李志剛LI Zhi-gang 光翠娥, -, 干建平 -

(1. 江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122；2. 黃岡師范學(xué)院經(jīng)濟(jì)林木種質(zhì)改良與資源綜合利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室&大別山特色資源開(kāi)發(fā)湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北 黃岡 438000)

苯丙酮尿癥(phenylketonuria，PKU)是一種由苯丙氨酸(phenylalanine，Phe)代謝過(guò)程中的輔酶四氫生物蝶呤(tetrahydrobiopterin，BH4)缺乏或苯丙氨酸羥化酶(phenylalanine hydroxylase，PAH)活性喪失或合成不足，導(dǎo)致Phe無(wú)法被正常代謝[1]的常見(jiàn)隱性遺傳氨基酸代謝癥?，F(xiàn)階段推薦通過(guò)飲食管理達(dá)到治療的目的，即控制患者每日飲食攝入的Phe[2-3]。在采取普通嚴(yán)格低蛋白飲食時(shí)，患者可能會(huì)出現(xiàn)如不飽和脂肪酸、維生素及礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)素缺乏癥[4-6]，因此推薦食用低苯丙氨酸特殊醫(yī)學(xué)配方食品補(bǔ)充患者每日所需蛋白質(zhì)、維生素及礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)素。目前，此類特膳食品主要為低/無(wú)苯丙氨酸游離氨基酸配方食品[7-8]。但此類特膳食品適口性差，存在由于攝入過(guò)多游離氨基酸而致腹瀉的風(fēng)險(xiǎn)[8]。通過(guò)蛋白酶水解天然蛋白，分離Phe后所得低苯丙氨酸肽混合物可用于為PKU患者制備特殊醫(yī)學(xué)配方食品[9]。

目前，制備低苯丙氨酸肽混合物的原料主要以乳清蛋白[10-12]和酪蛋白[7,13]等動(dòng)物性蛋白為主，而對(duì)植物蛋白的開(kāi)發(fā)利用主要以不含過(guò)敏源的玉米蛋白[14]、小麥蛋白[15]及大米蛋白[16]為原料。由于花生蛋白含有大分子過(guò)敏性蛋白[9]限制了對(duì)其的開(kāi)發(fā)利用，針對(duì)這一現(xiàn)狀，本研究通過(guò)多酶分步深度降解花生蛋白，再利用活性炭吸附分離Phe制備不含過(guò)敏性蛋白的低苯丙氨酸肽混合物，一方面為花生蛋白的應(yīng)用提供新方向，另一方面為將來(lái)制備適合PKU患者食用的特殊醫(yī)學(xué)配方食品提供更多的原料選擇。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

花生蛋白：粗蛋白含量73.69%，陜西森弗天然制品有限公司；

Alcalase2.4L：食品級(jí)，19 8761 U/mL，諾維信(中國(guó))投資有限公司；

Flavourzyme：食品級(jí)，38 810 U/mL，諾維信(中國(guó))投資有限公司；

木瓜蛋白酶：食品級(jí)，169 704 U/g，廣西龐博生物工程有限公司；

三氯乙酸、氫氧化鈉、濃鹽酸、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉等：分析純，上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

粉末活性炭：食品級(jí)，200目，椰殼制，江蘇森森碳業(yè)有限公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

電子天平：EL204型，PL20002型，梅特勒-托利多國(guó)際貿(mào)易(上海)有限公司；

pH計(jì)：FE-20型，梅特勒-托利多國(guó)際貿(mào)易(上海)有限公司；

紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)：UV-1600型，上海美普達(dá)儀器有限公司；

電熱恒溫水槽：DK-8D型，上海精宏實(shí)業(yè)有限公司；

氨基酸專用高效液相色譜儀：Agilent1100型，美國(guó)安捷倫科技有限公司；

高效液相色譜儀：Waters600型，美國(guó)沃特世有限公司。

1.2 方法

1.2.1 游離Phe含量測(cè)定及氨基酸組成分析 采用OPA柱前衍生高效液相色譜—紫外檢測(cè)法。

(1) 色譜條件：色譜柱：Agilent Hypersil ODS柱(5 μm，4.0 mm×250 mm)；梯度洗脫程序：0 min，8%；17 min，50% B；24.0 min，0% B；流動(dòng)相A(pH=7.2)：27.6 mmol/L醋酸鈉—三乙胺—四氫呋喃(體積比為500∶0.11∶2.5)；流動(dòng)相B(pH=7.2)：80.9 mmol/L醋酸鈉—甲醇—乙腈(體積比為1∶2∶2)；流動(dòng)相流速1.0 mL/min；柱溫：40 ℃；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)：330 nm，脯氨酸于263 nm處檢測(cè)。

