牛 超， 劉關(guān)君， 曲春浦， 冷 雪， 張國壁， 楊成君

(1.東北林業(yè)大學(xué)林木遺傳育種國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱 150040； 2.東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150040)

氮素是植物生長(zhǎng)發(fā)育所必需的基本營養(yǎng)元素[1]，在植物生長(zhǎng)發(fā)育和形態(tài)建成中起著重要的作用[2-3]。植物從外界環(huán)境中可直接吸收土壤中的銨態(tài)氮、硝態(tài)氮等無機(jī)氮以及尿素、氨基酸等有機(jī)氮，也可通過固氮菌對(duì)氮?dú)?N2)的固氮作用獲得氮素營養(yǎng)[4]。對(duì)于NH4+的獲取有多種來源，一部分來自根通過細(xì)胞質(zhì)膜上的專一性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白吸收的NH4+與NO3-，其中NO3-由體內(nèi)細(xì)胞質(zhì)硝酸還原酶(NR)還原為NO2-，再由質(zhì)體中的亞硝酸還原酶(NiR)將進(jìn)入質(zhì)體的NO2-還原為NH4+；另一部分來自光呼吸、根瘤菌固氮作用、氨基酸代謝、類苯基丙烷代謝、衰老組織氮化合物轉(zhuǎn)移再利用等多種途徑[5]。NH4+進(jìn)入氮同化途徑后，首先NH4+和谷氨酸由谷氨酰胺合成酶(GS)催化形成谷氨酰胺，然后由谷氨酸合成酶(GOGAT)將谷氨酰胺和α-酮戊二酸轉(zhuǎn)變?yōu)?分子谷氨酸，其中一分子谷氨酸可作為GS的底物，而另一分子谷氨酸可用于合成蛋白質(zhì)、核酸等含氮化合物。在同化NH4+時(shí)，GS和GOGAT是同時(shí)起作用的，因而該途徑被稱為GS/GOGAT循環(huán)[5]。GS/GOGAT循環(huán)是無機(jī)氮轉(zhuǎn)化為有機(jī)氮的第1步，也是目前為止所發(fā)現(xiàn)的無機(jī)氮轉(zhuǎn)化成有機(jī)氮的主導(dǎo)途徑[7]。

高等植物體內(nèi)95%以上的NH4+通過GS/GOGAT循環(huán)同化，GOGAT是該途徑的限速酶[8-9]。GS與GOGAT在植物葉片、根瘤以及根中均有分布，但在不同器官中GS/GOGAT循環(huán)的作用不盡相同。在綠色組織中，GS/GOGAT循環(huán)的主要作用是同化光呼吸產(chǎn)生的NH4+以及硝酸鹽在葉中還原產(chǎn)生的NH4+；在根瘤中主要同化根瘤菌固氮產(chǎn)生的NH4+，而在根中則是同化吸收到體內(nèi)的NH4+及硝酸鹽被吸收后在根中還原產(chǎn)生的NH4+。

提高GS/GOGAT循環(huán)的效率被認(rèn)為是提高氮素利用率的一種有效途徑[10]，因此對(duì)于GS和GOGAT基因的研究引起了許多學(xué)者的關(guān)注。因?yàn)镚OGAT基因序列過長(zhǎng)(cDNA編碼序列超過6 kb)且不易操作，與GS相比[11-12]，GOGAT基因功能的研究報(bào)道相對(duì)較少。近年來隨著分子生物學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，對(duì)GOGAT基因的研究逐漸深入。本文主要總結(jié)和整理了近年來國內(nèi)外GOGAT基因的研究成果，并對(duì)GOGAT在植物氮代謝中的作用及其調(diào)控機(jī)制進(jìn)行詳細(xì)的論述。

1 GOGAT的發(fā)現(xiàn)

在1970年以前，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為谷氨酸脫氫酶(GDH)催化α-酮戊二酸的可逆還原氨化反應(yīng)，是活體中氨同化的主要途徑[13-14]。其反應(yīng)方程式為：

α-酮戊二酸 +NH3+NADH+H+谷氨酸+H2O+NAD+。

反應(yīng)式中NADH為煙酰胺腺嘌呤二核苷酸。

1970年，Tempest等報(bào)道在產(chǎn)氣桿菌的無細(xì)胞制劑中檢測(cè)到可以催化α-酮戊二酸與谷氨酰胺還原形成2分子谷氨酸的酶，命名為谷氨酰胺-α-酮戊二酸氨基轉(zhuǎn)移酶，別稱谷氨酸合成酶，縮寫為GOGAT[15]。其催化的反應(yīng)方程式為：

