筱 禾 編譯

?

微生物組促進害物抗性的產生和應用

筱 禾 編譯

(上海市農藥研究所，上海 200032)

1 微生物組(microbiomes)

對與真核生物生態(tài)相關并在真核生物中發(fā)揮各種功能的細菌、真菌、病毒和古細菌微生物組的研究目前非常流行，尤其是與人類微生物組相關的。最近創(chuàng)建的術語微生物組包括腸道微生物，共生微生物的整體生物群落，表面微生物，根際微生物、根表微生物和根系內生菌等。下文僅就有害生物的微生物組與害物的關系對害物治理的影響，即作為除草劑代謝和殺蟲劑抗性的一種模式進行討論。此外，簡要描述了微生物組生物體在作物和有益昆蟲中的應用前景，或可用于增強化學合成農藥的藥效或提高農藥選擇性。微生物組能夠影響農藥的作用并不稀奇，已有許多研究記載了人類腸道微生物組如何影響藥物功效。

2 微生物可降解農藥

在討論微生物組生物體是否影響害物治理之前，需要強調的是與微生物組無直接相關性的微生物明顯具有這種作用。眾所周知，微生物降解是環(huán)境中農藥消解的主要途徑。降解速度的不同，在某些情況下會引發(fā)問題。30多年前，當在某種植季為防治昆蟲和雜草頻繁、大量應用殘效較長的土壤處理除草劑和殺蟲劑時，出現了所謂的“問題土壤”。這種缺乏長期防治的原因并不是由于有害生物出現了抗性。大多數情況是由于富集的土壤微生物降解了殺蟲劑和除草劑。反之，大多數用于抗除草劑轉基因作物的基因來源于土壤微生物，通常是從有除草劑殘留的土壤中分離所得。蘇云金芽孢桿菌菌株在有機農業(yè)中用作殺蟲劑，其毒素基因被轉基因導入許多作物中，通常是葉面定殖生物體，但一般是從土壤中落葉凋落物中分離所得。

3害物微生物組生物體降解環(huán)境異生物質(environmental xenobiotics)

越來越多的報道表明，害物對非商業(yè)性殺蟲劑類異生物質的抗性不屬于害物基因組機制，而是微生物組生物體。下面舉例說明。

咖啡因具有很高的殺蟲活性，研究人員試圖找到造成危害全球咖啡種植園的咖啡果小蠹()出現抗性的基因。令他們驚訝的是，無菌(axenic)咖啡果小蠹幼蟲很容易被低劑量的咖啡因滅殺，追蹤到該基因位于微生物組組合體中的一個特異生物體中，而不是咖啡果小蠹的基因。因為橄欖蠅()幼蟲對毒性酚苷橄欖苦苷(oleuropein)敏感，故其應不能存活于橄欖果實。橄欖蠅自橄欖果實表面獲得細菌，經由一種尚未闡明的機制使橄欖蠅對橄欖苦苷產生抗性。最近已論述了許多昆蟲微生物組的類似情況。同樣，松材線蟲()不具備降解蒎烯(pinene)的能力，但其在松樹中泛濫。這種對萜類降解能力再次源于它們的微生物組。

在生物防治失控的情況下，從夏威夷將甘蔗蟾蜍()引入澳大利亞，以防治危害甘蔗的本土Frenchi甲蟲()和灰背甘蔗甲蟲()。80年前，主要使用砷類殺蟲劑來防治甲蟲。甘蔗蟾蜍頭部的毒腺分泌可殺死本土天敵及寵物的心臟毒素(cardiotoxin)，導致本地物種的大量消失。研究人員最近研究了該毒素對蟾蜍卵和蝌蚪或蟾蜍本身沒有毒性的原因。他們發(fā)現微生物組生物體能夠降解毒素，而蟾蜍用這些生物體將卵包裹起來。

據報道，植物也可利用微生物組生物體保護自身免受異生物質影響。例如，根瘤菌雅致放射毛霉(s)可保護苘麻()免受由黑麥產生的化感物質——苯并噁唑啉-2(3)-酮的危害。

