夏焱春，曹 錚，藺凌云，潘曉藝，姚嘉赟，劉憶瀚，尹文林，沈錦玉

（浙江省淡水水產(chǎn)研究所，浙江省魚類營(yíng)養(yǎng)與健康重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江湖州 313001）

大 口 黑 鱸（Largemouth bass，Micropterus salmoides），俗稱加州鱸，屬?gòu)V溫性魚類，原產(chǎn)北美洲密西西比河流域。1983年引入廣東省，現(xiàn)主要分布在廣東、江蘇、浙江、江西、四川和福建等省份。因其生長(zhǎng)快、病害少、耐低溫、肉質(zhì)鮮美且易捕撈，大口黑鱸已成為我國(guó)重要的淡水養(yǎng)殖品種，近年來(lái)產(chǎn)量逐年上升，2016年產(chǎn)量達(dá)37.4萬(wàn)噸，同比增長(zhǎng)5.94%[1-2]。近年來(lái)，由于養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴(kuò)大，養(yǎng)殖密度大幅提升，大口黑鱸生長(zhǎng)過(guò)程中出現(xiàn)的病害情況日趨嚴(yán)重，給養(yǎng)殖戶帶來(lái)重大經(jīng)濟(jì)損失。因病害頻發(fā)，藥物濫用現(xiàn)象越來(lái)越普遍，導(dǎo)致大口黑鱸的質(zhì)量安全得不到保障，嚴(yán)重影響其養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。本文將大口黑鱸的病害總體分為細(xì)菌性疾病、病毒性疾病和寄生蟲病，描述了疫病的病原特征、發(fā)病時(shí)間和主要癥狀，并總結(jié)歸納了國(guó)內(nèi)外大口黑鱸免疫相關(guān)因子、疫苗研究和防控方法研究的最新進(jìn)展。

1 細(xì)菌性疾病

1.1 柱狀黃桿菌

柱 狀 黃 桿 菌（Flavobacterium columnare）屬于嗜纖維菌屬、黃桿菌屬、擬桿菌屬類群（Cytophaga flavobacterium bacteroides，CFB）。菌體形態(tài)大多呈直桿狀，直徑0.5 μm，體長(zhǎng)6～12 μm，革蘭氏陰性，無(wú)鞭毛；25 ℃培養(yǎng)1 d，菌落邊緣不整齊，呈淡黃色。柱狀黃桿菌主要危害魚種和成魚，導(dǎo)致?tīng)€鰓病[3]。爛鰓病發(fā)病期為4—6月份和9—10月份，死亡率較高。該病主要癥狀為病魚體色黑暗，離群，反應(yīng)遲緩，鰓瓣通常有腐爛，鰓小片壞死，病魚口腔表皮發(fā)炎充血，嚴(yán)重的會(huì)有糜爛 ；主要防治方法為全池消毒和內(nèi)服抗菌藥物，此外還要保持水質(zhì)清潔，小心操作避免魚體受傷等[2]。目前，已經(jīng)成功建立了柱狀黃桿菌的常規(guī)PCR檢測(cè)方法、間接ELISA快速檢驗(yàn)方法、雙抗體夾心ELISA檢測(cè)方法等[4]。據(jù)Bebak[5]研究，美國(guó)已經(jīng)研制出柱狀黃桿菌疫苗，并且給自然條件下飼料喂養(yǎng)的大口黑鱸魚苗接種后發(fā)現(xiàn)，能顯著降低其感染后的死亡風(fēng)險(xiǎn)。之后Shoemaker等[6]又利用利福平削弱柱狀黃桿菌毒力，將改良的柱狀黃桿菌活疫苗接種大口黑鱸魚苗，發(fā)現(xiàn)能達(dá)到很好的保護(hù)效果。

