于洋 綜述 關(guān)海霞 審校

（中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院 內(nèi)分泌科/內(nèi)分泌研究所；遼寧省內(nèi)分泌疾病重點實驗室，遼寧 沈陽 110001）

近年來，分化型甲狀腺癌（differentiated thyroid cancer，DTC）成為發(fā)病率上升最快的惡性實體腫瘤[1-4]。如何從眾多甲狀腺結(jié)節(jié)中正確識別出以DTC為主的甲狀腺癌，是甲狀腺結(jié)節(jié)術(shù)前評估的重要環(huán)節(jié)，也是減少診斷性手術(shù)、實現(xiàn)合理診治DTC的第一步[5-6]。目前，術(shù)前診斷DTC準確性最高的手段是細針穿刺（fine needle aspiration，F(xiàn)NA）細胞學檢查，但其短板之一在于通過FNA獲取的標本，能夠被明確診斷為良性和惡性的比例分別僅為55%～74%和2%～5%，高達20%～40%的樣本細胞學表現(xiàn)介于良惡性中間型，即“不確定診斷”，仍難為后續(xù)處理提供良好依據(jù)[7-10]。由于FNA得到的細胞量有限，難以對甲狀腺癌中異常表達的某些蛋白（如半乳糖凝集素3等）施行檢測，故在分子診斷出現(xiàn)之前，甲狀腺結(jié)節(jié)患者在FNA細胞學無法確診時，只能接受重復穿刺或診斷性手術(shù)，增加了患者的精神負擔和不必要的手術(shù)。

隨著對DTC發(fā)病機制的深入了解、里程碑式研究——人類癌癥基因圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）的結(jié)果發(fā)布、以及分子生物學技術(shù)的迅速發(fā)展[11-16]，開發(fā)分子診斷工具并將其應用于DTC術(shù)前診斷的研究不斷涌現(xiàn)，部分研究結(jié)果也已成功轉(zhuǎn)化為商業(yè)應用。與傳統(tǒng)的基于蛋白水平的腫瘤標記物不同，分子診斷中涉及的標記物主要聚焦在基因水平上的突變和表達改變，能夠充分利用有限的標本，對細胞學診斷做出良好的補充。本文主要參考近5年文獻，綜述DTC術(shù)前分子診斷的進展，重點介紹分子診斷的應用對象、如何評估分子診斷的價值、可從商業(yè)化途徑獲得的分子診斷工具及其應用價值、衛(wèi)生經(jīng)濟學考量和認識誤區(qū)。

1 術(shù)前應用分子診斷的合理對象和標本選擇

首先，與某些消化道和婦科惡性腫瘤不同，術(shù)前DTC患者的血液標本中無提示診斷的腫瘤標記物，因此甲狀腺結(jié)節(jié)患者尚不能通過血液檢測進行良惡性鑒別。2013年，K?hler等[17]曾對DTC患者和健康人進行了外周血全基因組易感基因的篩選及驗證，提出DIRC3、IMMP2L、RARRES1和SNAPC4/CARD9 4個基因的5種單核苷酸多態(tài)性可能成為診斷DTC的血液分子標記物。但遺憾的是，后續(xù)未再有相關(guān)研究發(fā)表。因此，血液分子標記物用于DTC診斷仍是空白。

分子標記物應用于DTC診斷的主要進展，均聚焦于對術(shù)前FNA標本的研究和實踐。需要強調(diào)的是：并非所有的FNA標本都需要分子診斷。如前所述，直接取材于甲狀腺結(jié)節(jié)的FNA樣本，細胞學診斷會出現(xiàn)相當比例的“不確定診斷”。僅需少量細胞即可檢測的分子標記物，主要是針對這部分樣本，以便從中進一步擇選出可明確診斷的病例，為他們制定更恰當?shù)奶幚矸桨?。而不適宜FNA檢查、FNA細胞學已能夠明確診斷為良性結(jié)節(jié)或甲狀腺癌以及具有其他手術(shù)指征的甲狀腺結(jié)節(jié)患者，并不是分子診斷的合適對象[18-19]。