谷氨酰胺+α-酮戊二酸+NADPH+H+→2谷氨酸+NADP+。

反應(yīng)式中NADPH為還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸。

而先前有關(guān)細(xì)菌氨同化的研究已證實(shí)GS催化的反應(yīng)方程式為：

谷氨酸+NH3+ATP→谷氨酰胺+ADP+Pi+H2O[16]。

因此，GS與GOGAT的結(jié)合產(chǎn)生了細(xì)菌氨同化的新途徑，該途徑并未涉及到GDH[17]。對(duì)GS/GOGAT循環(huán)在細(xì)菌中(特別是在低氮供應(yīng)的條件)調(diào)控作用的研究已日趨成熟，即使如此，是GDH還是GS/GOGAT循環(huán)主要參與氨同化過程仍然是一個(gè)有爭(zhēng)議的話題。

研究表明，植物在葉綠體中將亞硝酸鹽還原為氨基酸[18-19]。然而，葉綠體中GDH的活性非常低[20]，而GS的活性較高[21]，因此推測(cè)GOGAT也可能存在于葉綠體中。用完整的豌豆葉綠體進(jìn)行試驗(yàn)，證明GOGAT催化谷氨酰胺和α-酮戊二酸形成谷氨酸[9]，該過程是以還原型鐵氧還蛋白(Fd)作為電子供體，方式與NiR相似。幾乎同時(shí)，Dougall報(bào)道了在胡蘿卜細(xì)胞基質(zhì)中存在以NAD(P)H作為電子供體的GOGAT[22]。

起初，尚不清楚NADH-GOGAT和Fd-GOGAT酶活是否由同一酶蛋白催化。Suzuki等研究表明，水稻根系和黃化葉的組織中可以用NADH和Fd作為電子供體檢測(cè)GOGAT活性[23]。然而，Suzuki等從水稻綠葉中提取并純化到相同性質(zhì)Fd-GOGAT抗體的蛋白，其抗血清不與NADH-GOGAT交叉反應(yīng)[24]。根據(jù)免疫學(xué)研究，綠葉中的Fd-GOGAT和黃化葉組織中的Fd-GOGAT是密切相關(guān)的蛋白質(zhì)；相反，根組織中的Fd-GOGAT是獨(dú)特的蛋白質(zhì)，因此NADH-GOGAT和Fd-GOGAT酶活不是由同一酶蛋白催化。光照生長(zhǎng)和黃化的水稻葉片中Fd-GOGAT蛋白含量相同，但Suzuki等研究表明水稻葉和根中Fd-GOGAT具有相關(guān)但不相同的抗原成分[25]?，F(xiàn)已確認(rèn)在一些高等植物中由2個(gè)不同基因編碼Fd-GOGAT，并在葉和根中差異表達(dá)[26]。

2 GOGAT在植物細(xì)胞中的分布及其功能

高等植物中，GOGAT依據(jù)輔酶不同可分為2類，第1類是以Fd作輔酶，稱為Fd-GOGAT，主要存在于質(zhì)體和葉綠體等綠色組織中，參與氮的初級(jí)吸收與光呼吸釋放氨的再吸收；第2類是以NADH作輔酶，稱為NADH-GOGAT，主要存在于非綠色組織中，如根瘤、根、莖和細(xì)胞質(zhì)等，參與吸收氨的同化以及固氮作用。2種酶具有不同的分子量、分子結(jié)構(gòu)、動(dòng)力學(xué)特征及細(xì)胞定位，其依賴還原力的專一性和抗原性等方面也都不同，是2種不同的蛋白質(zhì)，在植物中發(fā)揮的作用也不同。

2.1 Fd-GOGAT的定位及功能

Fd-GOGAT首先在豌豆葉的葉綠體中被發(fā)現(xiàn)[9]，光照豌豆葉綠體可以促使谷氨酰胺和α-酮戊二酸發(fā)生反應(yīng)，該反應(yīng)依賴于光反應(yīng)的放氧作用。進(jìn)一步研究表明，該反應(yīng)需要光合作用過程中光反應(yīng)階段生成的具有還原力的Fd作為電子供體，才能完成谷氨酸的合成反應(yīng)，因此該反應(yīng)特異地發(fā)生在葉綠體中。同時(shí)該反應(yīng)對(duì)重氮絲氨酸(azaserine，GOGAT抑制劑)敏感，而對(duì)蛋氨酸亞砜亞胺(methionine sulfoximine，GS抑制劑)不敏感。光照葉綠體也能促使氨和α-酮戊二酸參與反應(yīng)，同樣依賴于光反應(yīng)的放氧作用[27]。這一過程對(duì)蛋氨酸亞砜亞胺和重氮絲氨酸均敏感，可推測(cè)GS和GOGAT之間的耦合作用催化了該反應(yīng)。