1.2 諾卡氏菌

諾卡氏菌（Nocardia）是魚類諾卡氏菌病的致病菌，其中鰤?mèng)~諾卡氏菌主要感染大口黑鱸。該菌體呈短桿狀，有細(xì)長(zhǎng)分支，一般直徑為0.2～1.0 μm，長(zhǎng)2～5 μm，革蘭氏陽(yáng)性，適宜生長(zhǎng)溫度為25～28 ℃。大口黑鱸諾卡氏菌病發(fā)病期主要集中在6—9月份。由于諾卡氏菌病為慢性疾病，潛伏期長(zhǎng)，因此不易被發(fā)現(xiàn)。病魚一般表現(xiàn)不吃食，在環(huán)境變化后，如雨后會(huì)出現(xiàn)大量死亡。該病主要防治方法為及時(shí)有效消毒、科學(xué)投喂和內(nèi)服抗生素[7-8]。蔣依依等[9]分離到一株鰤?mèng)~諾卡氏菌，認(rèn)為它是導(dǎo)致大口黑鱸結(jié)節(jié)病的病原菌，對(duì)其進(jìn)行藥敏試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，該菌株對(duì)氯霉素、鏈霉素、卡那霉素、四環(huán)素等抗菌藥物敏感，但對(duì)磺胺類和氨芐青霉素有耐藥性。目前，大口黑鱸的諾卡氏菌免疫相關(guān)因子研究取得了一定進(jìn)展：Omkar等[10]通過(guò)超高通量測(cè)序平臺(tái)，發(fā)現(xiàn)了大口黑鱸感染諾卡氏菌后，Toll樣受體、趨化因子等各個(gè)免疫相關(guān)基因的上調(diào)表達(dá)模式。Ho等[11]成功克隆了大口黑鱸白介素1β（IL-1β），并在感染諾卡氏菌后進(jìn)行了表達(dá)量測(cè)定，發(fā)現(xiàn)8 h后，頭腎的IL-1β表達(dá)量增加，在第三天達(dá)到高峰，而脾臟的表達(dá)量在5 h后就顯著提高，且持續(xù)3 d。這有利于解釋細(xì)菌感染大口黑鱸后各個(gè)基因在免疫應(yīng)答過(guò)程中發(fā)揮的作用，從而為未來(lái)研發(fā)諾卡氏菌病疫苗提供理論基礎(chǔ)。

2 病毒性疾病

2.1 虹彩病毒

虹彩病毒科（Iridoviridae）病毒都是正二十面體病毒，直徑120～300 nm，包括5個(gè)屬，其中蛙病毒屬（Ranavirus）、細(xì)胞腫大病毒屬（Megalocytivirus）、淋巴囊腫病毒屬（Lymphocystivirus）可以感染脊椎動(dòng)物，而虹彩病毒屬（Iridovirus）、綠虹彩病毒屬（Chloriridovirus）感染無(wú)脊椎動(dòng)物。虹彩病毒科病毒多是單分子線性雙鏈DNA病毒，基因組大小為l70～200 kb，其中主要感染大口黑鱸的為蛙病毒屬和細(xì)胞腫大病毒屬。

2.1.1 蛙病毒 目前研究較多的蛙病毒為大口黑鱸蛙 病 毒（Largemouth bass ranavirus，LMBV），最早于1991年在美國(guó)佛羅里達(dá)州被發(fā)現(xiàn)，1996年先被歸類到虹彩病毒科，后又被歸類到蛙病毒屬。大口黑鱸感染該病毒后，通常不表現(xiàn)任何癥狀，呈隱性帶毒。但Deng等2008年從廣東省佛山地區(qū)分得一株與LMBV同源性較高的病毒，肌肉注射后導(dǎo)致大口黑鱸100%死亡[12]。蛙病毒病夏季高發(fā)，發(fā)病時(shí)水溫為25～30 ℃，危害成魚，致死率高。LMBV在兩棲類、禽類等天然宿主體內(nèi)，甚至魚餌中均可以存活，存在多種傳播途徑，目前沒(méi)有有效的治療藥物，只能靠科學(xué)飼養(yǎng)和及時(shí)消毒來(lái)預(yù)防[13]。實(shí)驗(yàn)室人工感染條件下，腹腔注射和浸泡都可以使大口黑鱸患病，且鰾、鰓和后腎是最容易受LMBV侵襲的器官。而自然環(huán)境下，大口黑鱸普遍呈隱性帶毒。Inendino等[14]研究表明，環(huán)境對(duì)LMBV感染存在影響，水體環(huán)境的劇烈變化、飼養(yǎng)密度過(guò)大等因素都會(huì)導(dǎo)致感染LMBV的大口黑鱸病死率上升。這就要求科學(xué)控制大口黑鱸養(yǎng)殖環(huán)境，防止出現(xiàn)大規(guī)模的LMBV感染。根據(jù)Huang等[15]研究，LMBV感染鯉魚上皮瘤細(xì)胞（EPC）后，可以誘導(dǎo)典型的細(xì)胞凋亡；凋亡啟動(dòng)因子和終止因子的激活與感染時(shí)間顯著相關(guān)，PI3K抑制劑可增強(qiáng)LMBV感染誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，而ERK抑制劑可降低LMBV的感染。這為研究LMBV感染的分子機(jī)制提供了新思路，為研制LMBV疫苗提供了依據(jù)。