4 微生物組生物體降解害物體內農藥

考慮到微生物組與寄主互利共生的長期進化史，它們對殺蟲劑有相同的作用并不意外。40年前報道了首例微生物組促進抗性產生，之后被遺忘了30多年。后來有報道，蘋果實蠅()微生物組中共生細菌假單胞菌()能降解6種不同的殺蟲劑，使這些殺蟲劑不能用于防治蘋果實蠅。除了1994年有人提出昆蟲內生物體的“共代謝降解”可能是農藥快速降解的一個可能原因之外，微生物組促進抗性的可能性大多被忽略。

只有在近5年來才有更多的情況被揭露。腸道共生體檸檬酸桿菌(sp.)某個菌株的基因編碼的磷酸酶羥化酶可降解橘小實蠅()體內的有機磷類殺蟲劑敵百蟲，導致防效下降。同樣，危害豆科作物的點蜂緣蝽()的共生細菌伯克氏菌()可降解殺蟲劑殺螟松，使害蟲存活。這些細菌也存在于土壤中，表明它們可能會將對這種殺蟲劑的抗性傳給其他攝入它們的昆蟲。這需要生物體能夠在微生物組中確立不被已經存在的生物體所抑制的能力。降解機制尚未深入研究，因此很少或根本沒有與殺蟲劑交互抗性相關的信息，這對于抗性治理來說非常重要。從小菜蛾()腸道中分離出的多種細菌能夠降解殺蟲劑茚蟲威和乙酰甲胺磷，但還有待證明它們會導致原位抗性。最近已有文章綜述了許多此類有關昆蟲微生物組的案例。

除草劑禾草靈通常不用于土壤處理，因此以下例子描述非農情況，可能出現的情況。在禾草靈處理后，根際細菌豐度增加，保護了對該藥劑敏感的水稻植株。真菌內生菌似乎與多花黑麥草()對禾草靈的抗性相關，但沒有用真菌耐藥品系接種植物易感品系的試驗數據來證明。

賦予許多已進化代謝抗性的雜草基因尚未被分離或克隆。盡管抗性遺傳學并不完全清楚，但這種雜草編碼基因實際上并不存在的可能性直到最近才被質疑。這種遺傳不是單基因的，其多基因遺傳可能由其他因素引起。最近的2項研究發(fā)現耐藥性雜草的內生真菌數量高于易感種群。多花黑麥草的內生細菌很少，但與對草甘膦的抗性顯著相關。已報道在非靶標抗性看麥娘()、硬直黑麥草()和草甸羊茅()中存在內生雙分病毒科(Partititiviridae)和彈狀病毒科(Rhabdoviridae)的病毒。在測試的任何除草劑敏感生物型植物中未發(fā)現看麥娘葉脈曲張病毒1 (AMVV1)，但在耐受種群中的大多數植物中發(fā)現了。這2種情況下都沒有發(fā)現任何直接的因果關系，因為尚未向對除草劑敏感的生物型接種這些生物體，以確定它們是否賦予抗性，或者細菌抗生素或抗病毒處理能否消除抗性。

昆蟲腸道中含有微生物組生物體，植物具有體表微生物組(根際生物體以及葉片和果實表面的微生物)以及內生微生物組(內生菌)。昆蟲和雜草中的更多微生物組能否降解殺蟲劑和除草劑有待時間來證明。一種可能性推測是，同樣影響微生物自身代謝的農藥最有可能首先出現這種進化，如抑制氨基酸生物合成途徑的除草劑。進一步假設它們進化后對異生物質具有解毒作用，且不直接影響自身但能挽救其寄主。但這個假設可能有爭議，咖啡因、咖啡果小蠹和歐文氏菌的情況就是如此。目前沒有這方面的證據支持，也不可能，因為咖啡因能抑制與歐文氏菌近緣的大腸桿菌。如果微生物組生物體產生靶位點抗性，不太可能挽救其寄主。只有代謝抗性或螯合才會使寄主產生抗性。

預測還有一種可能性，即昆蟲腸道細菌會產生降解被用作殺蟲劑的各種蘇云金芽孢桿菌毒素的蛋白酶，因為這些殺蟲劑很容易成為這些細菌的營養(yǎng)來源。任何時候一種生物體被一種農藥所抑制，很可能會產生抗性，而已知這些Bt毒素可影響昆蟲腸道內的微生物群落結構。

