唐業(yè)東，張正紅，唐宗浩，王正朝

福建師范大學生命科學學院福建省發(fā)育與神經(jīng)生物學重點實驗室，福州 350007

囊胚成功著床到母體子宮內(nèi)膜中，是成功妊娠和胚胎進一步發(fā)育的必要條件，與許多發(fā)育過程相似，胚胎著床蘊含著復雜的分子機制。在小鼠中，子宮腔和腺上皮細胞在妊娠的第1天至第2天開始處于增殖狀態(tài)，隨著時間的推移，這些細胞從細胞周期中退出并進入允許其轉(zhuǎn)變?yōu)榻邮軤顟B(tài)的分化程序。與上皮相鄰的基質(zhì)細胞在妊娠的第3天開始增殖，并且在第4天時，胚胎附著于子宮腔上皮，隨后這種增殖變得普遍。當胚胎通過管腔上皮進入基質(zhì)中時，基質(zhì)細胞將逐步分化成分泌性蛻膜細胞，用以支持著床的胚胎進一步生長和發(fā)育，直到胎盤形成[1]。在此期間，Wnt信號通路發(fā)揮了重要的調(diào)控作用。Wnt家族成員最知名的是在胚胎發(fā)育過程中對細胞命運決定、增殖、分化和凋亡中的調(diào)控作用，其主要通過與受體、效應物和抑制物之間的相互作用在組織或器官發(fā)育過程中發(fā)揮功能?，F(xiàn)有研究表明，Wnt家族成員對哺乳動物胚胎著床前子宮內(nèi)膜的改變和早期胚胎的發(fā)育過程具有至關(guān)重要的調(diào)控作用[2- 3]。

胚胎著床過程

在哺乳動物中，胚胎著床過程涉及激活胚胎與接受態(tài)子宮內(nèi)膜之間的相互作用，主要包括激活囊胚的定位、黏附以及植入過程[4- 5]。激活的囊胚成功著床到母體子宮內(nèi)膜中，是成功妊娠和胚胎進一步發(fā)育的重要條件。囊胚必須在稱為“著床窗口”的有限時期內(nèi)植入到母體子宮內(nèi)膜中[6- 7]，即胚胎著床能力的獲得與子宮內(nèi)膜接受態(tài)的建立必須同步。子宮對正常囊胚著床的敏感期主要可分為3個階段：著床前期，著床期及不應期。在小鼠的著床前期，妊娠第4天之前，通常認為子宮處于接受前期；妊娠第4天，在卵巢的黃體激素和著床前雌激素的誘導下，子宮將處于完全接受態(tài)；妊娠第5天下午開始，子宮將進入非接受態(tài)時期，即不應期。當子宮處于接受態(tài)時，將誘導胚胎著床的發(fā)生，進入著床期，此時子宮腔上皮細胞將發(fā)生動態(tài)變化，如小鼠懷孕第4天的早晨，在孕酮和雌激素的誘導下，子宮腔上皮細胞停止增殖，與此同時，上皮細胞經(jīng)歷分化，伴隨著動態(tài)的連接復合體重塑和細胞膜的成熟，導致著床位點周圍的上皮細胞極性下降，細胞形態(tài)由柱狀變?yōu)榱⒎叫?，從而逐步實現(xiàn)囊胚在第4天晚上附著在子宮壁上的能力[8- 9]。胚胎著床后，在著床位點周圍的子宮間質(zhì)細胞將經(jīng)歷大范圍的增殖和分化，這一過程被稱為蛻膜化。這種子宮基質(zhì)向蛻膜轉(zhuǎn)化的過程，主要由孕酮和雌激素調(diào)節(jié)，所形成的蛻膜床負責向胚胎提供營養(yǎng)并形成屏障，以防止在胎盤成熟之前滋養(yǎng)層侵襲不受控制。因此，正常發(fā)育的蛻膜對于成功妊娠至關(guān)重要[10]。