2.1.2 細(xì)胞腫大病毒 細(xì)胞腫大病毒會(huì)導(dǎo)致大口黑鱸的脾、腎等病毒靶器官內(nèi)出現(xiàn)大量細(xì)胞質(zhì)勻質(zhì)化且嗜堿性的腫大細(xì)胞，從而導(dǎo)致肝臟、脾臟、腎臟腫大，體色變黑。部分嚴(yán)重的病魚還會(huì)出現(xiàn)眼睛突出，腎臟失血而呈灰白色。該病主要危害成魚，導(dǎo)致其脾腎壞死，一旦暴發(fā)，死亡率高達(dá)80%。目前對(duì)于該病，尚無(wú)有效的治療手段，只能依靠科學(xué)消毒來(lái)進(jìn)行防治。根據(jù)Zhang等[17]研究，將細(xì)胞腫大病毒的ORF75基因制成DNA疫苗，免疫細(xì)胞后會(huì)導(dǎo)致多種免疫基因的上調(diào)表達(dá)，且經(jīng)病毒全基因組轉(zhuǎn)錄分析，發(fā)現(xiàn)敲除ORF75后可導(dǎo)致病毒43種基因的轉(zhuǎn)錄改變，證明ORF75編碼高度保護(hù)性免疫原。這為研發(fā)細(xì)胞腫大病毒疫苗提供了新思路。

2.1.3 其他研究 研究人員還以魚類虹彩病毒主要衣殼蛋白（Majorcapsid protein，MCP）作為保護(hù)性抗原，研制基因工程疫苗，來(lái)解決虹彩病毒病問(wèn)題。MCP蛋白分子量約為50 kD，占病毒總蛋白的40%～45%，具有一定免疫原性，可以保護(hù)病毒核酸并介導(dǎo)病毒與宿主細(xì)胞的結(jié)合。馬冬梅等[16]構(gòu)建重組表達(dá)MCP蛋白的工程菌，制備基因工程疫苗，發(fā)現(xiàn)該疫苗對(duì)LMBV感染后20 d的大口黑鱸保護(hù)率最高達(dá)67.7%。

2.2 彈狀病毒

大口黑鱸感染的彈狀病毒（Rhabdovirus）屬于水泡性病毒屬（Vesiculovirus），為線性負(fù)鏈單鏈RNA病毒，病毒粒子大小約為53 nm×140 nm，形態(tài)呈子彈狀，具有5 種主要結(jié)構(gòu)蛋白（RNA依賴性RNA聚合酶蛋白L、糖蛋白G、核衣殼蛋白N、磷蛋白P、基質(zhì)蛋白M）。彈狀病毒主要導(dǎo)致肝、脾、腎腫大或充血，體色發(fā)黑，使病魚表現(xiàn)彎曲身體，螺旋狀不規(guī)則游動(dòng)。彈狀病毒主要危害魚苗，發(fā)病時(shí)間通常為3—4月份。該病在水溫突然升高或降低時(shí)易發(fā)，而且傳播快、致死率高。本研究小組曾對(duì)浙江省主要養(yǎng)殖地區(qū)大口黑鱸苗的發(fā)病情況進(jìn)行過(guò)調(diào)查，發(fā)現(xiàn)每年死亡率平均在40%～50%之間。針對(duì)該病毒引發(fā)的疾病，目前還沒(méi)有有效的治療藥物。但Chen等[18]構(gòu)建了抗彈狀病毒的G蛋白質(zhì)粒，免疫魚體后，發(fā)現(xiàn)I型IFN抗病毒免疫應(yīng)答被迅速觸發(fā)，并且可降低組織器官損害程度并抑制病毒復(fù)制。這為開(kāi)發(fā)彈狀病毒疫苗提供了新思路。

