劉夏 鐘殿勝

根據(jù)《2018國家癌癥報告》，肺癌依舊高居中國癌癥發(fā)病率及死亡率的第一位。非小細胞肺癌（non small cell lung cancer,NSCLC）占全部肺癌的85%左右，初診時超過60%的患者已失去手術(shù)治療的機會[1]。從2004年表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor,EGFR）基因突變被發(fā)現(xiàn)開始，分子檢測技術(shù)突飛猛進，越來越多的驅(qū)動基因被識別，相應(yīng)的靶向藥物不斷涌現(xiàn)，為驅(qū)動基因陽性NSCLC患者帶來常規(guī)化療無法企及的生存獲益，改變了晚期NSCLC的治療模式[2]。本文針對NSCLC中鼠類肉瘤病毒癌基因同源物B1（v-raf murine sar-coma viral oncogene homolog B1,BRAF）基因突變及靶向治療進展作一綜述。

1 BRAF基因結(jié)構(gòu)與突變類型

BRAF基因是1988年由Ikawa等[3]首先在人類尤文氏肉瘤中發(fā)現(xiàn)并克隆確認的，該基因位于染色體7q34，編碼絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，與CRAF和ARAF具有較高的同源性，在惡性腫瘤形成、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。BRAF蛋白與鼠類肉瘤病毒（kirsten rat sarcoma viral,KRAS）蛋白同為RAS-RAF-絲裂原活化的細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（mitogenactivated extracellular signal-regulated kinase,MEK）-細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases,ERK）信號通路中上游調(diào)節(jié)因子，在絲裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase,MAPK）/ERK信號通路中起著關(guān)鍵作用[4]。RAS-三磷酸鳥苷（guanosinetriphosphate,GTP）與其下游效應(yīng)分子RAF結(jié)合，磷酸化并激活RAF，從而活化RAF下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)MAPK級聯(lián)途徑。RAF蛋白磷酸化并激活下游底物MEK，而MEK磷酸化并激活下游底物ERK，進而調(diào)節(jié)細胞內(nèi)的生物學過程[5,6]。

BRAF基因突變主要位于CR3激酶結(jié)構(gòu)域的第11外顯子及第15外顯子，其中BRAF最常見突變形式為第15外顯子的第1,799位核苷酸上T突變?yōu)锳，導(dǎo)致其編碼的纈氨酸變?yōu)楣劝彼?，即V600E，使BRAF蛋白持續(xù)激活，提高BRAF活性約500倍[5]，激活后的BRAF成為能夠不依賴于上游RAS激酶的單體，導(dǎo)致ERK持續(xù)激活[6]。V600E突變是NSCLC常見的BRAF突變類型（55%），其他常見突變包括G469A（35%）和D594G（10%）等[7,8]。與BRAFV600突變（V600E/K/D/R）相比，其他類型的BRAF突變形成與RAS無關(guān)的同源二聚體，不具有單體活性[6]。