Wnt信號通路

Wnt信號通路與生物體中的多種關(guān)鍵功能相關(guān)，如增殖、分化、炎癥、再生和凋亡等[11- 13]。由Wnt配體激活的信號傳導可分為兩類：經(jīng)典的Wnt/β-catenin依賴性途徑與非經(jīng)典的β-catenin非依賴性途徑。在哺乳動物中，已經(jīng)鑒定出19個Wnt配體：Wnt1、Wnt2、Wnt2b/13、Wnt3、Wnt3a、Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt6、Wnt7a、Wnt7b、Wnt8a、Wnt8b、Wnt9a、Wnt9b、Wnt10a、Wnt10b、Wnt11和Wnt16；10個跨膜G蛋白偶聯(lián)受體Frizzled1- 10(FZD1- 10)和2個低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白 (low-density lipoprotein receptor-related protein，LRP)：LRP- 5和LRP- 6[14]，并且每個組分都展示出不同的表達模式和功能[15- 16]。然而，一個Wnt配體可以激活多個途徑，這取決于下游組分的表達[17]。Wnt信號通路的失調(diào)與多種疾病相關(guān)，如癌癥、阿爾茨海默癥、精神分裂癥、糖尿病和帕金森病等，目前的研究已經(jīng)將Wnt信號通路作為治療多種疾病的潛在靶點[11，15，18- 19]。

β-catenin依賴性途徑β-catenin是一種多功能蛋白，在細胞增殖、分化、生長和存活等多種生理過程中具有至關(guān)重要的作用，同時也是Wnt信號通路的主要參與者，在發(fā)育起始及成體組織平衡中發(fā)揮著重要作用[20]。β-catenin位于細胞基質(zhì)中，可以與由軸蛋白 (Axin)、腺瘤性息肉病大腸桿菌(adenomatous polyposiscoliprotein，APC)、糖原合酶激酶- 3B(glycogen synthase kinase- 3B，GSK- 3B)和酪蛋白激酶1α(casein kinase 1α，CK1α)組成的泛素蛋白酶復合物相結(jié)合，其激活與抑制取決于信號通路的開關(guān)。當β-catenin結(jié)合Axin和APC蛋白時，將會被GSK- 3B和CK1α磷酸化，進而導致其被泛素蛋白酶復合物降解。在FZD與Wnt配體相互作用時，其可與LRP家族的成員共同作用，產(chǎn)生的信號通過蓬亂蛋白(Dishevelled，Dsh)轉(zhuǎn)導到β-catenin降解復合體，以避免β-catenin的磷酸化和降解。因此，β-catenin能夠以未磷酸化的形式累積在細胞基質(zhì)中，當達到一定的量后，便可以轉(zhuǎn)移到細胞核，在細胞核中，β-catenin通過置換轉(zhuǎn)錄抑制子Groucho蛋白家族(transducin-like enhancer of split，TLE)作為Wnt靶基因的轉(zhuǎn)錄共調(diào)節(jié)子，然后與T細胞因子(T cell factor，TCF)/淋巴增強因子(lymphoid enhancer factor，LEF)轉(zhuǎn)錄因子家族的成員結(jié)合來調(diào)控Wnt靶基因的轉(zhuǎn)錄[20- 23]。

β-catenin非依賴性途徑β-catenin非依賴性途徑被定義為與β-catenin轉(zhuǎn)錄功能無關(guān)的Wnt-或FZD-啟動的信號，包含了多種復雜的信號途徑，如Wnt/planar cell polarity (PCP)、Wnt-cGMP/Ca2+、Wnt/cAMP、Wnt/ROR、Wnt/RAP、Wnt/RAC和Wnt/RHO途徑。其中Wnt/PCP和 Wnt-cGMP/Ca2+途徑的特征較為明顯[24]。

Wnt/PCP途徑最初是在果蠅中鑒定出來，由非經(jīng)典Wnt信號配體Wnt5a或Wnt11與FZD和Dsh結(jié)合誘導，然后，激活的Wnt/PCP信號通路可通過Dsh活化Rho家族GTPases酶(pros-homologous A，Rho A)和Rac蛋白，以及它們的下游靶點Rho相關(guān)的卷曲螺旋蛋白激酶1(rho-associated，coiled-coil-containing protein kinase 1，Rock1)和JNK1激酶(JunN terminalkinase1，JNK1)，與轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白- 1(activator protein- 1，AP- 1)及c-jun的氨基末端區(qū)域結(jié)合后，具有誘導下游靶基因表達的能力，從而在調(diào)節(jié)細胞極性、細胞運動和形態(tài)發(fā)生運動方面發(fā)揮突出作用[24- 26]。