Gao等[19]將大口黑鱸彈狀病毒（MSRV）感染大口黑鱸皮膚細(xì)胞，利用深度RNA測(cè)序技術(shù)，揭示MSRV感染過(guò)程中的轉(zhuǎn)錄譜，并用定量PCR驗(yàn)證幾種差異表達(dá)基因，發(fā)現(xiàn)其可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，激活干擾素信號(hào)通路。這為病毒感染其他免疫相關(guān)基因的后續(xù)研究提供了有用資源。

3 寄生蟲病

3.1 車輪蟲

車輪蟲（Trichodina）是車輪蟲科（Trichodinidae claus）寄生性纖毛蟲原生動(dòng)物的統(tǒng)稱。車輪蟲科隸屬寡膜綱（Oligohymenophora de puytorac）。在我國(guó)已見(jiàn)報(bào)道的車輪蟲有5個(gè)屬近80種，其中直鉤車輪蟲主要感染大口黑鱸而導(dǎo)致大口黑鱸車輪蟲病。病魚體色黑暗且消瘦，體表有較多粘液，鰓絲發(fā)白腐爛，群游于池邊。此病于培苗期間流行，通常為3—5月份，對(duì)魚苗、魚種危害較大，致死率較高，且易發(fā)生繼發(fā)感染。主要防治方法為全池消毒。Meira-filho等[20]發(fā)現(xiàn)，直接用476 mg/L的冰醋酸浸泡魚體1 h可以有效防治車輪蟲。李鷥鷥等[21]認(rèn)為，目前標(biāo)準(zhǔn)用藥效果欠佳，導(dǎo)致一些限制或禁止使用藥物被濫用。為達(dá)到安全防治的目的，可著力研發(fā)藥效好、低殘留、無(wú)抗藥性、污染小的中草藥。Yao等[22]發(fā)現(xiàn)利用白屈菜中的白屈菜紅堿浸泡可以100%去除車輪蟲（濃度為0.8 mg/L）。這都為開(kāi)發(fā)新的抗車輪蟲藥提供了依據(jù)。

3.2 杯體蟲

魚杯體蟲（Apiosoma piscicola blanchard）屬于杯體蟲屬（Apiosoma blanchard），是一種附著于多種水生生物體表及鰓部的緣毛類纖毛蟲。該蟲體口圍唇具有極強(qiáng)的伸縮性，可將口圍纖毛完全縮進(jìn)體內(nèi)，身后端有一條吸盤狀茸毛器，可借此粘附魚體。大口黑鱸感染杯體蟲后，主要癥狀為病魚群游于池邊或水面，體表、鰭條有類似水霉的灰白絮狀物。該病在3—5月份的培苗期流行，主要危害魚苗，且容易產(chǎn)生繼發(fā)感染。防治方法與車輪蟲病相似，主要做好水體消毒[23]。

3.3 斜管蟲

斜管蟲（Chilodonella）屬斜管科、管口目，主要寄生在淡水魚的鰓和體表，少量寄生時(shí)對(duì)魚體危害不大。大口黑鱸感染斜管蟲的主要癥狀為體色發(fā)黑，體表和鰓有較多粘液，消瘦，側(cè)臥池邊或漂于水面。該病流行于培苗期，主要危害魚苗。預(yù)防措施主要是用硫酸銅-硫酸亞鐵合劑（5：2）全池潑灑消毒或用高錳酸鉀消毒魚苗。顧中華等[24]研究認(rèn)為，可以用硫酸銅制劑、高錳酸鉀等多種藥物進(jìn)行治療，但治療過(guò)程中一定要注意配合使用抗菌藥物，以預(yù)防其他細(xì)菌病發(fā)生。