現(xiàn)已在高等植物葉片[28]和低等植物藻類[29]的葉綠體中檢測(cè)到Fd-GOGAT的存在，F(xiàn)d-GOGAT可以占植物葉中總蛋白質(zhì)的1%[30]。水稻中Fd-GOGAT具有115 ku的2個(gè)亞基[25，31]，而在其他植物中該酶多數(shù)是以單體的形式存在，分子量為145～180 ku[20，32]。使用免疫金抗體定位技術(shù)在番茄的葉肉組織、木質(zhì)部薄壁組織和表皮細(xì)胞的葉綠體基質(zhì)中均檢測(cè)到Fd-GOGAT相應(yīng)的蛋白質(zhì)[33]。對(duì)玉米亞細(xì)胞定位及免疫熒光印跡(Western)分析表明，F(xiàn)d-GOGAT蛋白質(zhì)主要位于維管束鞘的葉綠體中[34]，該結(jié)果與1977年Harel等進(jìn)行酶活測(cè)定的結(jié)論一致[35]。在水稻葉的葉肉組織中，F(xiàn)d-GOGAT 蛋白質(zhì)和酶活水平最高，在完全展開的成葉薄壁細(xì)胞中水平較低，并且在葉鞘和非綠色幼葉中水平更低[36]。同樣在大麥中Fd-GOGAT存在于葉肉組織和維管組織的葉綠體中[37]。在大多數(shù)裸子植物(包括針葉樹)的葉綠體中沒有檢測(cè)到GS的存在，然而已在松樹的葉綠體中發(fā)現(xiàn)GOGAT[38]，因此推測(cè)在裸子植物中氨同化可能發(fā)生在細(xì)胞質(zhì)中。

Fd-GOGAT也存在于非光合組織中，在水稻、玉米、豆類、大麥和豌豆等植物根的質(zhì)體中均檢測(cè)到Fd-GOGAT的存在[37，39-40]，其所需還原力的Fd可能是通過氧化磷酸戊糖途徑產(chǎn)生的[41]。在水稻根中，F(xiàn)d-GOGAT酶活在根尖細(xì)胞中含量最高，隨著根細(xì)胞的成熟而逐漸降低。在幼嫩組織中，F(xiàn)d-GOGAT酶活在所有細(xì)胞中均能檢測(cè)到，但在較老組織中只有中柱中能檢測(cè)到。

2.2 NADH-GOGAT的定位及功能

以NADH作為電子供體的GOGAT(NADH-GOGAT)主要存在于植物根中[42]。現(xiàn)已從水稻懸浮培養(yǎng)細(xì)胞和根瘤中提取并純化到NADH-GOGAT，其單體的分子量為196～200 ku[20]。然而在細(xì)菌中該酶則是由2個(gè)不同亞基構(gòu)成的異源二聚體。在綠葉中NADH-GOGAT的酶活與Fd-GOGAT相比要低得多[20]。Yamaya等研究表明，在水稻非綠色和正在發(fā)育的葉片中仍存在高水平的NADH-GOGAT蛋白質(zhì)和酶活，而Fd-GOGAT則在完全展開的成熟綠色葉中占主導(dǎo)地位[36]。組織免疫印跡分析表明，NADH-GOGAT存在于水稻幼葉的維管薄壁組織細(xì)胞和維管束鞘細(xì)胞中；但在缺氮水稻根中，NADH-GOGAT相應(yīng)的蛋白質(zhì)在中柱、頂端分生組織和次生根原基中均能檢測(cè)到[43]。

3 GOGAT基因的表達(dá)

已有研究表明，葉綠體中的Fd-GOGAT主要負(fù)責(zé)光呼吸過程產(chǎn)生的氨的回收與利用。Fd-GOGAT在受光調(diào)控的同時(shí)也受供氮條件的影響，例如大麥在光照條件下，供應(yīng)硝態(tài)氮，葉中可檢測(cè)到更高水平的Fd-GOGATmRNA、蛋白質(zhì)和酶活[44]。但不同物種或不同部位存在一定的表達(dá)差異，如在煙草葉片中，無論是通過抑制光呼吸還是抑制硝酸還原都會(huì)導(dǎo)致氨的減少，對(duì)Fd-GOGAT基因的表達(dá)、蛋白質(zhì)含量和酶活都沒有影響[45]。

