廖鵬志，劉 端，鄭月宏

中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院血管外科，北京 100730

2型糖尿病是一種可以損傷多個(gè)靶器官、引起多種并發(fā)癥的慢性疾病，在中國(guó)成年人中發(fā)病率為11.6%[1]。糖尿病相關(guān)血管并發(fā)癥是糖尿病患者的主要死因，其中包括糖尿病足、糖尿病腎病和糖尿病視網(wǎng)膜病變。糖尿病引起的血管損傷與高糖有關(guān)，高糖繼發(fā)的糖代謝紊亂以及晚期糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycationend products, AGE)引起活性氧簇(reactive oxygen species, ROS)過(guò)表達(dá)進(jìn)而激活了促炎信號(hào)通路[2]。血管壁內(nèi)的ROS增多在糖尿病血管病變中起重要作用，ROS的一個(gè)重要來(lái)源就是線粒體[3]，但高糖是如何通過(guò)線粒體產(chǎn)生ROS的，其具體機(jī)制還未完全闡釋清楚。

序列相似性家族3(family with sequence similarity 3，F(xiàn)am3)基因家族是1個(gè)新發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞因子樣基因家族，包含F(xiàn)am3A、Fam3B、Fam3C和Fam3D 4個(gè)成員[4]。4個(gè)基因之間的相似性在31.6%～53.3%間。Fam3家族參與一系列病理生理過(guò)程，其中包括非酒精性脂肪性肝病、糖尿病和腫瘤[5- 6]。Fam3A包含230個(gè)氨基酸殘基，可在人體多種組織中廣泛表達(dá)，其中在血管內(nèi)皮表達(dá)最多[4]。作為一種重要的糖脂代謝調(diào)節(jié)因子，F(xiàn)am3A可作用于線粒體，促進(jìn)ATP合成和分泌[5]。Fam3A的高表達(dá)可明顯抑制高糖血癥、脂肪肝，其機(jī)制可能與磷脂酰肌醇- 3激酶(phosphoinositide 3-kinase，PI3K)/蛋白質(zhì)絲氨酸蘇氨酸激酶(protein kinase B，PKB,即AKT)信號(hào)通路相關(guān)[5]。最近研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)am3A可通過(guò)減少線粒體ROS合成、抑制細(xì)胞色素C釋放和降低ATP合成的下降程度，進(jìn)一步抑制細(xì)胞凋亡[7- 8]。盡管以往研究顯示Fam3A可以抑制過(guò)氧化氫或者衣霉素引起的線粒體ROS生成增多，但其在高糖引起的血管損傷中是否也能發(fā)揮同樣的作用目前尚不清楚。本研究檢測(cè)了高糖刺激下人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)的Fam3A表達(dá)水平，探討了Fam3A在高糖引起的ROS產(chǎn)生及線粒體能量合成中的作用。

材料和方法

材料HUVECs(貨號(hào)：#8000，批號(hào)：15536，有效日期：2020年12月1日)、內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基(endothelial cell medium，ECM)(貨號(hào)：1001)購(gòu)自美國(guó)ScienCell公司，高糖培養(yǎng)基用葡萄糖(貨號(hào)：G8270)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；siFam3A試劑盒(貨號(hào)：stQ0012863- 1)購(gòu)自廣州市銳博生物科技有限公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號(hào)：ah301)購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司，MinuteTM動(dòng)物細(xì)胞/組織總蛋白提取試劑盒(貨號(hào)：SD- 001/SN- 002)購(gòu)自美國(guó)Invent公司，ELISA試劑盒(貨號(hào)：SEK356Hu)購(gòu)自美國(guó)Cloud-Clone公司，OxiSelectTMIn Vitro ROS/RNS 試劑盒(貨號(hào)：STA- 347-T)購(gòu)自美國(guó)Cell Biolabs公司，ATP檢測(cè)使用試劑盒(貨號(hào)：S0026)購(gòu)自北京碧云天生物技術(shù)有限公司；抗體P-p38(#4511)、p38(#8690)購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司。