2 分子診斷效能的評估指標

評估分子診斷的效能，主要通過敏感度、特異度、陽性預測值（PPV）、陰性預測值（NPV）和準確性等指標。在閱讀和分析有關(guān)分子診斷的文獻時，搞清這些指標對正確理解分子標記物的診斷效能至關(guān)重要。簡要地說：敏感度是指“實際患DTC、通過分子診斷篩檢被正確地判為DTC的比例”；特異度是指“實際無DTC、通過分子診斷篩檢被正確地排除DTC的比例”；PPV是指“分子診斷篩檢陽性結(jié)果者患DTC的可能性”；NPV是指“分子診斷篩檢陰性結(jié)果者未患DTC的可能性”。因此，敏感度高的分子標記物，對DTC的NPV較高；特異度高者，PPV較高；PPV高的分子標記物，有助于確診DTC；NPV高者，有助于排除DTC。

評估分子診斷對DTC的診斷效能時，還要了解到待檢FNA標本中甲狀腺癌的比例也會對其PPV和NPV造成影響[20]。如果待檢標本中的DTC比例很低，則PPV較高而NPV大大減低；相反，如果待檢標本中的DTC比例很高，雖然可以提高NPV，但隨之而來的是PPV下降的代價。因此，在比較不同研究得到的PPV、NPV結(jié)果時，還要注意研究間待檢FNA標本中的DTC比例是否有很大差異。

3 可從商業(yè)途徑獲得的DTC術(shù)前分子診斷工具及其應用價值

3.1 BRAF V600E突變

有學者[21-23]在PTC中發(fā)現(xiàn)了BRAF V600E突變，這被公認為甲狀腺癌研究領(lǐng)域中的突破性成果之一。BRAF V600E突變是迄今為止在DTC中發(fā)生頻率最高的基因突變，東亞人群中這一現(xiàn)象更為明顯[24]。由于單基因突變檢測相對方便，加上近年來出現(xiàn)了很多商用BRAF V600E突變檢測試劑盒，國外開展了多項評估其術(shù)前診斷價值的研究。國內(nèi)很多醫(yī)療機構(gòu)也已將BRAF V600E突變檢測列入甲狀腺結(jié)節(jié)術(shù)前鑒別診斷的輔助項目，但遺憾的是，尚缺乏在我國人群中開展的設(shè)計良好的、評估其術(shù)前診斷效能的臨床試驗。根據(jù)國外研究的數(shù)據(jù)，單獨檢測這一突變，盡管特異度和PPV很高，但敏感度和NPV很低。而且，因為不確定診斷的FNA樣本中僅有不足一半為真正的DTC，故BRAF V600E陽性的檢出率遠遠低于DTC術(shù)后標本報道的突變陽性率。這意味著以BRAF V600E突變?yōu)樵\斷標記物時，一小部分患者會得到陽性結(jié)果，據(jù)此可以確診為DTC；但是更多患者會得到突變陰性的報告，而陰性結(jié)果并不能除外DTC的可能性。在某些不恰當?shù)貙⒎肿訕擞浳镌\斷推行于所有FNA標本的醫(yī)療機構(gòu)，BRAF V600E突變能提供的鑒別診斷價值就更低[18]。不過，根據(jù)江蘇南京武曉泓教授研究組的報告，細胞學聯(lián)合BRAF V600E突變檢測所有類別的FNA標本能夠提高DTC診斷的敏感性和準確率[25]，在醫(yī)療機構(gòu)FNA細胞學診斷水平相對欠佳的背景下，可能也有一定應用價值。但換一個角度，對FNA細胞學診斷水平低的解決方式，更合理的選擇應該是幫助細胞學診斷者切實掌握基本功和診斷技能，而非依靠分子標記物檢測來彌補不足。