(2) 游離Phe含量測(cè)定樣品處理：取一定量酶水解樣品，用10 g/100 g三氯乙酸等體積稀釋，靜置1 h，經(jīng)雙層濾紙過(guò)濾后取1 mL濾液于離心管內(nèi)，15 000 r/min離心20 min，取400 μL上清液于液相小瓶,待測(cè)。

(3) 氨基酸組成分析樣品處理：取1 mL樣品于水解管內(nèi)，依次添加12 mol/L HCl 1 mL和6 mol/L HCl 6 mL，充氮封管，置于120 ℃鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)水解22 h。水解完成后冷卻至室溫，添加10 mol/L NaOH 4.8 mL中和鹽酸，轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶?jī)?nèi)用去離子水定容，0.45 μm水系微濾膜過(guò)濾，取1 mL濾液于離心管內(nèi)，于15 000 r/min離心10 min，取400 μL 上清液于液相小瓶，待測(cè)。

1.2.2 Flavourzyme水解花生蛋白釋放游離Phe單因素試驗(yàn)

配制4 g/100 g花生蛋白溶液，于90 ℃熱處理20 min。熱處理完成后冷卻至60 ℃，調(diào)節(jié)溶液pH至8.0，添加35 μL/g Alcalase2.4L水解110 min。水解完成后沸水浴滅酶10 min，冷卻至50 ℃，調(diào)節(jié)pH至7.0，添加5 000 U/g 木瓜蛋白酶水解3 h。水解完成后沸水浴滅酶，冷卻至室溫后6 000 r/min離心10 min，取上清液用于Flavourzyme再水解。

(1) 溫度對(duì)Flavourzyme水解花生蛋白釋放游離Phe的影響：取等量水解液5份分別預(yù)熱至40，45，50，55，60 ℃，調(diào)節(jié)pH至7.0，均添加2 500 U/g Flavourzyme水解2.0 h。水解完成后沸水浴滅酶10 min，待冷卻至室溫后測(cè)定游離Phe含量。

(2) pH對(duì)Flavourzyme水解花生蛋白釋放游離Phe的影響：取等量水解液5份預(yù)熱至50 ℃，調(diào)節(jié)pH至5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，添加2 500 U/g Flavourzyme水解2.0 h。水解完成后沸水浴滅酶10 min，待冷卻至室溫后測(cè)定游離Phe含量。

(3) 酶濃度對(duì)Flavourzyme水解花生蛋白釋放游離Phe的影響：取等量水解液6份預(yù)熱至50 ℃，調(diào)節(jié)pH至6.5，分別添加1 500，2 000，2 500，3 000，3 500，4 000 U/g Flavourzyme水解2.0 h。水解完成后沸水浴滅酶10 min，待冷卻至室溫后測(cè)定游離Phe含量。

(4) 水解時(shí)間對(duì)Flavourzyme水解花生蛋白釋放游離Phe的影響：取等量水解液6份，調(diào)節(jié)pH至6.5，均添加3 000 U/g Flavourzyme，分別水解1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0 h。水解完成后沸水浴滅酶10 min，待冷卻至室溫后測(cè)定游離Phe含量。

1.2.3 Flavourzyme水解正交試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，固定水解時(shí)間為5 h，選擇溫度、pH及酶濃度為正交試驗(yàn)因子，以水解所得游離Phe為指標(biāo)，設(shè)計(jì)三因素三水平正交試驗(yàn)。