2 BRAF基因突變的臨床特征

BRAF基因突變在人類癌癥的發(fā)生率為8%，主要是在毛細胞白血?。?00%）、黑色素瘤（50%）、甲狀腺乳頭狀癌（45%）等疾病中，NSCLC中突變發(fā)生率為1%-4%[9-11]。NSCLC的BRAF突變的生物學行為和對預(yù)后的影響在一些回顧性研究中多次報道。Marchetti等[8]報告了1,046例手術(shù)切除NSCLC患者的BRAF突變狀態(tài)，應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction,PCR）+高分辨率熔解曲線分析技術(shù)（high-resolution melting analysis,HRMA）檢測，在總體、肺腺癌和肺鱗癌患者中的BRAF突變率分別為3.5%、4.9%和0.3%。其中BRAFV600E突變發(fā)生率為56.8%，突變患者多為女性、不吸煙、含有侵襲性微乳頭成分；非V600E突變者則均有吸煙史。BRAFV600E突變患者較野生型患者，無病生存期（disease free survival,DFS）和總生存期（overall survival,OS）明顯縮短。Luk等[12]針對273例晚期NSCLC患者的BRAF、EGFR和KRAS突變情況進行回顧分析，BRAF突變率為2.6%，且均為EGFR及KRAS野生型，突變患者均有吸煙史，性別分布無差異。V600E突變比例58%，與侵襲性微乳頭成分相關(guān)。而中國肺癌患者的BRAF突變率似乎低于歐美，Li等[13]采用液相芯片方法回顧5,125例中國NSCLC患者基因突變情況，BRAF突變率為0.5%，且全為V600E突變，多見于女性，但與年齡、吸煙史、組織學類型無關(guān)。Ding等[14]對1,680例中國NSCLC患者行擴增阻礙突變系統(tǒng)（amplification refractory mutation system,ARMS）檢測，BRAF突變比例為1.7%，多見于不吸煙、腺癌患者，其中85.7%為V600E突變，BRAF突變型與野生型患者一線化療的無進展生存期（progression-free sirvival,PFS）無統(tǒng)計學差異。Villaruz[15]報道的951例晚期肺腺癌研究顯示，BRAF突變率為2.1%，多見于吸煙患者，其中81%為V600E突變，比較BRAF突變與野生型患者的預(yù)后，未發(fā)現(xiàn)OS差異。Cui等[16]對含有11,711例NSCLC患者的16項研究進行meta分析，BRAF總體突變率為2.6%，與腺癌有顯著相關(guān)性（P＜0.000,1），BRAFV600E突變在女性（P=0.004）和從不吸煙者（P＜0.001）中更常見。上述研究由于人種差異、檢查方法不同，結(jié)果存在不一致，但總的來說，V600E突變是BRAF突變的主要類型，多見于女性、腺癌患者，與預(yù)后的關(guān)系尚不十分明確，部分研究提示與預(yù)后呈負相關(guān)。

3 BRAF V600突變的治療進展

3.1 維羅非尼 維羅非尼作為BRAF特異性抑制劑，2011年被食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration,FDA）批準治療具有BRAFV600E突變的不可切除及轉(zhuǎn)移性惡性黑色素瘤。Hyman等[17]最先報道了維羅非尼在非惡黑惡性腫瘤領(lǐng)域的II期研究（VE-BASKET），這也是首個基于組織學分類的籃子研究，在腫瘤治療領(lǐng)域具有里程碑的意義。全球23個中心共入組BRAFV600突變的非惡黑惡性腫瘤（包括NSCLC 20例以及結(jié)直腸癌、乳腺癌等7個隊列）122例。NSCLC患者應(yīng)用維羅非尼單藥治療，客觀緩解率（objective response rate,ORR）為42%（95%CI: 20%-67%），中位PFS為7.3個月（95%CI:3.5-10.8），12個月OS為66%（95%CI: 36-85），高于其他類型腫瘤。常見不良反應(yīng)有皮疹、乏力和關(guān)節(jié)疼痛（40%）。維羅非尼在這項前瞻性研究中體現(xiàn)出了較好的療效和安全性，BRAFV600突變有望成為NSCLC新的治療靶點。

研究者隨后對NSCLC隊列進行擴展，共納入62例BRAFV600突變患者（包括8例初治患者），均接受維羅非尼單藥治療。最終結(jié)果在2017年美國臨床腫瘤學會（American Society of Clinical Oncology,ASCO）大會報告，經(jīng)治患者ORR為37.0%（95%CI: 24.3%-51.3%），中位PFS為6.1個月（95%CI: 5.1-8.3），中位OS為15.4個月（95%CI: 8.2-22.6）；初治患者的ORR為37.5%（95%CI:8.5%-75.5%），中位PFS可達到12.9個月（95%CI:4.0-NE），中位OS尚未成熟。較經(jīng)治患者而言，初治患者的PFS顯著延長，顯示了維羅非尼具有很好的療效，值得進一步探索。

MyPathway是一個多中心、非隨機、多隊列的IIa期試驗[18]，旨在評估適應(yīng)證以外靶向藥物用于含有特定基因變異腫瘤的療效。入組患者不限瘤種，但必須含有BRAF、HER2、Hedgehog通路等變異，其中BRAF突變采用下一代測序（next generation sequencing,NGS）檢測，突變患者接受維羅非尼單藥治療。研究共入組251例患者，覆蓋35種不同腫瘤類型，包括BRAF突變NCSLC患者21例，其中V600突變（均為V600E突變）14例，皆為復(fù)發(fā)患者。BRAFV600E突變患者的療效與VE-BASKET研究及ACSE研究[19]結(jié)果較為一致，ORR 43%，中位緩解持續(xù)時間（duration of response,DOR）5個月，而非BRAFV600突變者的總體人群有效率只有4%。目前，該研究仍在繼續(xù)，由于BRAF非V600突變患者療效較差，BRAF突變隊列中將不再入組該類患者。

