周皖舒 陶周善

1. 皖南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院老年病科，安徽 蕪湖 241000 2. 皖南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，弋磯山醫(yī)院創(chuàng)傷骨科，安徽 蕪湖 241000

人口老齡化是當(dāng)今世界一個(gè)突出性的社會(huì)問題，作為與其相關(guān)的疾病越來越引起世界的關(guān)注，骨質(zhì)疏松就是其中最常見的一種。由于骨吸收的增加或骨形成的減少，在這種重塑過程中的不平衡導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥，容易出現(xiàn)脆性骨折，主要包括髖部、脊椎、前臂以及肱骨骨折，是骨質(zhì)疏松癥最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一[1]。對(duì)于骨質(zhì)疏松癥合并髖部骨折的患者，約30%的患者經(jīng)歷了髖骨骨折的肢體功能減退或者喪失[2]，超過20%的患者在骨折后6～12個(gè)月內(nèi)死亡[3]。 隨著亞洲老齡人口的增加，該地區(qū)髖部骨折的發(fā)病率預(yù)計(jì)將從1990年到2050年增加到世界總量的1/4左右[4-5]。此外，一半的亞洲老年人口是中國人，占世界老年人口的20%。因此，對(duì)中國來說，預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松癥是一項(xiàng)嚴(yán)重的挑戰(zhàn)[6]。但目前對(duì)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的治療仍然不夠有效。近年來的研究已經(jīng)證明，辛伐他汀(simvastatin，SIM)還能提高骨密度，促進(jìn)成骨、增加松質(zhì)骨骨量及抑制骨吸收的作用[7]。近年來，流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)阿司匹林(aspirin，ASP)可提高老年人的骨密度[8]，這表明其可以用來治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥。近年的研究表明SIM及ASP都是促進(jìn)成骨及抑制破骨來治療骨質(zhì)疏松的，這表明SIM聯(lián)合ASP有疊加促進(jìn)骨質(zhì)疏松癥的潛力。鑒于此，是否SIM聯(lián)合ASP治療骨質(zhì)疏松癥具有優(yōu)于單獨(dú)治療骨質(zhì)疏松癥的潛力，因此本文研究SIM聯(lián)合ASP刺激成骨細(xì)胞，觀察其對(duì)成骨細(xì)胞增殖分化的影響，探討其對(duì)骨質(zhì)疏松癥治療的可行性細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞來源

取出生24 h的SD大乳鼠作為原代成骨細(xì)胞來源，由皖南醫(yī)學(xué)院弋磯山醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

ASP(AstraZeneca公司)，SIM(默沙東，美國)，DMEM 培養(yǎng)基(GIBCO公司)，胎牛血清、胰蛋白酶(HyClone公司)；I 型膠原酶(Sigma公司)；噻唑藍(lán)(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)、TritonX-100(Sigma公司)。

1.3 成骨細(xì)胞傳代培養(yǎng)

大鼠成骨細(xì)胞培養(yǎng)液使用DMEM，含有10%小牛血清，青霉素(100 U/mL)，鏈霉素(100 U/mL)，細(xì)胞培養(yǎng)在 37 ℃、含5%的二氧化碳培養(yǎng)箱中，待細(xì)胞生長(zhǎng)覆蓋瓶底80%時(shí)進(jìn)行傳代。