3.2 7-基因突變芯片

認識到單基因突變的診斷效能不足后，將DTC中發(fā)現(xiàn)的基因改變組合起來制成診斷用分子標記物成為趨勢。7-基因突變芯片是早期代表之一，它將在DTC中發(fā)現(xiàn)的7種基因改變（BRAF V600E、NRAS 61、HRAS 61、KRAS 12/13突變和RET/PTC1、RET/PTC3及PAX8/PPARγ重排）置入同一張芯片。Nikiforov等[26]利用7-基因芯片對1 056例術(shù)前FNA診斷不確定的標本進行了檢測，結(jié)果顯示在不同Bethesda分類（III、IV和V類）中，芯片診斷的敏感度為57%～68%，特異度接近96%～99%，PPV為87%～95%，NPV為72%～94%，證實了組合多種突變的分子標記物檢測診斷價值高于單基因檢測；而且，基于其較高的PPV和特異度，7-基因芯片更利于確定（rulein）DTC。但是，在Eszlinger等[27]的回顧性研究中，對348例DTC患者的FNA樣本進行了7-基因芯片檢測：BRAF、RET/PTC和RAS突變陽性者中，最終確診惡性結(jié)節(jié)的比例分別為98%、100%和31%，故芯片診斷DTC的敏感度僅為36%，PPV僅在40%左右，無法滿足臨床期望。這意味著該芯片的診斷效能仍需要進一步提升。

3.3 基因表達分類器（gene expression classifier，GEC）

GEC是一組含167個基因表達的芯片，由美國Afirma公司開發(fā)。2012年，Alexander等[28]在新英格蘭醫(yī)學雜志發(fā)表了應用GEC對診斷不確定的FNA標本進行良惡性鑒別的前瞻性研究，這也是迄今為止分子標記物評估中唯一的多中心前瞻性研究。265例甲狀腺結(jié)節(jié)的細胞學診斷不確定的FNA樣本接受了GEC檢測，并均行手術(shù)治療，以術(shù)后病理為結(jié)節(jié)良惡性的金標準。結(jié)果提示：GEC準確鑒別出85例甲狀腺癌中的78例，假陰性7例（其中6例源自送檢標本細胞數(shù)不足）。GEC診斷的敏感度為92%、特異度為52%，在不典型/不典型的濾泡病變（AUS/FLUS）組、濾泡性腫瘤/可疑濾泡性腫瘤（FN/SFN）組和可疑惡性（SMC）組的陰性預測值分別為95%、94%和85%。由于GEC檢測結(jié)果具有良好的陰性預測值，更利于排除（rule-out）DTC，因此建議對GEC檢測陰性的結(jié)節(jié)可考慮按良性結(jié)節(jié)處理和隨訪[29]。但是，2014年McIver等[30]的小樣本（n=72）研究報道GEC的診斷效能遠遠低于新英格蘭醫(yī)學雜志的報道。2015年，約翰霍普金斯醫(yī)院的學者在JAMA子刊上撰文，總結(jié)了該機構(gòu)273例測試的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)GEC的PPV和NPV分別為42.1%和83.3%，其結(jié)果導致治療方案調(diào)整的患者比例僅為8.4%；更令人關(guān)注的是，超過一半（53.5%）的GEC檢測的臨床適應證并不充分，這些病例中無論GEC呈現(xiàn)何種檢測結(jié)果，均不會影響治療方案，因此屬于過度應用[31]。2016年，Wu等[32]的研究指出GEC的診斷功效與結(jié)節(jié)大小無關(guān)，但其對許特爾（Hurthle）細胞優(yōu)勢性結(jié)節(jié)的識別能力欠佳；Wong等[33]發(fā)現(xiàn)通過GEC檢出的DTC，64%為非侵襲性濾泡變異型PTC（NFVPTC）。綜合上述研究結(jié)果，雖然GEC曾讓人們看到分子標記物診斷的良好前景，但后期臨床實踐數(shù)據(jù)非但未能提供更有力的支持，反而提示其存有缺陷。目前，Afirma公司已經(jīng)開始轉(zhuǎn)而開發(fā)理論上能夠提供更大信息量的基因測序分類器（gene sequencing classifier，GSC），希望能夠彌補GEC的不足。