上述幾項研究，證實了籃子試驗的潛在價值，維羅非尼用于含BRAFV600這一低頻突變的NSCLC，顯現(xiàn)出令人鼓舞的療效，后續(xù)研究的結(jié)果值得期待。

3.2 達拉非尼±曲美替尼 達拉非尼作為另一種BRAF抑制劑，是FDA繼維羅非尼后批準的第二個治療伴有BRAFV600E突變的轉(zhuǎn)移性黑色素瘤的靶向藥物。Planchard教授團隊開展了一項達拉非尼單藥或聯(lián)合用于晚期BRAFV600E突變NSCLC（BRF 113928）的II期試驗，結(jié)果令人欣喜。研究分為兩個階段。第一階段對經(jīng)治BRAFV600E突變的NSCLC患者行達拉非尼單藥治療，其中8例評效PR，ORR為40%（8/20），達到主要終點，成功啟動第二階段研究。

在第二階段，分為以下三個隊列進行評估：達拉菲尼單藥組（隊列A），達拉非尼與曲美替尼聯(lián)合治療經(jīng)治患者組（隊列B）及達拉非尼與曲美替尼聯(lián)合治療初治患者組（隊列C）。

在隊列A中，達拉菲尼單藥治療84例BRAFV600E突變晚期NSCLC患者（其中78例為經(jīng)治患者），ORR為33%（95%CI: 23%-45%），DCR為58%（95%CI:46%-67%），DOR為9.6個月（95%CI: 5.4-15.2）[20]。6例一線治療患者的療效更為突出，4例獲得PR，PFS分別為4.5個月、8.6個月、11.0個月和16.6個月。達拉非尼成為首個在BRAF突變的NSCLC前瞻性研究中顯示有活性的藥物。嚴重不良反應(yīng)見于42%的患者，其中皮膚鱗狀細胞癌、乏力和基底細胞癌最為常見。

曲美替尼是MEK 1/2可逆性抑制劑，主要通過對MEK蛋白的作用，影響MAPK通路，抑制細胞增殖。在BRAFV600E突變或BRAFV600K突變的晚期黑色素瘤患者中，針對BRAF突變和MEK蛋白的達拉非尼聯(lián)合曲美替尼的雙重MAPK途徑抑制治療，對比達拉非尼單藥，ORR分別為69%和53%，PFS分別為11.0個月和8.8個月（P＜0.01）[21]。體外研究證實，MEK-TKI曲美替尼單藥對BRAFV600E突變NSCLC細胞系中有效[22]。沿用黑色素瘤的成功經(jīng)驗，隊列B中，給予經(jīng)治晚期BRAFV600E突變NSCLC患者達拉非尼聯(lián)合曲美替尼治療，ORR為67%（95%CI: 53%-79%），中位PFS為9.7個月（95%CI:6.7-16.6），6個月OS為82%[23]。這兩藥的組合，出現(xiàn)嚴重不良反應(yīng)者占比56%，其中發(fā)熱最為常見（16%），其他包括貧血、精神異常、惡心及皮膚鱗狀細胞癌等。基于以上結(jié)果，歐盟委員會及美國FDA于2017年4月及6月相繼批準達拉非尼聯(lián)合曲美替尼用于BRAFV600突變晚期或轉(zhuǎn)移性NSCLC患者[24]。

該聯(lián)合方案繼續(xù)用于初治晚期BRAFV600E突變NSCLC患者（隊列C）[25]，經(jīng)過中位15.9個月隨訪，ORR為64%（95%CI: 46%-79%），DCR為75%（95%CI:58%-88%），中位PFS為10.9個月（95%CI: 7.0-16.6），中位OS為24.6個月（95%CI: 12.3-未達到），遠遠優(yōu)于傳統(tǒng)化療。3/4級不良反應(yīng)占比56%，包括發(fā)熱、嘔吐、轉(zhuǎn)氨酶升高、低血壓等，與傳統(tǒng)化療相比，耐受性好。在BRAFV600E突變轉(zhuǎn)移性NSCLC患者的一線治療中，達拉非尼聯(lián)合曲美替尼具有優(yōu)異的療效，可管理的安全性，使得BRAFV600E成為轉(zhuǎn)移性NSCLC的第四個基因組生物標志物，寫入美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)（National Comprehensive Cancer Network,NCCN）指南，這是肺癌靶向治療領(lǐng)域又一重要的里程碑。