與綠色組織中表達(dá)的Fd-GOGAT相比，NADH-GOGAT主要在非光合作用組織及正在發(fā)育的葉片中表達(dá)，尤其在根部不同組織中會(huì)大量表達(dá)，且受氮素誘導(dǎo)明顯[13，46]。NADH-GOGAT主要參與氮素固定、硝酸還原及直接吸收產(chǎn)生氨的同化作用[47]。在水稻細(xì)胞培養(yǎng)物或根中，從缺氮狀態(tài)轉(zhuǎn)到供氮狀態(tài)后，NADH-GOGATmRNA積累顯著增加[48]。在銨態(tài)氮處理的大豆幼苗根中，NADH-GOGATmRNA的表達(dá)量、蛋白質(zhì)含量及酶活都顯著增加[49]。無論供應(yīng)低氮還是高氮，水稻根瘤中NADH-GOGAT表達(dá)水平均較高，因此推測(cè)NADH-GOGAT可能在菌根氮吸收過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[50]。

4 GOGAT調(diào)控氮代謝

4.1 GOGAT基因的調(diào)控

對(duì)于GOGAT基因的調(diào)控，可通過mRNA、蛋白質(zhì)及酶活等相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行分析。在一些植物的子葉和葉中，F(xiàn)d-GOGAT受光的誘導(dǎo)，隨著mRNA水平和蛋白質(zhì)含量的增加，其酶活也大幅增加[20]。在擬南芥中，F(xiàn)d-GOGAT1 mRNA水平受光影響在短時(shí)間內(nèi)(3 h)顯著增加，并在24 h達(dá)到峰值，而Fd-GOGAT2 mRNA水平受光的影響很小。黑暗處理對(duì)Fd-GOGAT1 mRNA的誘導(dǎo)作用不明顯，當(dāng)施加適量的蔗糖后，可以部分替代光照對(duì)Fd-GOGAT1 mRNA的誘導(dǎo)作用，但對(duì)Fd-GOGAT2無影響[9]，因此推測(cè)在擬南芥中Fd-GOGATmRNA轉(zhuǎn)錄水平和酶活的誘導(dǎo)是光通過植物色素介導(dǎo)的。Fd-GOGAT的酶活也受供氮情況的影響，這可能與光照有關(guān)[20，51]。在光照條件下，大麥葉中檢測(cè)到Fd-GOGATmRNA、蛋白質(zhì)和酶活含量是正常條件下的2倍，如果再施加適量的硝態(tài)氮，可檢測(cè)到更高水平的Fd-GOGATmRNA、蛋白質(zhì)和酶活并且植株生長(zhǎng)更加旺盛[44]。然而，在未供氮的多數(shù)植物中其水平仍明顯存在，如在煙草葉中，通過抑制光呼吸或硝態(tài)氮的還原降低了氨的含量，但Fd-GOGATmRNA、蛋白質(zhì)和酶活水平均不受影響[45]。在黑暗生長(zhǎng)的大豆幼苗中，當(dāng)供應(yīng)NH4NO3時(shí)在根中可以檢測(cè)到Fd-GOGATmRNA、蛋白質(zhì)和酶活水平的升高，但對(duì)光照下生長(zhǎng)的植物效果則不太明顯。目前關(guān)于銨態(tài)氮或硝態(tài)氮對(duì)下胚軸/莖、子葉或葉中Fd-GOGAT酶活的主要作用仍然是爭(zhēng)議的話題。在大豆中，當(dāng)供應(yīng)(NH4)2SO4時(shí)，根中的Fd-GOGAT酶活增加，而mRNA和蛋白質(zhì)沒有相應(yīng)的增加[49]。大多數(shù)情況下，在植物新葉的發(fā)育和生長(zhǎng)過程中，伴隨著光合作用和光呼吸的增強(qiáng)，F(xiàn)d-GOGAT酶活顯著增加[52]。在大麥中，隨著新葉的發(fā)育，F(xiàn)d-GOGATmRNA、蛋白質(zhì)和酶活含量有所增加，而后隨著葉片的衰老而減少[44]。Masclaux等重新研究了煙草葉片發(fā)育和衰老時(shí)氨同化過程發(fā)生的代謝，發(fā)現(xiàn)在植物頂部的第25～30片葉中，F(xiàn)d-GOGAT蛋白質(zhì)和酶活含量較高，但在老葉中明顯降低，直到植物底部的后9片葉中其表達(dá)量幾乎消失，這一現(xiàn)象可能與植物衰老有關(guān)[53]。Rubisco(核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶)和葉綠體GS2的大小亞基顯示出類似蛋白質(zhì)數(shù)量上的減少，因?yàn)殡S著葉片的成熟須要合成更多的谷氨酰胺，而嫩葉須要生長(zhǎng)，因此須要谷氨酸用于其他氨基酸的合成。相反，細(xì)胞質(zhì)GS1和NADH-GDH隨著葉片衰老而增加。目前已經(jīng)在葡萄樹的葉中證明了Fd-GOGAT的酶活有類似的變化[54]。