Wnt-cGMP/Ca2+途徑最初在非洲爪蟾和斑馬魚胚胎中發(fā)現(xiàn)[27]，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的Ca2+釋放入胞漿是Wnt/Ca2+信號途徑中的關(guān)鍵步驟，進而Wnt/FZD結(jié)合復合物將使胞漿中的Dsh活化，一方面可通過抑制阻止Ca2+釋放的cGMP依賴性蛋白激酶(cGMP dependent protein kinase，PKG)使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+釋放增多，另一方面可通過激活磷脂酶C(phospholipase C，PLC)和升高1，4，5—三磷酸肌醇(1，4，5-trisphosphate rinositol，IP3)使細胞質(zhì)游離的Ca2+增多，然后升高的Ca2+可進一步激活Ca2+相關(guān)蛋白酶，如鈣調(diào)磷酸酶、蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)和鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ(calmodulin-dependent protein kinaseⅡ，CamKⅡ)[24，28]。后來的研究發(fā)現(xiàn)，CamKⅡ可以進一步激活TGF-β激酶(TGF-β-activated kinase 1，Tak1)以及NEMO激酶(nemo-like kinase，NLK)，使TCF磷酸化，從而抑制經(jīng)典Wnt信號通路的活性[29]。而鈣調(diào)磷酸酶可進一步活化T細胞核因子(nuclear factor of activated T cells，NF-AT)和核因子κB (nuclear factor，NF-κB)等轉(zhuǎn)錄因子，進而誘導下游靶基因的表達[30- 31]。

Wnt信號在圍著床過程中的作用

在Wnt信號傳導中，β-catenin在腺和基質(zhì)細胞中表達，并在子宮內(nèi)膜周期的增殖期和分泌期期間高度表達，參與胚胎著床和子宮內(nèi)膜增殖、分化和蛻膜化[3]。在小鼠中，Wnt/β-catenin信號通路的沉默會阻礙胚泡的著床，子宮條件性缺失β-catenin或過表達β-catenin也影響正常的著床和蛻膜化過程，子宮條件性缺失Wnt4將導致胚胎著床和子宮蛻膜失敗[32- 33]。在人體中，孕酮可以誘導蛻膜化期子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞表達經(jīng)典Wnt信號通路的分泌抑制物Dickkopf- 1 (DKK- 1)，且婦女子宮內(nèi)膜DKK- 1的異常表達與胚胎著床受損相關(guān)[34]。此外，Wnt5a在人類子宮內(nèi)膜蛻膜化過程中介導孕酮的功能。由此可見，Wnt信號通路在小鼠和人的胚胎著床以及蛻膜化過程中起著重要作用[32]。

Wnt信號與子宮內(nèi)膜接受態(tài)的建立胚胎的成功著床要求子宮功能健全且子宮腔上皮處于接受態(tài)，同時需要激活囊胚使其能與子宮壁附著。在子宮接受態(tài)前期到子宮接受態(tài)配置完成的過程中，子宮腔上皮會發(fā)生動態(tài)的膜重組和去極化，及時調(diào)控上皮細胞膜的成熟并保持子宮腔上皮的完整性，對于人類和小鼠的胚胎著床過程具有至關(guān)重要的作用[8]。在此過程中，Wnt信號被認為是在子宮內(nèi)膜功能的正常發(fā)揮過程中的重要因素[35]。

胚胎著床需要雌激素和孕酮的協(xié)調(diào)作用。在嚙齒動物中，雌激素刺激子宮腔上皮和腺上皮的增殖、分化，而且在基質(zhì)細胞的分化過程中，雌激素和孕酮都是必需的[36]。為了研究人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞中雌激素和β-catenin信號傳導分子機制，Xiong等[37]發(fā)現(xiàn)在人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞中，雌激素以時間和劑量依賴性的方式誘導β-catenin RNA和蛋白質(zhì)的表達，然后與TCF/LEF家族結(jié)合，增加子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞(endometrial stromal cells，ESC)層的血管生成。同時，Zhang等[22]研究發(fā)現(xiàn)，雌激素誘導的β-catenin可以上調(diào)ESC中的血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的表達，從而促進了子宮內(nèi)膜異位癥患者病變血管的生成。此外，在小鼠子宮接受態(tài)建立的過程中，即在小鼠妊娠的第3～4天，Cha等[38]在其子宮中檢測出Wnt5a基因的時空表達，也表明Wnt5a與小鼠子宮的接受態(tài)建立有關(guān)。