其中一些微生物組促進的抗性可能遺傳，因為細菌會從母體傳播至害物的卵或種子表面。確定抗性是來自害蟲基因組還是微生物組基因組的最簡單方法是使用無菌害物，或用抗生素處理害物，并觀察抗性是否保持不變。上述抗性不符合抗性應是害物基因組內遺傳的傳統(tǒng)定義。由于田間的這種防治失效(lack of control)不符合抗性定義，有人提議將定義修改為包括其他類型的防治失效。對種植者來說，肯定無法理解由微生物組引起的防治失效不是抗性。這個例子說明內吸性殺菌劑和抗菌化合物可作為農藥增效劑來預防或克服微生物組促進的農藥抗性。

癌細胞可被視為有害生物，或者至少與它們類似，而抗癌藥物即等同于農藥。令人驚訝的是已經觀察到一些癌細胞的胞內細菌微生物組可降解抗癌藥物2',2'-二氟脫氧胞苷(2′,2′-difluorodeoxycytidine)，導致耐藥性。通過給予抗生素和化學治療劑來克服這種耐藥性。

有一種可能性假設，即一些原因不明的嚙齒動物對抗凝血殺鼠劑的抗性源于微生物組。微生物組通常為哺乳動物提供抗凝血劑的解毒劑——維生素K。富含維生素K的生物體可能會賦予抗藥性。利用抗生素壓制應用抗凝血劑warfarin病人的腸道生物群常常會導致這種抗凝劑的過量，危及生命。將應用高劑量抗凝血劑warfarin的人的排泄物飼喂小鼠，小鼠會產生warfarin耐藥性，表明了由排泄物攝入引起嚙齒動物對抗凝血劑產生抗性的一種可能途徑。

目前有關微生物組促進抗性產生的報道很少。人們在雜草和昆蟲基因組學、轉錄分析和代謝組學方面投入了大量精力，但代謝抗性的許多案例的確切原因尚未闡明。也許這要歸咎于研究的是有害生物的而非微生物組的基因組、基因及其產品。

尋找抗性基因的第一步，往往是從抗性與敏感個體的轉錄組分析開始，觀察哪些基因在抗性害物中產生了差異化的mRNA。粗RNAs是從兩者中提取的，然后過親和柱將結合mRNAs poly (A)尾巴的害蟲mRNAs從其余的RNAs中分離出來。然后對這些poly (A)mRNAs進行洗脫和分析。有一個可能的問題，即只有真核mRNA具有一個ploy (A)尾巴，因此細菌、病毒、線粒體和葉綠體的轉錄體mRNA在分析中被丟棄。

現在的研究方法保留了non-poly(A) mRNA。目前有幾種從害物中分離微生物mRNA的方法，包括商業(yè)試劑盒，本文旨在提醒讀者在農藥抗性情況下這樣做的必要性。

5 微生物組生物體賦予抗性在作物中的應用和益處

令人懷疑的是，自然發(fā)生的內生細菌和/或真菌本身是否能賦予寄主對異生物質產生足夠的抗性。那些可能有用的微生物是典型特異性物種，而不是需要耐受性的物種。其他種類對農藥的降解速度不夠快，無法產生抗性。例如，將一個編碼甲苯降解途徑基因的質粒從沒有定殖于黃羽扇豆的伯克霍爾德菌()菌株轉移到定植的菌株上，“明顯”降低了甲苯對植物的毒性。顯然，在存在甲苯土壤污染問題的情況下，還有更多的事情要做。這些問題很有可能通過基因工程，提高微生物的降解性能而得到解決。

多個研究團隊已經驗證了降解農藥的生物體賦予昆蟲耐藥性的可能性。在殺蟲劑處理前，向模式昆蟲果蠅飼喂與有機磷殺蟲劑對硫磷和毒死蜱結合的鼠李糖乳桿菌()，果蠅則對這2種殺蟲劑具有一定的抗性。有一種感染蚜蟲的內共生體的溶原性噬菌體，可保護蚜蟲不受寄生蜂的侵害。這種噬菌體與感染其他微生物組共生體的噬菌體密切相關?？梢栽O想這種噬菌體可被用來感染有益昆蟲的微生物或將其基因轉入這些昆蟲，在昆蟲體內表達產生內源性噬菌體。在一項專利申請中(目前還不清楚是否有實際證據表明已經做到了這一點)也提出，蜜蜂和其他理想昆蟲的微生物組生物體可被設計用來降解新煙堿類殺蟲劑。