對(duì)于NADH-GOGAT基因的調(diào)控，當(dāng)水稻幼苗從氮饑餓狀態(tài)轉(zhuǎn)到供應(yīng)1 mmol/L銨態(tài)氮中，根中NADH-GOGAT蛋白質(zhì)和酶活水平在1 d內(nèi)增加了10倍以上[46]。在水稻細(xì)胞培養(yǎng)基或根中施以低至50 μmol/L銨態(tài)氮后，在12 h內(nèi)也可檢測(cè)到NADH-GOGATmRNA水平的增加[48]，并且推測(cè)谷氨酰胺可能作為其轉(zhuǎn)錄水平增加的信號(hào)。然而，大田軟海綿酸是蛋白絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶的有效抑制劑，并且能誘導(dǎo)水稻細(xì)胞培養(yǎng)基中NADH-GOGAT的積累。因此，調(diào)控NADH-GOGAT基因表達(dá)信號(hào)的傳遞機(jī)制仍是爭(zhēng)議的話題[55]。進(jìn)一步研究表明，光照或各種氮素處理下的大豆子葉或下胚軸/莖中NADH-GOGAT酶活幾乎沒有影響。然而，在向氮饑餓的幼苗中加入適宜的銨態(tài)氮后，根中的酶活增加了近14倍。施加適量的氮源后也檢測(cè)到NADH-GOGATmRNA和蛋白質(zhì)水平的小幅增加[49]。

4.2 Fd-GOGAT基因表達(dá)量的改變對(duì)氮代謝途徑的影響

外界氮素的變化往往會(huì)對(duì)植物的基因表達(dá)產(chǎn)生難以預(yù)料的影響，進(jìn)而干擾結(jié)論的準(zhǔn)確性；因此，要確定GOGAT基因調(diào)控氮代謝，最直接的辦法是在適合的氮素條件下提高和降低該基因的表達(dá)，觀察相關(guān)產(chǎn)物和底物變化，同時(shí)檢測(cè)其他相關(guān)基因的表達(dá)情況，從而分析GOGAT基因及其相關(guān)基因表達(dá)的相互關(guān)系。

4.2.1 過表達(dá)Fd-GOGAT基因 對(duì)于Fd-GOGAT基因的過表達(dá)，目前僅限于模式植物擬南芥中。Ishizaki等研究了擬南芥過表達(dá)Fd-GOGAT(GLU1)，在控制CO2濃度、光照度和NO3-濃度條件下改變NH4+的攝入量，導(dǎo)致谷氨酸過量生成，進(jìn)一步研究表明總氨基酸庫也發(fā)生變化[56]。在光呼吸條件下供應(yīng)充足的NH4+時(shí)天冬氨酸含量增加，谷氨酰胺和甘氨酸含量減少，但這種改變并不顯著；在非光呼吸條件下，谷氨酸和其他氨基酸含量增加。結(jié)果表明，合成的谷氨酸被迅速轉(zhuǎn)化成其他氨基酸，特別是天冬氨酸。