細(xì)胞培養(yǎng)參照ScienCell公司提供的標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行復(fù)蘇傳代，具體為將HUVECs置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中，濕潤(rùn)條件下貼壁生長(zhǎng)，培養(yǎng)液為5%FBS ECM。收集第6～8代細(xì)胞凍存于液氮中備用。

Fam3A表達(dá)的檢測(cè)HUVECs用5%FBS-ECM培養(yǎng)至貼壁面積大于90%后，采用無(wú)血清ECM預(yù)處理24 h后分為對(duì)照組和高糖組兩組：對(duì)照組更換為5.5 mmol/L葡萄糖的ECM繼續(xù)培養(yǎng)48h待檢；高糖組更換為33.3 mmol/L葡萄糖的ECM分別繼續(xù)培養(yǎng)6、12、24、48 h后待檢；每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。

RT-qPCR：TRIZOL法提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA模板，依照SYBR PREMIX EX TAP TM說(shuō)明書行PCR檢測(cè)，引物序列：Fam3A sense鏈5’-ACCCTGGTGTTCGTGGCA- 3’，antisense鏈5’- AGCTCCTTGGCGTTCCTG- 3’。

ELISA：采用MinuteTM動(dòng)物細(xì)胞/組織總蛋白提取試劑盒提取HUVECs總蛋白，BCA法檢測(cè)蛋白濃度，F(xiàn)am3A ELISA試劑盒測(cè)Fam3A蛋白濃度。

小干擾RNA轉(zhuǎn)染HUVECs生長(zhǎng)至貼壁面積達(dá)到80%后，參照siFam3A試劑盒標(biāo)準(zhǔn)流程分別用siNT和siFam3A各轉(zhuǎn)染兩組，24 h后檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率，48 h后采用無(wú)血清ECM處理24 h，然后分為siNT對(duì)照組、siNT高糖組、siFam3A對(duì)照組、siFam3A高糖組4組，兩個(gè)對(duì)照組均更換為5.5 mmol/L葡萄糖的ECM繼續(xù)培養(yǎng)24 h待檢，兩個(gè)高糖組均為更換為33.3 mmol/L葡萄糖的ECM繼續(xù)培養(yǎng)24h后待檢；每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。

細(xì)胞內(nèi)ROS測(cè)定:采用PBS溶液收集HUVECs(1～2)×107/ml，4℃超聲勻漿，12 000 r/min離心5min取上清獲得ROS檢測(cè)樣本，ROS試劑盒檢測(cè)ROS。

細(xì)胞內(nèi)ATP檢測(cè):HUVECs 4℃條件下裂解，12 000 r/min離心5min收集上清獲得待測(cè)樣本，ATP檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果以占siNT對(duì)照組百分比表達(dá)。

線粒體氧耗率的檢測(cè)：在37℃環(huán)境下采用XF24細(xì)胞內(nèi)分析儀(Seahorse Bioscience，USA)檢測(cè)線粒體氧耗率(oxygen consumption rate, OCR)，BCA法檢測(cè)蛋白濃度，OCR結(jié)果用pMO2/(μg蛋白·min)表示。

P-p38和p38的檢測(cè)：采用Western blot法，MinuteTM動(dòng)物細(xì)胞/組織總蛋白提取試劑盒提取HUVECs總蛋白，BCA法測(cè)蛋白濃度，SDS-PAGE電泳、ImageJ軟件分析蛋白條帶。所用抗體為P-p38、p38、β-actin。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

各組細(xì)胞內(nèi)Fam3A表達(dá)水平培養(yǎng)6、12、24、48 h后，高糖組Fam3A mRNA與對(duì)照組的相對(duì)表達(dá)量分別為1.38±0.09、1.52±0.11、2.52±0.19、2.34±0.20，其中，24h組與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=13.296，P=0.000)；Fam3A蛋白濃度分別為(69.49±43.44)、(86.73±20.06)、(173.82±33.28)、(125.94±35.95)pg/ml，其中，24 h組明顯高于對(duì)照組的(39.45±33.78)pg/ml (t=4.907，P=0.006)。

