多的研究證明。目前臨床使用量已占到腫瘤治療藥物的3／4。隨著近年來(lái)對(duì)牛蒡子苷元的研究及廣泛的臨床前研究，發(fā)現(xiàn)牛蒡子苷元具有廣泛的藥理活性，不僅具有調(diào)控炎性因子的表達(dá)和免疫調(diào)節(jié)的作用，還具有抑制多種腫瘤的作用， 如乳腺癌［6］、 肺癌［7］、 膀胱癌［8］、 結(jié)腸癌等［9］。其作用機(jī)制主要集中在阻止細(xì)胞周期G0／G1期，或在G2／M期抑制腫瘤細(xì)胞的增殖；然而牛蒡子苷元在骨肉瘤中的作用及機(jī)制尚未有研究報(bào)道。

本研究結(jié)果顯示，在沒(méi)有藥物干預(yù)的情況下MG－63細(xì)胞一直處于增殖狀態(tài)。經(jīng)過(guò)牛蒡子苷元處理后，其增殖會(huì)受到明顯抑制，并且隨著藥物劑量的增加，其抑制效率更加明顯。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同濃度的牛蒡子苷元處理后骨肉瘤細(xì)胞MG－63的凋亡情況 （圖2），結(jié)果也證實(shí)隨著牛蒡子苷元濃度的增加，凋亡的MG－63細(xì)胞明顯增加。上述結(jié)果提示牛蒡子苷元對(duì)骨肉瘤細(xì)胞MG－63細(xì)胞增殖的影響可能與其凋亡有關(guān)。進(jìn)一步的統(tǒng)計(jì)學(xué)處理也表明藥物處理組與對(duì)照相比較凋亡細(xì)胞百分比具有顯著差異。為了探討牛蒡子苷元?dú)鸐G－63細(xì)胞的機(jī)制，本研究對(duì)不同濃度牛蒡子苷元處理過(guò)的MG－63細(xì)胞提取其RNA，反轉(zhuǎn)錄后對(duì)Bcl－2、Bax、VEGFR－2基因進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè) （圖3）。在細(xì)胞凋亡過(guò)程中，Bcl－2家族成員起著至關(guān)重要的作用。Bcl－2是細(xì)胞死亡的負(fù)調(diào)因子，在許多類型的細(xì)胞受到外界刺激時(shí)能保護(hù)細(xì)胞免于凋亡。隨著牛蒡子苷元濃度的增加，Bcl－2基因的表達(dá)水平呈下降趨勢(shì)，Bcl－2具有抑制細(xì)胞凋亡的作用，這提示牛蒡子苷元能夠下調(diào)Bcl－2基因的表達(dá)，從而促進(jìn)MG－63細(xì)胞的凋亡。Bax是Bcl－2同源相關(guān)蛋白，Bax的過(guò)度表達(dá)可拮抗Bcl－2的保護(hù)效應(yīng)而使細(xì)胞趨于死亡。本研究結(jié)果也顯示隨著藥物濃度的增加，Bax的表達(dá)水平明顯上升，這提示著藥物能夠增加對(duì)細(xì)胞凋亡的影響。

血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體2（VEGFR－2）能夠促進(jìn)血管的生成，在促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起到重要的作用。隨著牛蒡子苷元濃度的增加，VEGFR－2基因的表達(dá)下降，提示藥物具有抑制骨肉瘤細(xì)胞MG－63血管生成的作用。

本研究結(jié)果表明，牛蒡子苷元能夠抑制MG－63細(xì)胞的增殖，同時(shí)能夠使其發(fā)生細(xì)胞凋亡。在基因水平檢測(cè)細(xì)胞凋亡相關(guān)的基因發(fā)現(xiàn)，牛蒡子苷元也能夠降低凋亡抑制基因Bcl－2的表達(dá)水平，提高促凋亡基因Bax的表達(dá)水平，而且對(duì)血管生長(zhǎng)因子受體VEGFR－2基因的表達(dá)也有抑制作用。這些結(jié)果都表明，在細(xì)胞水平牛蒡子苷元具有抗骨肉瘤細(xì)胞MG－63的作用。本研究為體外試驗(yàn)，牛蒡子苷元抗骨肉瘤的生物活性還需建立體內(nèi)試驗(yàn)進(jìn)行進(jìn)一步的驗(yàn)證，其藥物作用的精確靶點(diǎn)及其作用機(jī)制還需要深入研究，為牛蒡子苷元進(jìn)一步的改構(gòu)及臨床應(yīng)用提供基礎(chǔ)。

[1] Picci P.Osteosarcoma(osteogenic sarcoma) [J].Orphanet J Rare Dis,2007,(2):6.

[2] 米靖宇,宋純清.牛蒡子中木脂素類化合物的抗腫瘤及免疫活性[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥,2002,13(3):168-169.

[3] Tsai WJ,Chang CT,Wang GJ,et al.Arctigenin from Arctium lappa inhibits interleukin-2 and interferon gene expression in primary human T lymphocytes[J].Chin Med,2011,6(1):12.

[4] Tang X,Zhuang J,Chen J,et al.Arctigenin efficiently enhanced sedentary mice treadmill endurance[J].PLoS One,2011,6(8):e24224.

[5] Hsieh CJ,Kuo PL,Hsu YC,et al.Arctigenin,a dietary phytoestrogen,induces apoptosis of estrogen receptor-negative breast cancer cells through the ROS/p38 MAPK pathway and epigenetic regulation[J].Free Radic Biol Med,2014,67:159-170.

[6] Gu Y,Scheuer C,Feng D,et al.Inhibition of angiogenesis:a novel antitumor mechanism of the herbal compound arctigenin[J].Anticancer Drugs,2013,24(8):781-791.

[7] Susanti S,Iwasaki H,Inafuku M,et al.Mechanism of arctigenin-mediated specific cytotoxicity against human lung adenocarcinoma cell lines[J].Phytomedicine,2013,21(1):39-46.

[8] Yang S,Ma J,Xiao J,et al.Arctigenin anti-tumor activity in bladder cancer T24 cell line through induction of cell-cycle arrest and apoptosis[J].Anat Rec(Hoboken),2012,295(8):1260-1266.

[9] Kang K,Lee HJ,Yoo JH,et al.Cell and nuclear enlargement of SW480 cells induced by a plant lignan,arctigenin:evaluation of cellular DNA content using fluorescence microscopy and flow cytometry[J].DNA Cell Biol,2011,30(8):623-629.