4.2.2 抑制表達(dá)Fd-GOGAT基因 對(duì)于Fd-GOGAT基因抑制表達(dá)的研究主要集中在近幾年，2010年，Kissen等通過全基因組微陣列方法分析敲除Fd-GOGAT1(GLU1；At5g04140)的擬南芥glu1-2突變體葉和根中表達(dá)譜的研究[57]。結(jié)果表明，glu1-2突變體的表達(dá)譜顯示在葉片中超過5 500個(gè)基因的表達(dá)發(fā)生變化，在根中近700個(gè)基因受顯著影響。參與谷氨酸生物合成與轉(zhuǎn)化的基因都發(fā)生變化，通過核磁共振(NMR)代謝組學(xué)分析表明氨基酸組成發(fā)生變化。在glu1-2突變體中谷氨酰胺水平升高且最為顯著。對(duì)敲除Fd-GOGAT1/GLU1的突變體進(jìn)行相關(guān)基因表達(dá)分析表明，其中受影響的有光合作用、光呼吸和葉綠素合成途徑，結(jié)果顯示在glu1-2葉中Fd-GOGAT1水平全面下調(diào)并且其表型一致呈輕微萎黃。glu1-2表達(dá)譜揭示的另一方面是受多重應(yīng)激反應(yīng)，包括冷、熱、干旱和氧化應(yīng)激，參與類黃酮生物合成基因的表達(dá)量也發(fā)生變化?；蚓幋a大多數(shù)應(yīng)激相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞色素P450單加氧酶、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶和UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶在glu1-2突變體得到表達(dá)并受影響。這些結(jié)果表明Fd-GOGAT1的重要性，還間接證明在植物生長(zhǎng)發(fā)育過程中谷氨酸起核心作用。2016年，Yang等報(bào)道編碼水稻Fd-GOGAT的ABC1(ABNORMAL CYTOKININ RESPONSE 1，細(xì)胞分裂素反應(yīng)異常1)基因的功能特性[58]。突變等位基因的abc1-1突變體具有典型的缺氮綜合癥，而T-DNA插入的abc1-2突變體幼苗是致死型。代謝組學(xué)分析顯示在abc1-1突變體中高氮碳比(谷氨酰胺和天冬酰胺)的氨基酸和TCA循環(huán)中幾種中間產(chǎn)物過度積累，表明ABC1在氮同化和碳氮平衡中起關(guān)鍵作用。在ABC1編碼區(qū)中鑒定了5個(gè)非同義單核苷酸的多態(tài)性，并被定義為3種不同的單倍型，其在粳稻和秈稻亞種之間有較高的、特異性的分化。結(jié)果表明ABC1/OsFd-GOGAT調(diào)節(jié)氮同化和碳氮平衡對(duì)植物生長(zhǎng)和發(fā)育至關(guān)重要。2017年，Zeng等分離出名為gogat1的水稻早熟葉的衰老突變體，其在葉中GOGAT總酶活性降低67%[59]。gogat1突變體在自然條件下表現(xiàn)出萎黃病，而在低光照條件下，葉片衰老程度較緩慢。gogat1突變體表現(xiàn)出結(jié)實(shí)率的降低，而gogat1突變體的籽粒蛋白質(zhì)含量(GPC)顯著高于野生型。同時(shí)，在灌漿期，上數(shù)3片葉和頂部節(jié)間的總氨基酸含量大幅增加。結(jié)果表明，OsFd-GOGAT可能參與葉片衰老過程中氮的再動(dòng)員，并為提高水稻氮素利用效率提供潛在的途徑。

4.3NADH-GOGAT基因表達(dá)量的改變對(duì)氮代謝途徑的影響

4.3.1 過表達(dá)NADH-GOGAT基因 關(guān)于植物GOGAT基因過表達(dá)的研究較少，特別是NADH-GOGAT基因的過表達(dá)，研究者認(rèn)為導(dǎo)致此結(jié)果的原因可能是NADH-GOGAT基因較長(zhǎng)，在大部分植物中約6～7 kb，不利于轉(zhuǎn)基因。目前對(duì)于NADH-GOGAT基因過表達(dá)的研究，僅在煙草和水稻的文獻(xiàn)中有報(bào)道。2001年，Chichkova等以CaMV35S作為啟動(dòng)子，將苜蓿NADH-GOGAT基因轉(zhuǎn)化到煙草中，得到3個(gè)轉(zhuǎn)化子(GOS10、GOS13和GOS19)[60]。分子檢測(cè)表明，NADH-GOGAT在GOS轉(zhuǎn)基因株系的葉和根中低水平表達(dá)，但在宿主煙草該基因的表達(dá)幾乎檢測(cè)不到。GOS轉(zhuǎn)基因株系根中NADH-GOGAT酶活較對(duì)照植株有所提高(約15%～40%)。在溫室生長(zhǎng)的GOS轉(zhuǎn)基因植株與對(duì)照植株相比，以NO3-或NH4+作為唯一氮源時(shí)植株進(jìn)入開花期，表現(xiàn)出地上部干質(zhì)量和總碳氮含量均有所增加。因此推測(cè)，通過轉(zhuǎn)基因增強(qiáng)NADH-GOGAT酶活，能使GOS轉(zhuǎn)基因煙草具有較高同化氮的能力。2002年，Yamaya等采用免疫學(xué)方法分析表明[61]，水稻衰老器官再動(dòng)員產(chǎn)生的谷氨酰胺，經(jīng)由韌皮部運(yùn)輸至正在生長(zhǎng)發(fā)育的器官中進(jìn)行重新利用，NADH-GOGAT參與了這一過程。在水稻中過表達(dá)NADH-GOGAT，可使其粒重有所增加(最多為80%)，表明在水稻中NADH-GOGAT是提高氮素利用率和籽粒灌漿的關(guān)鍵酶。