Wnt信號與囊胚激活囊胚的激活對于成功的著床過程至關(guān)重要，在此過程中，囊胚獲得了附著于接受態(tài)子宮內(nèi)膜的能力[39]。早期實驗證明，經(jīng)典Wnt信號通路的異常對于囊胚的形成沒有明顯的影響[40]，但是，在囊胚激活的過程中卻發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[41]。例如，De Vries等[42]的實驗結(jié)果表明，與對照組小鼠相比，卵母細胞中條件性缺失β-catenin的雌性小鼠與野生型公鼠交配后的產(chǎn)仔數(shù)顯著減少。而Xie等[39]也利用DKK- 1或小分子抑制劑阻斷經(jīng)典Wnt信號通路，證實了經(jīng)典Wnt信號的抑制將會損害囊胚植入子宮內(nèi)膜的能力，同時也發(fā)現(xiàn)了經(jīng)典Wnt信號通路的正常表達需要與非經(jīng)典的Wnt/RhoA信號通路的阻斷相結(jié)合時，才可以使得囊胚具有正常的植入能力。Tsang等[43]利用Wnt3a或氯化鋰處理誘導Wnt信號途徑從而使囊胚獲得附著能力，被成功激活。由此可見，Wnt信號通路在囊胚激活的過程中同樣具有不可替代的作用。

Wnt信號與胚胎著床在小鼠中，妊娠1～3 d的子宮處于接受態(tài)前期，胚胎不能著床；妊娠第4天處于完全接受態(tài)，在第4天夜晚，囊胚著床部位的子宮內(nèi)膜血管通透性增加且囊胚附著在子宮腔上皮；在妊娠第5天，當基質(zhì)細胞開始擴大和分化為蛻膜細胞時，將使得著床變得更加牢固[9]。胚胎著床對于成功妊娠至關(guān)重要[4- 5]，且只能在“著床窗口”期間發(fā)生[6- 7]。在這個關(guān)鍵階段，許多因素可以調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜細胞中各種功能蛋白的表達水平，包括激素、生長因子、細胞因子等。Wnt信號通路的激活在此過程中扮演著重要的角色[39]。胚胎附著于子宮腔上皮和入侵到子宮內(nèi)膜是早期妊娠的關(guān)鍵事件，為了確定Wnt4是否在此過程中起作用，F(xiàn)ranco等[33]利用對照組(Wnt4f/f)和Wnt4雙敲除(Wnt4d/d)雌性小鼠與輸精管切除的雄性小鼠交配，在第0.5天時，將野生型小鼠囊胚移植到實驗組小鼠的輸卵管中，且在第5.5天時檢測著床位點數(shù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Wnt4d/d小鼠胚胎著床能力明顯下降。

Wnt5a作為非經(jīng)典的Wnt配體，在著床子宮中存在時空表達。Cha等[38]利用LoxP-Cre系統(tǒng)，構(gòu)建了子宮中Wnt5a基因滅活(Wnt5ad/d)和過表達(Wnt5aGOF)的小鼠模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)突變型小鼠的卵巢功能正常，但Wnt5ad/d小鼠生育能力嚴重受損，Wnt5aGOF小鼠的生育能力也出現(xiàn)了一定的損傷，懷孕母鼠的胚胎著床能力較對照組明顯脆弱，且顯示紊亂的胚胎著床傾向，后期發(fā)育過程中胚胎的重吸收率也明顯上升。

由于在子宮肌層和基質(zhì)中過表達β-catenin的小鼠的輸卵管出現(xiàn)畸形，最終將導致小鼠不育[44]，所以Patterson等[23]利用胚胎移植技術(shù)，繞過畸形的輸卵管進行胚胎著床，結(jié)果發(fā)現(xiàn)由于基質(zhì)細胞蛻膜化過程受到過表達的β-catenin干擾，導致著床位點數(shù)顯著少于對照組，表明間質(zhì)和上皮之間的旁分泌信號傳導對于子宮接受胚胎著床和隨后的蛻膜化過程至關(guān)重要，同時多種信號途徑參與其中，如STAT3信號通路。當這些途徑受到干擾時，將會阻礙胚胎著床和蛻膜化的進行，而在子宮“著床窗口”期間，過表達β-catenin的突變體小鼠子宮中pSTAT3表達受阻[23]，這些結(jié)果表明了Wnt信號對胚胎著床的重要性，且在著床后期的子宮基質(zhì)蛻膜化過程中同樣不可或缺。