各組細(xì)胞內(nèi)ROS含量檢測(cè)結(jié)果siNT高糖組細(xì)胞內(nèi)ROS含量為(8217±794)RFU，明顯高于siNT對(duì)照組的(3982±398)RFU(t=15.109，P=0.002)；siFam3A高糖組細(xì)胞內(nèi)ROS含量為(11 910±1 001)RFU，明顯高于siFam3A對(duì)照組的(4171±402)RFU(t=9.705，P=0.010)和siNT高糖組(t=4.026，P=0.048)。

各組細(xì)胞內(nèi)ATP水平檢測(cè)結(jié)果以siNT對(duì)照組ATP合成量為基線，siNT高糖組、siFam3A對(duì)照組和siFam3A高糖組細(xì)胞內(nèi)ATP合成相對(duì)值分別為(61.2±5.6)%、(94.6±8.4)%和(29.7±2.7)%，siNT高糖組明顯低于siNT對(duì)照組(t=12.001，P=0.007)，siFam3A高糖組明顯低于siFam3A對(duì)照組(t=20.742，P=0.002)和siNT高糖組(t=18.814，P=0.003)。

各組細(xì)胞內(nèi)線粒體OCR的檢測(cè)結(jié)果siNT高糖組的線粒體OCR為(0.57±0.05) pMO2/(μg蛋白·min)，明顯低于siNT對(duì)照組的(1.12±0.09) pMO2/(μg蛋白·min)(t=6.804，P=0.021)；siFam3A高糖組的線粒體OCR為(0.31±0.03) pMO2/(μg蛋白·min)，明顯低于siFam3A對(duì)照組的(1.01±0.09) pMO2/(μg蛋白·min)(t=19.876，P=0.003)和siNT高糖組(t=21.444，P=0.002)。

各組細(xì)胞P-p38的表達(dá)情況Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，以siNT對(duì)照組為基線，siNT 高糖組、siFam3A對(duì)照組和siFam3A高糖組的P-p38相對(duì)表達(dá)量分別為2.239±0.353、0.816±0.120和1.160±0.185，siNT高糖組明顯高于siNT對(duì)照組(t=6.075，P=0.026)，siFam3A高糖組明顯高于siFam3A對(duì)照組(t=6.242，P=0.024)，低于siNT高糖組(t=9.686，P=0.010)。

討 論

Fam3A是一種重要的糖脂代謝調(diào)節(jié)因子。研究發(fā)現(xiàn)，在高脂飲食飼喂的糖尿病小鼠肝臟中，F(xiàn)am3A表達(dá)明顯減少[5]。在糖尿病小鼠模型中，肝臟過(guò)表達(dá)Fam3A可以明顯減弱高糖血癥、胰島素抵抗和脂肪肝，其機(jī)制和激活PI3K/Akt信號(hào)通路抑制肝臟的糖異生和脂肪生成相關(guān)。Fam3A除了在肝臟中高表達(dá)之外，還在血管中膜高表達(dá)，提示Fam3A可能參與了血管疾病的發(fā)生。本研究分別采用普通和高糖ECM培養(yǎng)HUVECs，結(jié)果顯示，培養(yǎng)24h后，高糖組Fam3A的mRNA和蛋白表達(dá)水平均明顯高于對(duì)照組，提示高糖可以誘導(dǎo)HUVECs高表達(dá)Fam3A。