3.4 小瓜蟲

多子小瓜蟲（Ichthyophthirius multifiliis）屬小瓜蟲屬（Ichthyophthirius）、凹口科（Ophryoglenidae）、膜口目（Hymenostomatida）。成蟲一般呈卵圓形或球形，乳白色，是目前魚體上發(fā)現(xiàn)的最大寄生原蟲。研究表明，小瓜蟲成長(zhǎng)過(guò)程分為幼蟲、成蟲和滋養(yǎng)體3個(gè)時(shí)期，最終成蟲發(fā)育成的滋養(yǎng)體會(huì)脫離魚體，在水中固著。大口黑鱸感染小瓜蟲的主要癥狀為病魚反應(yīng)遲緩，消瘦，浮于水面或集群繞池，肉眼可見(jiàn)病魚體表和鰓上布滿白色點(diǎn)狀胞囊。感染嚴(yán)重的病魚病灶組織增生，分泌大量粘液，會(huì)在體表形成一層白色薄膜。該病主要發(fā)生在3—5月份，發(fā)病水溫20～25 ℃，直接危害種苗。成魚也可發(fā)病，若治療不及時(shí)死亡率較高。近年篩選了一些中草藥，如辣椒和生姜等，以及有一定療效的藥物，如硫酸銅、高錳酸鉀等。這些藥物大多只對(duì)幼蟲有一定效果，對(duì)成蟲和滋養(yǎng)體效果不明顯。有學(xué)者提出開(kāi)發(fā)抗小瓜蟲疫苗來(lái)防治小瓜蟲，但目前還在研究中[25]。

4 討論

大口黑鱸從上世紀(jì)引進(jìn)我國(guó)，經(jīng)過(guò)近30年的發(fā)展，其養(yǎng)殖已形成產(chǎn)業(yè)規(guī)模，產(chǎn)業(yè)分工劃分明確，養(yǎng)殖技術(shù)方面也已達(dá)到較高水準(zhǔn)。白俊杰等[26]報(bào)道，大口黑鱸本身有較強(qiáng)的抗病力，在全國(guó)大多數(shù)省份養(yǎng)殖，年總產(chǎn)量在16萬(wàn)～20萬(wàn)噸之間。該魚的養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)一直穩(wěn)步發(fā)展，已成為我國(guó)池塘養(yǎng)殖的重要優(yōu)質(zhì)魚類。但是養(yǎng)殖者為了追求產(chǎn)量和效益，不斷提高養(yǎng)殖密度，加上種質(zhì)、飼料、水質(zhì)和環(huán)境等因素影響，致使其病害頻發(fā)，從而帶來(lái)了重大經(jīng)濟(jì)損失。為保障大口黑鱸養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，政府需加大對(duì)大口黑鱸病害研究相關(guān)項(xiàng)目的扶持力度，如：建立有效的病害快速檢測(cè)技術(shù)，加快研發(fā)病毒性疾病疫苗；加大宣傳力度，鼓勵(lì)養(yǎng)殖農(nóng)戶合理規(guī)劃養(yǎng)殖密度；多使用生態(tài)防治技術(shù)，減少化學(xué)藥物使用；科學(xué)投喂配合飼料，減少冰鮮魚的使用。

疫苗免疫、使用中草藥是預(yù)防和控制傳染性疫病的重要措施，也是解決目前大口黑鱸養(yǎng)殖中存在的抗菌藥物過(guò)度使用、藥物殘留超標(biāo)、耐藥性增加等食品安全以及環(huán)境污染系列問(wèn)題的關(guān)鍵手段，這符合國(guó)家對(duì)水產(chǎn)藥物研發(fā)的發(fā)展方向。農(nóng)業(yè)部在《“十三五”農(nóng)業(yè)科技發(fā)展規(guī)劃》（農(nóng)科教發(fā)〔2017〕4號(hào)）文件中，將加強(qiáng)水產(chǎn)養(yǎng)殖用疫苗、禁用藥物替代品研發(fā)及標(biāo)準(zhǔn)化應(yīng)用列為重點(diǎn)研究?jī)?nèi)容之一。但目前水產(chǎn)疫苗仍存在規(guī)模化群體免疫實(shí)施困難、有效無(wú)抗性抗原提呈系統(tǒng)不完善、免疫效果差、免疫機(jī)理研究不透徹等難點(diǎn)亟待解決，而且目前中草藥的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用也不夠深入，缺乏藥理和藥效方面的研究。未來(lái)可以結(jié)合現(xiàn)代分子生物學(xué)和免疫醫(yī)學(xué)知識(shí)，創(chuàng)制綠色、安全、廉價(jià)、高效、操作簡(jiǎn)單的新型漁藥，為實(shí)現(xiàn)漁業(yè)綠色發(fā)展，提供技術(shù)支撐。