1.2.4 活性炭吸附分離Phe 活性炭是一種有極大比表面的多孔疏水性極性吸附劑，能夠特異性地吸附芳香族氨基酸。Phe在260 nm處有最強(qiáng)紫外吸收峰[17-18]，而非芳香族氨基酸在210～220 nm處有紫外吸收峰，因此，以吸附前后OD260的變化計(jì)算去除率，以O(shè)D220/OD260衡量活性炭吸附效果[19]。

(1) pH對(duì)吸附效果的影響：取水解液5份預(yù)熱至35 ℃，分別調(diào)節(jié)pH至2.0，2.5，3.0，3.5，4.0，4.5，均添加5 g/100 g粉末活性炭，靜態(tài)吸附2.0 h。吸附完成后過(guò)濾，濾液稀釋10，20倍后分別測(cè)定OD260、OD220，計(jì)算去除率及OD220/OD260。

(2) 溫度對(duì)吸附效果的影響：取水解液5份分別預(yù)熱至25，30，35，40，45 ℃，均調(diào)整pH至3.5，添加5 g/100 g粉末活性炭，靜態(tài)吸附2.0 h。吸附完成后過(guò)濾，濾液稀釋10，20倍后分別測(cè)定OD260、OD220，計(jì)算去除率及OD220/OD260。

(3) 活性炭用量對(duì)吸附效果的影響：取水解液4份預(yù)熱至35 ℃，調(diào)整pH至3.5，分別添加3，5，7，9 g/100 g粉末活性炭，靜態(tài)吸附2.0 h。吸附完成后過(guò)濾，濾液稀釋10，20倍后分別測(cè)定OD260、OD220，計(jì)算去除率及OD220/OD260。

(4) 時(shí)間對(duì)吸附效果的影響：取水解液5份預(yù)熱至35 ℃，均調(diào)整pH至3.5，添加7 g/100 g粉末活性炭，分別靜態(tài)吸附0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 h。吸附完成后過(guò)濾，濾液稀釋10，20倍后分別測(cè)定OD260、OD220，計(jì)算去除率及OD220/OD260。

1.2.5 活性炭吸附正交試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，固定吸附時(shí)間為2.5 h，選擇OD220/OD260為指標(biāo)，以溫度、pH及活性炭用量為正交試驗(yàn)因子，設(shè)計(jì)三因素三水平正交試驗(yàn)。

1.2.6 分子量分布分析

(1) 色譜條件：色譜柱：TSK gel 2000 SWXL (7.8 mm×300 mm)；紫外檢測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng)：330 nm；流動(dòng)相：乙腈—水—三氟乙酸(體積比為40∶60∶0.05)；流速：0.5 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；混合標(biāo)準(zhǔn)品：細(xì)胞色素C(MW12500)、桿菌酶(MW1450)、乙氨酸—酪氨酸—精氨酸(MW451)、乙氨酸—乙氨酸—乙氨酸(MW189)。

(2) 樣品處理：樣品經(jīng)0.45 μm水系微濾膜過(guò)濾。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理 試驗(yàn)重復(fù)3次，采用Origin 9.0及SPSS 20進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 Flavourzyme水解花生蛋白釋放游離Phe

2.1.1 溫度對(duì)Flavourzyme水解花生蛋白釋放游離Phe的影響 溫度對(duì)蛋白酶的水解反應(yīng)有兩方面的影響：① 通過(guò)影響分子熱運(yùn)動(dòng)而影響水解速率；② 影響蛋白酶的活性[20]202。由圖1可知，隨溫度的上升，分子熱運(yùn)動(dòng)加強(qiáng)，水解速率增快，游離Phe含量隨之上升。當(dāng)溫度升至50 ℃時(shí)，所得游離Phe含量達(dá)到了最高。當(dāng)溫度超過(guò)50 ℃后，游離Phe含量下降，可能是高溫致使蛋白酶變性導(dǎo)致活性下降。因此，F(xiàn)lavourzyme水解花生蛋白釋放游離Phe的最適溫度在50 ℃左右。