體外研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)am3A過(guò)表達(dá)可以促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞的增殖與遷移；在大鼠頸動(dòng)脈損傷模型中，F(xiàn)am3A過(guò)表達(dá)可以加重頸動(dòng)脈球囊損傷后的內(nèi)膜增生[9]。在神經(jīng)HT22細(xì)胞中，過(guò)氧化氫可以明顯抑制Fam3A的表達(dá)；Fam3A表達(dá)上調(diào)可以減少過(guò)氧化氫引起的乳酸脫氫酶釋放。過(guò)表達(dá)Fam3A可以減弱過(guò)氧化氫引起的ROS生成，并減弱ATP合成的下降程度，其作用機(jī)制和PI3K/Akt信號(hào)通路的激活相關(guān)[8]。最近研究發(fā)現(xiàn)，衣霉素可以在mRNA和蛋白層面減少Fam3A的表達(dá)。過(guò)表達(dá)Fam3A可以抑制衣霉素引起的HT22細(xì)胞凋亡和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，其機(jī)制可能是Fam3A通過(guò)C/EBP同源蛋白10-Wnt通路減少線粒體ROS生成、抑制細(xì)胞色素C釋放和保護(hù)線粒體膜電位相關(guān)[7]。在小鼠實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)am3A可能是過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ的一個(gè)下游靶基因[10]。血管壁內(nèi)的ROS生成增多在糖尿病血管損傷的發(fā)病中起重要作用。在慢性高糖血癥的刺激下，大量葡萄糖持續(xù)內(nèi)流進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ROS生成增多[11]。糖尿病常引起代謝紊亂，如血糖和游離脂肪酸濃度升高，進(jìn)而可以通過(guò)激活蛋白激酶C信號(hào)通路增加NADH氧化酶的活性促進(jìn)ROS生成[12]。研究發(fā)現(xiàn)，1型糖尿病和2型糖尿病的血管內(nèi)NADH氧化酶表達(dá)和活性均升高[13- 14]。脂質(zhì)氧化引起的ROS生成增多會(huì)引起線粒體功能障礙進(jìn)而誘發(fā)細(xì)胞凋亡[15- 16]。ROS可以通過(guò)以下4條相互關(guān)聯(lián)的高糖血癥驅(qū)動(dòng)途徑發(fā)揮作用：(1)多元醇途徑；(2)晚期糖基化終產(chǎn)物；(3)蛋白激酶C途徑；(4)己糖胺途徑[3,11,17- 18]。氧化應(yīng)激還可以促進(jìn)DNA鏈斷裂，激活多聚(ADP-核糖)聚合酶，進(jìn)而活化核因子-κB信號(hào)通路，直接引起內(nèi)皮功能障礙[19]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，siFam3A高糖組細(xì)胞內(nèi)ROS含量明顯高于siNT高糖組，ATP合成相對(duì)值明顯低于siNT高糖組，線粒體OCR明顯低于siNT高糖組，提示敲低Fam3A基因表達(dá)可加重高糖引起的ATP合成減少及線粒體OCR降低，同時(shí)促進(jìn)高糖時(shí)ROS生成增多，初步說(shuō)明Fam3A可能是通過(guò)緩解線粒體功能障礙在高糖引起的ROS生成增多發(fā)揮保護(hù)作用。

絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)是信號(hào)從細(xì)胞表面?zhèn)鲗?dǎo)到細(xì)胞核內(nèi)部的重要傳遞者。MAPK的亞族中，p38 MAPK信號(hào)通路已被證實(shí)在多種腫瘤細(xì)胞、氣管平滑肌細(xì)胞和心肌細(xì)胞等不同的細(xì)胞內(nèi)參與調(diào)節(jié)ROS的生成[20- 23]。本研究結(jié)果顯示，siFam3A高糖組的P-p38相對(duì)表達(dá)量明顯低于siNT高糖組，說(shuō)明p38 MAPK激活受到抑制，提示Fam3A可能是通過(guò)p38 MAPK信號(hào)通路調(diào)節(jié)高糖誘導(dǎo)的HUVECs內(nèi)ROS生成。

綜上，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高糖可以誘導(dǎo)HUVECs高表達(dá)Fam3A，敲低Fam3A基因表達(dá)可加重高糖引起的ATP合成減少及線粒體OCR降低，同時(shí)促進(jìn)高糖時(shí)ROS生成增多。Fam3A可能是通過(guò)p38 MAPK信號(hào)通路調(diào)節(jié)高糖誘導(dǎo)的HUVECs內(nèi)ROS生成。更多的機(jī)制需要進(jìn)一步的研究及驗(yàn)證。

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