2018年5月前后1周內(nèi)，美國FDA先后批準達拉非尼與曲美替尼聯(lián)合治療用于治療無法手術(shù)切除的BRAFV600E突變陽性的晚期甲狀腺未分化癌，以及用于BRAFV600突變的III期黑色素瘤患者的術(shù)后輔助治療[26]，這一強強組合在肺癌輔助治療領(lǐng)域是否能夠爭得一席之地，值得期待。

3.3 其他藥物 在歐洲EURAF回顧性多中心隊列研究中[27]，晚期BRAF突變肺癌患者絕大多數(shù)經(jīng)歷過一線化療。靶向用藥包括維羅非尼、達拉非尼或索拉非尼。在BRAF突變中，V600E占83%，ORR為53%，PFS和OS分別為5個月和10.8個月。接受索拉非尼治療的1例患者達到PR。

4 BRAF非V600突變的治療進展

BRAF抑制劑可有效抑制V600突變單體，而在非V600突變的二聚體中，藥物只能結(jié)合其中一個位點，顯著降低對第二位點的親和力及對下游ERK的抑制作用。因此，從理論上來講，BRAF非V600突變的腫瘤對BFAF抑制劑不敏感，體外實驗也驗證了這一點[6]。在歐洲EURAF隊列研究中，6例NSCLC患者為BRAF非V600E突變，PFS及OS遠遠低于V600E突變患者；但是，1例G596V突變患者應(yīng)用維羅非尼獲得了PR。作者認為，位于BRAF激酶的活化區(qū)域之內(nèi)（密碼子596-600）突變可能對BRAF抑制劑敏感[27]。另外，BRAF非V600E突變常常與RAS突變同時存在[28]，也可能是耐藥的原因之一。

在黑色素瘤的臨床研究中，BRAF非V600E突變者對BRAF抑制劑耐藥，但對MEK抑制劑有效。在NSCLC細胞系的研究發(fā)現(xiàn)，單藥曲美替尼在BRAF非V600E突變細胞系可上調(diào)AKT信號通路，提示該細胞系對單藥MEK抑制劑耐藥；當應(yīng)用曲美替尼聯(lián)合維羅非尼處理細胞系時，AKT通路沒有上調(diào)，提示在BRAF非V600E突變的細胞系，聯(lián)合治療可能優(yōu)于單藥曲美替尼[29]。Chen等[30]發(fā)現(xiàn)，BRAF缺失細胞對BRAF抑制劑維羅非尼耐藥但對RAF二聚體抑制劑LY3009120敏感。在BRAF缺失的腫瘤模型中，LY3009120使腫瘤生長退化。對于BRAF缺失或BRAF作為二聚體發(fā)揮功能的其他非典型BRAF突變的患者來說，LY3009120是一種潛在的治療選擇。目前，尚未檢索到MEK抑制劑靶向治療BRAF非V600E突變型NSCLC的臨床研究結(jié)果。

5 BRAF抑制劑耐藥機制及耐藥后策略

BRAF抑制劑對BRAFV600E突變的NSCLC患者療效確切，但大部分患者不可避免會產(chǎn)生耐藥。黑色素瘤中BRAF抑制劑的耐藥機制較為明確，原發(fā)耐藥機制主要包括：RAC1突變、PTEN缺失、細胞周期蛋白調(diào)控紊亂和微環(huán)境的變化等。繼發(fā)耐藥機制分為依賴MAPK/ERK通路及不依賴MAPK/ERK通路兩種，前者包括NRAS體細胞激活突變，BRAF蛋白激酶的截斷、擴增或融合，MEK繼發(fā)突變激活ERK、BRAF擴增等；后者包括RTK過度表達，PI3K/AKT信號通路活性上調(diào)等[31-33]。在結(jié)直腸癌，盡管5%-8%患者攜帶BRAFV600突變，但對BRFA抑制劑原發(fā)耐藥，機制可能與EGFR途徑激活MAPK信號通路有關(guān)。