1.4 ASP及 SIM共培養(yǎng)對(duì)成骨細(xì)胞的影響

1.4.1采用MTT法檢測(cè)成骨細(xì)胞增殖情況：實(shí)驗(yàn)分為4組：ASP組、SIM組、ASP-SIM組及對(duì)照組(CON)。用0.25%胰蛋白酶消化單層細(xì)胞，用含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)液配成單個(gè)細(xì)胞懸液，以每孔1×104個(gè)細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，共4列，培養(yǎng)24 h。在倒置顯微鏡下觀察，待大多數(shù)成骨細(xì)胞貼壁伸展后，棄去孔內(nèi)液體，用無血清的DMEM沖洗數(shù)次，加1% FBS 的DMEM 200 μL。一列孔加入2 mmol/L的ASP(ASP組)，一列孔加入1 mmol/L的SIM(SIM組)，一列孔同樣加入2 mmol/L的ASP，24 h后再加入1 mmol/L的SIM (ASP-SIM組)，一列孔為對(duì)照組，不加誘導(dǎo)液，3 d 換液1次，繼續(xù)培養(yǎng)到7 d。加入10% MTT 溶液(5 mg/mL)繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞 2 h，棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，并加入DMSO(100 μL/孔)輕微震蕩，采用比色法通過酶標(biāo)儀檢測(cè)A 490值。

1.4.2茜素紅染色及堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)活性測(cè)定：待上述成骨細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)7 d棄培養(yǎng)液，PBS漂洗2 遍，加入10% 福爾馬林固定10 min。棄固定液，0.1%茜素紅在37 ℃下染色5 min，流水沖洗，流水沖洗后換固定液，拍照記錄結(jié)果。ALP活性采用 PNPP 法測(cè)定，細(xì)胞培養(yǎng)7 d棄培養(yǎng)液，PBS漂洗2 遍，1%Triton X-100 反復(fù)凍融3次，細(xì)胞裂解物孵育在磷酸鹽底物中30 min，室溫37 ℃，然后加入1 mol/L的NaOH 終止反應(yīng)，405 nm下測(cè)定吸光度值。根據(jù)蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)化的Sigma 校正曲線，計(jì)算酶活性。

1.4.3成骨細(xì)胞OCN及Runx2的表達(dá)檢測(cè)：按上述方案培養(yǎng)到7 d，提取細(xì)胞總蛋白，加熱變性后，于-20 ℃保存。取蛋白30 μL，進(jìn)行 SDS-PAGE 凝膠電泳，將分離后的蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用封閉液封閉濾膜4 h，依次結(jié)合相應(yīng)濃度的抗OCN抗體，抗Runx2抗體和抗GAPDH抗體(1∶1000)，于4 ℃孵育過夜，洗膜后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔/兔抗鼠(1∶2000)，孵育1 h。用化學(xué)發(fā)光法曝光膠片，沖洗顯色，檢測(cè)相應(yīng)蛋白條帶。用凝膠成像分析系統(tǒng)掃描分析蛋白條帶。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，多組間細(xì)胞蛋白含量、ALP定量及茜素紅定量結(jié)果采用單因素方差分析(ANOVA)，組間比較采用 LSD-t法；P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 茜素紅染色及堿性磷酸酶活性

經(jīng)過ASP、SIM以及ASP聯(lián)合SIM的處理，各組細(xì)胞茜素紅染色及堿性磷酸酶染色的結(jié)果如圖1A、1B所示，定量結(jié)果如圖1C、1D所示，結(jié)果表明ASP、SIM以及ASP聯(lián)合SIM的處理的成骨細(xì)胞的礦化能力及活性明顯增加，相對(duì)于對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組的成骨細(xì)胞礦化能力及ALP活性明顯增加，和對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且以ASP聯(lián)合SIM處理細(xì)胞鈣化能力最強(qiáng)及ALP活性最高，這表明ASP聯(lián)合SIM對(duì)成骨細(xì)胞礦化能力及活性影響明顯優(yōu)于單獨(dú)使用的效果。

2.2 共培養(yǎng)對(duì)成骨細(xì)胞增殖的影響

經(jīng)過ASP、SIM以及ASP聯(lián)合SIM的處理，MTT檢測(cè)的結(jié)果如圖1E所示，相對(duì)于對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組的成骨細(xì)胞數(shù)目明顯增加，和對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且以ASP聯(lián)合SIM處理細(xì)胞數(shù)目最多，這表明ASP聯(lián)合SIM對(duì)成骨細(xì)胞增殖影響明顯優(yōu)于單獨(dú)使用的效果。