3.4 二代測序芯片ThyroSeq

如前文所述，僅通過1個或7個基因突變的檢測來鑒別DTC，診斷效能較低。二代基因測序技術(shù)的發(fā)展，為同時檢測多基因改變提供了準確高效的手段，用于甲狀腺結(jié)節(jié)FNA樣本的二代測序芯片（targeted next-generation sequencing，tNGS）ThyroSeq應運而生，由美國CBLPath公司檢測并出具報告。匹茲堡大學的病理科教授Nikiforov是該芯片的設(shè)計和改良者。第1版ThyroSeq芯片包含12個甲狀腺腫瘤中的常見突變基因的284個突變熱點，對228例甲狀腺結(jié)節(jié)樣本的研究顯示：芯片檢測只需5～10 ng DNA，99.6%的樣本可成功獲得結(jié)果，能夠準確甄別出70%的經(jīng)典型PTC、83%的濾泡變異型PTC和78%的經(jīng)典型FTC；但不足之處在于6%的良性結(jié)節(jié)亦有陽性突變結(jié)果[34]。Nikiforov教授團隊[35-36]很快推出了第2版ThyroSeq芯片，包含甲狀腺癌相關(guān)的14個基因上的點突變（如BRAF、RAS、NTRK、TP53等）及42種基因融合（如RET/PTC、PAX/PPARG等）。根據(jù)他們在FNA樣本中進行的回顧性分析和前瞻性驗證研究，第2版ThyroSeq芯片在Bethesda III類和IV類FNA樣本中診斷甲狀腺癌的敏感度、特異度、PPV、NPV分別為91%、92%、77%、97%和90%、93%、83%、96%。但是，在其他醫(yī)學中心并未重復出同樣優(yōu)異的檢測效能（根據(jù)筆者對波士頓醫(yī)學中心ThyroSeq結(jié)果分析，相關(guān)數(shù)據(jù)尚未正式發(fā)表）。此外，由于相當比例的RAS突變出現(xiàn)于2016年新命名的“具有乳頭狀核特征的非侵襲性濾泡型甲狀腺腫瘤”（noninvasive follicular thyroid neoplasm with papillary-like nuclear features，NIFTP）和良性濾泡性腺瘤中[37-38]，因此目前ThyroSeq芯片對DTC的PPV較前大大下降，而假陽性占比升高。為了進一步克服ThyroSeq在正確甄別NIFTP和Hurthle細胞瘤上的不足，2017年CBLPATH公司正式推出第3版ThyroSeq芯片，其后續(xù)表現(xiàn)值得關(guān)注。

3.5 7-基因突變和小RNA（miRNA）聯(lián)合檢測芯片

隨著分子標記物檢測手段的不斷進步，擴大檢測分子標記物的廣度已不存在技術(shù)障礙，因此研究者們嘗試聯(lián)合檢測甲狀腺癌相關(guān)的基因表達、基因突變和miRNA，以期提高分子診斷的診斷效能。2015年，Asuragen公司開發(fā)的聯(lián)合檢測芯片將7-基因突變芯片和miRNA表達分類器結(jié)合，并在109例AUS/FLUS和FN/SFN 樣本中進行了檢測效能分析，結(jié)果顯示：聯(lián)合檢測的靈敏度、特異度、PPV和NPV分別為89%、85%、74%和94%；與單獨使用GEC相比，可多鑒別出65%的良性病灶，同時可使診斷性腺葉切除術(shù)減少69%[39]。由此可見，多類分子標記物聯(lián)合檢測確實有希望提供更多鑒別診斷信息，但如何組合各類標記物才能達到聯(lián)合檢測的最佳效能，仍要繼續(xù)探索。