2.1.2 pH對(duì)Flavourzyme水解花生蛋白釋放游離Phe的影響 pH通過(guò)影響蛋白酶氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)的解離狀態(tài)，改變空間構(gòu)型，從而對(duì)酶的活性造成影響[20]202-203。由圖2可知，在選定的pH下，隨著pH的上升，水解活性增強(qiáng)，游離Phe含量也隨之上升。當(dāng)pH升至6.5時(shí)游離Phe含量達(dá)到了最高，繼續(xù)升高pH，其含量隨之下降，可能是過(guò)高的pH導(dǎo)致酶的空間構(gòu)型發(fā)生變化，活性下降。因此，F(xiàn)lavourzyme水解花生蛋白釋放游離Phe的最適pH在6.5左右。

圖1 水解溫度對(duì)游離Phe含量的影響

圖2 水解pH對(duì)游離Phe含量的影響

2.1.3 酶濃度對(duì)Flavourzyme水解花生蛋白釋放游離Phe的影響 蛋白酶催化水解反應(yīng)時(shí)，當(dāng)?shù)孜餄舛纫欢〞r(shí)，酶濃度的上升能加速水解過(guò)程[20]205。由圖3可知，隨著酶濃度的上升，游離Phe含量隨之上升。當(dāng)濃度升至3 000 U/g時(shí)，游離Phe含量增幅減緩，因此選擇3 000 U/g為Flavourzyme水解花生蛋白釋放游離Phe的最適酶濃度。

圖3 酶濃度對(duì)游離Phe的影響

圖4 水解時(shí)間對(duì)游離Phe含量的影響

2.1.4 水解時(shí)間對(duì)Flavourzyme水解花生蛋白釋放游離Phe的影響 當(dāng)其他水解條件一定時(shí)，水解時(shí)間同產(chǎn)物成正比[20]209-210。由圖4可知，隨著水解時(shí)間的增加，游離Phe含量隨之上升，但水解5 h后所得游離Phe趨于穩(wěn)定。這是由于蛋白酶的水解作用具有位點(diǎn)特異性，隨著水解程度的加深，可供酶水解的位點(diǎn)逐漸減少，水解產(chǎn)物趨于平衡[21]。因此水解時(shí)間為5 h為宜，后續(xù)試驗(yàn)固定水解時(shí)間為5 h。

2.2 Flavourzyme水解正交試驗(yàn)

正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表1、2。

表1 水解正交試驗(yàn)因素水平表

表2 水解正交試驗(yàn)結(jié)果

由表2可知，影響Flavourzyme水解花生蛋白釋放游離Phe的因素主次為RB>RA>RC，最佳水解工藝為50 ℃，酶濃度3 500 U/g，pH 6.5，水解5 h。經(jīng)次重復(fù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，在此工藝條件下水解所得游離Phe可達(dá)28.65 mg/100 mL。

2.3 活性炭分離Phe

2.3.1 溫度對(duì)吸附效果的影響 由圖5可知，溫度的上升有利于Phe的吸附。超過(guò)35 ℃時(shí)，Phe去除率下降，活性炭對(duì)其他氨基酸的吸附增加導(dǎo)致吸收示差下降。因此，活性炭吸附Phe的合適溫度在35 ℃左右。

2.3.2 pH對(duì)吸附效果的影響 pH一方面影響氨基酸在體系中的存在形式，另一方面通過(guò)影響活性炭分子表面的帶電情況而改變吸附能力[22-23]。由圖6可知，pH的上升有利于Phe的去除，pH超過(guò)3.0時(shí)，活性炭對(duì)Phe的吸附能力下降，對(duì)其他氨基酸的吸附能力增加導(dǎo)致吸收示差下降。因此，活性炭吸附去除Phe的最適pH在3.0左右。

圖5 吸附溫度對(duì)OD220/OD260及Phe吸附率的影響

Figure 5 Effect of adsorption temperature on the value ofOD220/OD260and the removal rate of Phe

圖6 吸附pH對(duì)OD220/OD260及Phe去除率的影響

圖7 活性炭添加量對(duì)OD220/OD260及Phe去除率的影響

Figure 7 Effect of the content of activated carbon on the value ofOD220/OD260and the removal rate of Phe