4.3.2 抑制表達(dá)NADH-GOGAT基因 對(duì)NADH-GOGAT基因的抑制表達(dá)，目前在苜蓿、擬南芥和水稻等模式植物中有相關(guān)報(bào)道。2000年，Schoenbeck等利用AAT-2(天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶，根瘤中表達(dá)增強(qiáng))啟動(dòng)子調(diào)控的反義NADH-GOGAT轉(zhuǎn)基因苜蓿[62]。其中1個(gè)轉(zhuǎn)基因株系NADH-GOGAT酶活降低約50%，相應(yīng)的蛋白質(zhì)和mRNA含量也有所降低。但該株系的細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)GS、Fd-GOGAT、AAT-2、AS(天冬氨酸合成酶)和PEPC(磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶)的轉(zhuǎn)錄豐度以及GS、AAT和PEPC酶活均不受影響。在根瘤共生條件下轉(zhuǎn)反義NADH-GOGAT植株，即使共生固氮沒有顯著減少，也表現(xiàn)出適度的萎黃、生長(zhǎng)遲緩以及含氮量降低等現(xiàn)象。但當(dāng)供應(yīng)適量的NO3-時(shí)緩解了萎黃現(xiàn)象，恢復(fù)增長(zhǎng)以及含氮量。另外，轉(zhuǎn)反義NADH-GOGAT植株雄性不育。這些數(shù)據(jù)表明，NADH-GOGAT在共生固氮的同化和花的發(fā)育過程中起關(guān)鍵作用。

2002年，Lancien等在擬南芥NADH-GOGAT(glt1-T)敲除突變體中發(fā)發(fā)現(xiàn)，NADH-GOGATGLT1 mRNA在根中的表達(dá)水平明顯高于葉中[63]。該表達(dá)模式與主要編碼Fd-GOGATGLU1基因形成對(duì)比，GLU1在葉中表達(dá)最高并參與光呼吸。對(duì)不同器官特異性的表達(dá)模式表明NADH-GOGAT和Fd-GOGAT基因產(chǎn)物的生理作用是非冗余的。代謝分析表明當(dāng)抑制光呼吸(1% CO2)時(shí)，同野生型相比，glt1-T 突變體在生長(zhǎng)和谷氨酸生物合成中有特定的缺陷，即在這些條件下，glt1-T突變體的生長(zhǎng)量下降約20%，谷氨酸含量也驟減70%。2014年，Konishi等探究NADH-GOGAT在擬南芥根中氮同化的作用[64]。對(duì)擬南芥供應(yīng)銨態(tài)氮后，RT-PCR 和Western雜交分析表明在根中檢測(cè)到NADH-GOGAT的積累。GUS染色和免疫組織學(xué)分析表明NADH-GOGAT高度累積在非綠色組織的維管束、頂端分生組織、花粉、柱頭和根中。通過NADH-GOGAT插入T-DNA的突變體研究表明，與正常CO2條件下相比，其谷氨酸的合成和其株系的生物量積累均顯著降低，因此推測(cè)NADH-GOGAT在擬南芥根的氮同化過程中具有重要作用。

水稻主要生長(zhǎng)在厭氧環(huán)境中，NH4+是其優(yōu)先選擇的無機(jī)氮素。NH4+的同化是通過GS和GOGAT發(fā)生的耦聯(lián)反應(yīng)進(jìn)行的。在水稻中，已經(jīng)鑒定了4個(gè)編碼GOGAT的基因，分別為Fd-GOGAT1、Fd-GOGAT2、NADH-GOGAT1和NADH-GOGAT2。OsNADH-GOGAT1主要在根尖、發(fā)育葉片和谷粒中表達(dá)，OsNADH-GOGAT2主要在完全展開的葉片和葉鞘中表達(dá)。2010年，Tamura等通過反向遺傳學(xué)方法分離出敲除缺失NADH-GOGAT1基因的突變體，研究表明，這種同工酶對(duì)幼苗期根中NH4+的同化起著重要作用[65]。2011年，Tamura等對(duì)缺失OsNADH-GOGAT2突變體進(jìn)行研究[66]。田間試驗(yàn)表明，NADH-GOGAT1對(duì)有效分蘗數(shù)的增長(zhǎng)也起到非常重要的作用。NADH-GOGAT2和Fd-GOGAT在突變體中的表達(dá)與野生型是相同的，這表明其他GOGAT是無法彌補(bǔ)缺少NADH-GOGAT1的功能。Lu等用全基因組微陣列數(shù)據(jù)庫分析水稻GOGAT基因的轉(zhuǎn)錄模式，探究GOGAT基因?qū)λ綠OGAT共抑制植株碳氮代謝的影響[67]。表達(dá)譜表明，水稻GOGAT基因家族成員在不同組織和器官中表達(dá)不同，說明它們?cè)谒倔w內(nèi)扮演不同的角色。與野生型相比，GOGAT共抑制植株的分蘗數(shù)、地上部干質(zhì)量和產(chǎn)量明顯降低。生理和生化研究表明，在GOGAT共抑制植株葉片中硝酸鹽、多種游離氨基酸、葉綠素、糖、磷酸糖和吡啶核苷酸的含量明顯降低，但葉片中游離NH4+、α-酮戊二酸、異檸檬酸的含量有所增加。因此GOGAT在碳氮代謝中發(fā)揮著重要作用，并且在水稻氮同化過程中是必不可少的。