Wnt信號與子宮基質(zhì)蛻膜化蛻膜化是子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞增殖、分化為蛻膜細胞的過程，主要由孕酮引起。在小鼠妊娠的第4.5天，囊胚附著到子宮上皮后開始蛻膜。在附著反應之后，著床囊胚周圍的基質(zhì)細胞增殖并分化形成蛻膜床。在妊娠期間，蛻膜細胞產(chǎn)生激素和細胞因子，這對胚胎發(fā)育至關(guān)重要，如在妊娠期間分泌控制滋養(yǎng)層侵襲的因子。而Wnt信號通路同樣參與了子宮內(nèi)膜基質(zhì)蛻膜化過程[32]。

Wnt5a不僅在著床過程中起作用，同樣也會影響蛻膜化過程，如敲除或過表達著床子宮中的Wnt5a信號將導致初級蛻膜區(qū)形成異常。在著床開始時，隨著Bmp2在囊胚周圍的基質(zhì)中表達，蛻膜化程度明顯增加，說明Bmp2在此過程中發(fā)揮重要作用，而異常的Wnt5a信號表達會降低Bmp2的表達活性，從而干擾基質(zhì)細胞的蛻膜化進程[38]。同時，Wnt6的缺陷也會大大妨礙子宮基質(zhì)的蛻膜化過程[32]。在妊娠第7～8天，Wnt6缺陷型(Wnt6-/-)小鼠著床部位的重量和大小都顯著降低，野生型(WT)小鼠子宮在假孕第4天時，子宮腔內(nèi)注射油，4 d后表現(xiàn)出強烈的蛻膜反應，而Wnt6-/-小鼠子宮中的蛻膜反應卻顯著減少[32]。在檢測的12只Wnt6-/-小鼠中，有6只小鼠蛻膜化程度較低，其他6只甚至缺乏蛻膜反應，這說明Wnt6對正常子宮蛻膜化至關(guān)重要，進一步研究發(fā)現(xiàn)Wnt6缺乏會減少細胞周期蛋白B1的表達，從而延長細胞周期，最終阻礙子宮間質(zhì)細胞增殖[32]。而Wnt4敲除小鼠的子宮存在缺陷，使小鼠生育能力下降[33]，表明Wnt4在胚胎著床過程中具有調(diào)節(jié)基質(zhì)細胞蛻膜化的作用。在子宮發(fā)育和妊娠期間，β-catenin活性必須嚴格調(diào)控，因為功能喪失和過表達β-catenin都會導致成年小鼠的生殖缺陷[23]。由此可見，Wnt信號通路對于小鼠蛻膜化過程的正常進行的重要性。

總結(jié)與展望

胚胎著床是妊娠過程的一個關(guān)鍵環(huán)節(jié)，對哺乳動物的成功妊娠與胚胎的早期發(fā)育具有非常重要的意義。Wnt信號通路已被證實在胚胎著床過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，包括接受態(tài)的建立、囊胚的激活、胚胎著床的調(diào)控以及蛻膜化過程的發(fā)生。在人體中，Wnt信號調(diào)控蛻膜化、子宮內(nèi)膜功能和滋養(yǎng)細胞分化，并且在生殖相關(guān)疾病的研究中也發(fā)現(xiàn)了Wnt信號的異常變化，如子宮內(nèi)膜異位癥、子宮內(nèi)膜癌和先兆子癇等。通過研究Wnt信號通路在胚胎著床以及相關(guān)疾病中的作用，有助于進一步了解胚胎著床及其相關(guān)疾病的發(fā)生機制，對于生殖疾病的治療研究具有重大意義。

目前，生殖疾病在人類中具有較高的發(fā)病率，嚴重影響人們的健康與生活質(zhì)量，然而，相關(guān)的發(fā)病機制仍有很大程度上的未知。因此，積極開展生殖生理功能的調(diào)控以及相關(guān)疾病的發(fā)病機制研究具有重要的臨床意義，不但可以為開發(fā)新靶向性藥物提供重要的理論基礎(chǔ)，還可以為人類生殖相關(guān)疾病的預防、診斷和治療提供新的治療方案和線索。

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