BRAF抑制劑在NSCLC的耐藥機制尚未完全闡明。為探討B(tài)RAFV600E突變NSCLC對達拉非尼的繼發(fā)耐藥原因，Kim等[34]用MV522 NSCLC細胞（V600E）建立達拉非尼耐藥（GSR）細胞株，之后用達拉非尼作用于GSR細胞，發(fā)現(xiàn)該細胞EGFR上調(diào)，激活EGFR-RAS-CRAF通路，并持續(xù)激活ERK1/2，增強EGFR介導(dǎo)的RAS活性，導(dǎo)致BRAF-CRAF二聚體的形成和CRAF的反式激活。研究者發(fā)現(xiàn)，ERK1/2的持續(xù)激活部分依賴于受體相互作用蛋白激酶-2（receptor interacting protein kinase-2,RIP2）的活性，但不依賴MEK1/2的活性。BRAF和EGFR抑制劑聯(lián)合應(yīng)用，可阻斷ERK信號的再激活，體外和體內(nèi)試驗中均可增加療效，可嘗試對BRAF繼發(fā)耐藥的NSCLC（V600E）患者聯(lián)合應(yīng)用BRAF和EGFR抑制劑治療。

Abravanel[35]報道1例62歲的女性晚期肺腺癌患者，腫瘤組織PD-L1表達90%，采用＞400個腫瘤相關(guān)基因的NGS測序提示，組織及血漿均存在BRAFV600E突變。患者一線化療及二線帕母單抗治療后，疾病進展，應(yīng)用達拉非尼聯(lián)合曲美替尼，靶病灶PR，然而，在21周后，肺部及胸部出現(xiàn)新發(fā)病灶。胸壁結(jié)節(jié)的切除活檢證實為轉(zhuǎn)移性肺腺癌，組織和血漿的二次檢測顯示，除了原始的BRAFV600E突變外，還繼發(fā)了NRAS q61k突變，提示顯性/克隆性耐受機制。在NSCLC中聯(lián)合應(yīng)用BRAF和MEK抑制劑的情況下，耐藥是否與克服MAPK通路的抑制有關(guān)，比如激活其他RAF家族成員或激活PI3K通路，有待進一步研究。

關(guān)于耐藥后策略，科學家也進行了一系列探索。Comunanza[36]團隊發(fā)現(xiàn)，在BRAF突變小鼠模型，BRAF和VEGF的聯(lián)合抑制導(dǎo)致腫瘤凋亡、持久的腫瘤反應(yīng)、肺定植減少并延遲對BRAF抑制劑plx 4720的獲得性耐藥。Xue等[33]發(fā)現(xiàn)ERK抑制劑與RAF、MEK抑制劑間歇應(yīng)用于小鼠肺及黑色素瘤移植瘤模型的協(xié)同作用，認為這種給藥方式值得耐藥患者嘗試。Smida等[37]毛細血管擴張性共濟失調(diào)癥突變（ataxia telangiectasia-mutation,ATM）的丟失會增強KRAS或BRAF突變型肺癌細胞對MEK抑制的敏感性，因此，肺癌的ATM突變狀態(tài)可能成為MEK抑制劑應(yīng)答的生物標志物。Ross等[38]在體外研究中證實，絲氨酸生物合成是腫瘤細胞對BRAF抑制劑耐藥的關(guān)鍵因素，同時，也驗證了吉西他濱預(yù)處理可作為NSCLC細胞系對維羅非尼或達拉非尼耐藥的敏化步驟。

6 小結(jié)

BRAF基因突變不僅是EGFR-TKI耐藥后的機制之一，亦是原發(fā)致癌驅(qū)動基因及靶向治療的重要靶點。BRAF抑制劑及MEK抑制劑在BRAFV600E突變NSCLC患者中成效顯著，已被寫入NCCN指南。但在BRAF抑制劑耐藥之后，需要更多相關(guān)研究為我們提供治療策略。未來，隨著基因檢測技術(shù)的飛速發(fā)展及分子生物學的不斷進步，相信針對BRAF基因在NSCLC治療、預(yù)后等方面的研究會有更大進步。