2.3.3 活性炭用量對(duì)吸附效果的影響 由圖7可知，隨著活性炭用量的增加Phe去除率及吸收示差均出現(xiàn)上升現(xiàn)象。當(dāng)添加量增至7 g/100 g時(shí)，Phe去除率趨于平緩，繼續(xù)增加用量對(duì)Phe去除率的貢獻(xiàn)有限，吸收示差的下降說(shuō)明活性炭對(duì)其他氨基酸的吸附逐漸增強(qiáng)。因此，活性炭適宜添加量在7 g/100 g 左右。

2.3.4 吸附時(shí)間對(duì)吸附效果的影響 在活性炭吸附過(guò)程中，其不僅特異性地吸附Phe，對(duì)非芳香族氨基酸也有一定的吸附能力[22-23]。由圖8可知，吸附時(shí)間的延長(zhǎng)有利于Phe的去除，但長(zhǎng)時(shí)間的吸附會(huì)導(dǎo)致其他氨基酸大量損失，從而導(dǎo)致吸收示差大幅下降。因此，活性炭吸附Phe的時(shí)間應(yīng)在2.5 h 左右為宜，后續(xù)正交試驗(yàn)固定水解時(shí)間為2.5 h。

圖8 吸附時(shí)間對(duì)OD220/OD260及Phe去除率的影響

2.4 活性炭吸附正交試驗(yàn)

吸附正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表3、4。

表3 吸附正交試驗(yàn)因素水平表

表4 吸附正交試驗(yàn)結(jié)果

由表4可知，影響活性炭吸附效果的主次因素為RB>RA>RC，最佳工藝為吸附溫度35 ℃，pH 3.0，活性炭用量7 g/100 g。經(jīng)3次平行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，在此工藝條件下吸附2.5 h，OD220/OD260可達(dá)49.95，Phe去除率達(dá)到98.64%。

2.5 氨基酸組成分析

圖9 低苯丙氨酸肽混合物氨基酸圖譜

表5 低苯丙氨酸肽混合物氨基酸組成?

? “-”表示未檢測(cè)。

花生蛋白經(jīng)蛋白酶水解及活性炭吸附處理后，所得產(chǎn)物氨基酸組成見(jiàn)表5，氨基酸圖譜見(jiàn)圖9。由表5可知，經(jīng)活性炭吸附后Phe僅占17種總氨基酸含量的0.09%，符合GB 29922—2013中關(guān)于PKU患者專用特膳食品中Phe含量不得高于1.5 mg/g蛋白等同物的要求，因此，通過(guò)本工藝獲得的低苯丙氨酸肽混合物適合將來(lái)為PKU患者制備特膳食品。

2.6 分子量分布分析

花生蛋白雖然是一種具有較高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的植物蛋白，但由于含有分子量在10～70 kDa的過(guò)敏性蛋白[24]，限制了其在食品行業(yè)的應(yīng)用。由圖10可知，經(jīng)蛋白酶水解及活性炭吸附，產(chǎn)物分子量主要為600 Da以下的低聚肽和游離氨基酸，過(guò)敏性蛋白被去除。人體對(duì)蛋白質(zhì)的吸收主要以低聚肽的形式為主[25]，因此，通過(guò)本工藝獲得的低苯丙氨酸肽混合物是一種不含過(guò)敏蛋白的可用于制備低苯丙氨酸特殊醫(yī)學(xué)配方食品的原料。

圖10 低苯丙氨酸肽混合物分子量分布圖譜

3 結(jié)論

通過(guò)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)lavourzyme水解花生蛋白釋放游離Phe的最佳工藝條件為：溫度50 ℃，pH 6.5，酶添加量為3 500 U/g，水解5 h，在此工藝條件下游離Phe含量可達(dá)28.65 mg/100 mL。所得水解液添加7 g/100 g活性炭，于35 ℃，pH 3.0，吸附2.5 h，Phe去除率可達(dá)98.64%，OD220/OD260達(dá)到49.95。所得產(chǎn)物中Phe僅占總氨基酸的0.09%，且主要為600 Da以下的低聚肽及游離氨基酸，不含過(guò)敏性蛋白，完全滿足GB 29922—2013中，關(guān)于PKU患者特膳食品中Phe限量(≤0.15 mg/g蛋白質(zhì)等同物)的要求，適合將來(lái)為此類患者制備不同品類的特膳食品。

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