4 分子診斷參與DTC術(shù)前診斷的衛(wèi)生經(jīng)濟學

減少醫(yī)療負擔和資源浪費也是合理診治DTC的重要目標之一，因此衛(wèi)生經(jīng)濟學也是應用術(shù)前分子診斷時需要考量的方面。不同國情下的醫(yī)療資源供給、就診便利性、醫(yī)療保險體系、醫(yī)療服務(wù)收費、疾病治療和隨訪負擔、分子診斷檢測費用等多因素差異，均可能導致分子診斷DTC的實際應用價值高低有別。Lee等[40]比較了美國和加拿大兩國將GEC和7-基因芯片用于DTC診斷的衛(wèi)生經(jīng)濟學，結(jié)果顯示在美國兩者聯(lián)合應用是成本效益最高的診斷策略，而在加拿大不進行基因檢測的方案性價比最高。Wu等[41]對FNA細胞學未能確診的結(jié)節(jié)，比較了常規(guī)進行GEC檢測和傳統(tǒng)診斷策略的衛(wèi)生經(jīng)濟學，發(fā)現(xiàn)雖然GEC本身檢測費用較為昂貴，但通過減少不必要的手術(shù)以及避免它們帶來的負面影響，能夠降低社會總體醫(yī)療支出，且檢測的成本效益與待檢標本中甲狀腺癌所占比例相關(guān)。但是，這些國外完成的衛(wèi)生經(jīng)濟學研究顯然不能直接套用于我國。舉例而言，在美國，GEC和第2版ThyroSeq芯片的費用分別約3 500美元/例和2 000美元/例，而甲狀腺手術(shù)的費用約10 000美元/例，應用分子標記物協(xié)助診斷來減少不必要的手術(shù)，能夠帶來顯而易見的醫(yī)療費用節(jié)約；在我國，GEC和ThyroSeq檢測費用折合人民幣分別約24 000元/例和14 000元/例，而甲狀腺手術(shù)的費用僅在10 000元/例上下，希望通過分子診斷達到節(jié)約醫(yī)療成本的目的，尚難以讓人信服。由此可以看出，要想更好地在我國推廣分子標記物診斷，還需要收集結(jié)合我國國情的衛(wèi)生經(jīng)濟學數(shù)據(jù)。

5 對DTC術(shù)前分子診斷的認識誤區(qū)

最常見的誤區(qū)是盲目擴大分子診斷的使用范圍，甚至將其適應證推廣到所有FNA標本。如前文所述，對于不適宜FNA檢查、FNA細胞學已能夠明確診斷為良性結(jié)節(jié)或甲狀腺癌，以及具有其他手術(shù)指征的甲狀腺結(jié)節(jié)患者，并不是分子診斷的合適對象；此外，分子診斷不能替代細胞學診斷，不應過分依賴高科技而放棄基本功。另一個誤區(qū)在于不了解衡量分子標記物診斷效能的指標，忽略全面分析分子診斷效能的重要性，不清楚影響PPV和NPV結(jié)果的因素，從而導致高估或低估分子診斷的臨床意義。

綜上所述，分子診斷有望為術(shù)前從眾多甲狀腺結(jié)節(jié)中準確鑒別出DTC提供幫助，因此分子標記物診斷的開發(fā)、轉(zhuǎn)化和應用前景非常誘人。但是也應清楚地認識到，目前尚未出現(xiàn)完美的DTC分子診斷工具。在繼續(xù)探索這一領(lǐng)域的過程中應理性前行，客觀看待現(xiàn)有分子診斷的優(yōu)勢和不足，避免高科技帶來的負面作用。隨著對甲狀腺腫瘤分子機制的不斷總結(jié)認識，相信會有更多優(yōu)質(zhì)且經(jīng)濟的分子診斷工具推出，但在推廣用于臨床實踐之前，應當精心設(shè)計多中心、前瞻性研究對其診斷價值進行全面評估，并將衛(wèi)生經(jīng)濟學納入考慮。另外，DTC分子診斷工具的開發(fā)思路，也不應僅僅拘泥于甲狀腺癌相關(guān)的基因改變，結(jié)合最新發(fā)表的良性甲狀腺腫瘤特有基因的研究結(jié)果[42]，是否也可考慮在診斷芯片或分類器中加入排除DTC的分子標記物，值得進一步探討。

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