2014年，Yamaya等通過反向遺傳學(xué)方法分析水稻中3種細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)GS (GS1；1、GS1；2和GS1；3)和2種NADH-GOGAT(NADH-GOGAT1和NADH-GOGAT2)同工酶的功能[68]。OsGS1；2和OsNADH-GOGAT1主要在水稻根表層細(xì)胞中表達(dá)并受NH4+影響。插入內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子Tos17破壞OsGS1；2或OsNADH-GOGAT1基因，導(dǎo)致有效分蘗數(shù)的減少從而降低稻穗數(shù)。在敲除突變體中重新轉(zhuǎn)入自身啟動(dòng)子調(diào)控下的OsGS1；2基因，可使稻穗數(shù)成功恢復(fù)到野生型水平。研究結(jié)果表明，水稻根系NH4+同化過程中GS1；2和NADH-GOGAT1起主要作用。OsGS1；1和OsNADH-GOGAT2主要在成熟葉片維管組織中表達(dá)。在OsGS1；1突變體中稻穗的增長(zhǎng)率和灌漿率急劇下降，而在缺失OsNADH-GOGAT2突變體中每穗粒數(shù)則明顯減少。當(dāng)OsGS1；1基因重新轉(zhuǎn)入到OsGS1；1突變體后表型可恢復(fù)到近似野生型水平。因此，這2種NADH-GOGAT酶可能在自然衰老期間對(duì)氮素再動(dòng)員起重要作用，這些同工酶彼此之間不能彌補(bǔ)其缺失的功能。2014年，Pérez-Tienda等用AM真菌(Rhizophagusirregularis)侵染水稻，獲得轉(zhuǎn)基因株系并在2種氮素處理?xiàng)l件下檢測(cè)其菌根中AMTs、GS和GOGAT基因表達(dá)情況。結(jié)果表明，AM共生系統(tǒng)在低氮條件下OsAMT1；1和OsAMT1；3下調(diào)表達(dá)，在高氮條件上調(diào)表達(dá)。無論是高氮還是低氮條件OsAMT3；1都有較強(qiáng)的上調(diào)表達(dá)。因此推測(cè)，在水稻根中OsAMT3；1可能參與了菌根氮吸收途徑，OsGOGAT2在AM誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白OsAMT3；1供應(yīng)NH4+的過程中起重要同化作用[50]。

5 展望

迄今為止，關(guān)于植物GOGAT基因的研究及其在植物氮代謝調(diào)控中的應(yīng)用已經(jīng)取得了一定進(jìn)展，主要集中在模式植物和作物，但對(duì)木本植物的研究則較少。楊樹是多年生落葉木本植物的代表植物，基因組背景清晰，包括轉(zhuǎn)基因在內(nèi)的相關(guān)分子生物學(xué)研究手段已經(jīng)成熟；同時(shí)，楊樹易于無性繁殖，可在短期內(nèi)獲得大量具有同一遺傳背景的無性系材料，并對(duì)外界氮素條件的變化具有非常好的適應(yīng)性，這是其他模式植物無法比擬的優(yōu)勢(shì)。但對(duì)于楊樹，氨的吸收與同化機(jī)制的研究卻鮮有報(bào)道。筆者所在課題組以楊樹為試材，在研究GOGAT基因的同時(shí)對(duì)氨吸收及同化過程中相關(guān)基因表達(dá)的協(xié)調(diào)性進(jìn)行分析，其結(jié)果在豐富植物氨吸收與利用相關(guān)理論的同時(shí)，也將揭示木本植物中氨吸收與利用的特有機(jī)制，為利用基因工程等手段提高木本植物的氮素利用率奠定有利的理論基礎(chǔ)。

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