某些植物假單胞菌菌株和種能產生抗菌、殺菌和殺蟲的化學物質。近來有人建議更廣泛地使用這些物質，特別是用于害蟲防治。盡管它們被宣傳為環(huán)境友好和天然的，但不能保證它們制成的化學品是安全的，而且據推測，管理機構將會像審查化學合成農藥一樣對它們進行審查。侵染番茄的假單胞菌可使寄生雜草埃及肉蓰蓉()的萌發(fā)率降低80%。這種雜草每株即能產生數以萬計的種子，因此該菌目前還不足以用于害物治理。盡管如此，可以通過基因工程增強這種假單胞菌的毒性，使其發(fā)揮更大的作用。

在最近的一篇綜述中，對利用基因工程改造內生菌賦予植物除草劑抗性的可能性進行了大量的討論，列舉了可用于開發(fā)新除草劑抗性體系的無數具體代謝體系和基因的實例。

有2種人工將內生菌引入作物用于大規(guī)模農業(yè)的方法。一種方法是利用高壓將內生菌引入種子。這種方法被用于向玉米引入一種可生成具殺蟲活性Bt毒素的基因工程改造內生菌。在多年/地點的田間試驗中，該處理可使玉米螟的危害下降2/3左右。由于防效帶來的產量增加不足以彌補成本，這種方法與殺蟲劑不存在競爭性。另一種接種方法是向植物的花噴灑接種體引入內生菌，且轉基因標記存在于后代中。目前還沒有害物治理相關基因利用該技術進行了試驗的報道。

似乎更容易將微生物組生物體應用于昆蟲，無論是直接用于卵或是幼蟲。

6 結 語

顯而易見，一些研究害蟲對環(huán)境異生物質和殺蟲劑的抗性進化的研究人員已經重現了Pasteur和Lister的研究，需要了解微生物作用和無菌系統(tǒng)的重要性。人們常常認為，如果將植物、嚙齒類動物或昆蟲組織研磨后研究代謝，所闡明的代謝途徑即是這些生物代謝的結果。很少有研究人員會檢查微生物污染，或者用無菌害物來確定抗性是否確實屬于害蟲自身，而不是它的微生物組。微生物組生物體的種群密度時高時低，類似于可隨著選擇壓力的增加而增加的表觀遺傳抗性，在后代中偶爾會被“遺忘”，可能導致被誤認為偶發(fā)(sporadic)抗性。同樣，一些研究人員沒有遵循柯赫氏假設(Koch’s postulates)，將有微生物組和無微生物組的物種個體間的代謝差異與微生物組聯系起來。無需侵染無菌菌株，已用抗性個體的微生物組進行了研究，以確定它們是否獲得了這種性能。

過去，研究人員不想發(fā)表孟德爾遺傳學無法解釋的偶發(fā)抗性案例結果。因此造成了對某些由表觀遺傳因素引起的抗性的認識滯后。期望現在已沒有了這種想法，那么，人們會看到更多有關微生物組抗性的報道，即使它不符合對抗性的現行定義。

盡管存在上述弊端和限制，但似乎有大量證據表明，某些對異生物質和農藥的抗性來源于微生物組，從事害物治理的科研人員應該意識到這種可能性。有證據表明，微生物組生物體在脅迫條件下的種群密度更大?？紤]到氣候的波動和變化所帶來的脅迫，可能會看到更多受微生物組影響的抗性。就像可利用抗生素同時治療來防止哺乳動物腸道或細胞內腫瘤微生物組對藥效的不利影響一樣，可設想在害蟲微生物組中能發(fā)現和開發(fā)防止農藥代謝的增效劑。

利用微生物作為生物防治劑來保護農作物免受害物危害還處于一個較長的起步階段，前景光明，但目前還沒有準備開展大規(guī)模的田間推廣。大多數商業(yè)化的生物防治劑的應用僅限于條件可控的溫室。如何增強它們的毒性，在種植體系中保持所接種有益微生物組的穩(wěn)定種群，并制備有效的制劑，使它們能夠在田間得到有效利用，任重道遠。

筱禾，女，工程師。Tel: 021-64387891-201。

2018-04-12。

10.16201/j.cnki.cn31-1827/tq.2018.02.08

TQ450

A

1009-6485(2018)02-0039-04