2.3 成骨細(xì)胞OCN及Runx2的表達(dá)

經(jīng)過ASP、SIM以及ASP聯(lián)合SIM的處理，各組細(xì)胞OCN及Runx2蛋白表達(dá)的結(jié)果如圖1F所示，定量結(jié)果如圖1G、1H所示，結(jié)果表明ASP、SIM以及ASP聯(lián)合SIM處理的成骨細(xì)胞的OCN及Runx2蛋白表達(dá)明顯增加，相對(duì)于對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組的成骨細(xì)胞OCN及Runx2蛋白表達(dá)明顯增加，和對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且以ASP聯(lián)合SIM處理細(xì)胞OCN及Runx2蛋白表達(dá)量最多，這表明ASP聯(lián)合SIM對(duì)成骨細(xì)胞OCN及Runx2蛋白表達(dá)影響明顯優(yōu)于單獨(dú)使用的效果。

3 討論

本研究通過ASP聯(lián)合SIM使用來干預(yù)大鼠成骨細(xì)胞，觀察對(duì)成骨細(xì)胞增殖、鈣化能力及細(xì)胞活性和OCN及Runx2蛋白表達(dá)情況來研究聯(lián)合使用的可行性，通過藥物和成骨細(xì)胞共培養(yǎng)7 d，各組大鼠成骨細(xì)胞增殖情況、礦化能力及活性以O(shè)CN及Runx2蛋白表達(dá)情況被檢測(cè)。結(jié)果表明相對(duì)ASP及SIM單獨(dú)使用的效果，聯(lián)合使用的效果更佳，能極大提高成骨細(xì)胞增殖能力，增加成骨細(xì)胞的功能如礦化，同時(shí)明顯增加OCN及Runx2蛋白表達(dá)，這些結(jié)果表明ASP聯(lián)合SIM來干預(yù)大鼠成骨細(xì)胞有一定潛力，為臨床上聯(lián)合使用治療骨質(zhì)疏松癥提供細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)。

辛伐他汀屬于3-羥基-3甲基戊二酰輔酶A(HMG-COA)還原酶抑制劑，能減少膽固醇合成及穩(wěn)定動(dòng)脈粥樣硬化斑塊、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等作用[9]。近年來的研究已經(jīng)證明，SIM還能提高骨密度，促進(jìn)成骨、增加松質(zhì)骨骨量及抑制骨吸收的作用[7]。體外實(shí)驗(yàn)表明SIM可誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，改善人或動(dòng)物成骨細(xì)胞系的成骨[10-11]。此外，已經(jīng)證明他汀類通過上調(diào)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子2(fibroblast growth factor-2，F(xiàn)GF-2)的基因表達(dá)來增強(qiáng)血管生成[12]，同時(shí)VEGF和FGF-2都能間接誘導(dǎo)BMP-2的表達(dá)來刺激成骨細(xì)胞增殖分化來促進(jìn)成骨[11]。SIM已被證明對(duì)體內(nèi)骨形成和骨礦物質(zhì)密度具有積極作用[13]，進(jìn)一步研究表明局部應(yīng)用SIM可以促進(jìn)去卵巢大鼠的骨折愈合[14]。這些研究表明他汀類藥物對(duì)骨質(zhì)疏松癥的防治有巨大的潛力。

阿司匹林作為一種經(jīng)典的解熱鎮(zhèn)痛藥，由于其有抗凝血、消炎等作用，從而應(yīng)用于心腦血管疾病中，降低心腦血管疾病的發(fā)生率及死亡率。近年來，流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)阿司匹林可提高老年人的骨密度[8]，這表明其可以用來治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)阿司匹林可以有效促進(jìn)大鼠絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松骨小梁的改建，改善骨小梁的三維結(jié)構(gòu)，增加骨質(zhì)的骨密度[15]。有研究表明阿司匹林還可以促進(jìn)去勢(shì)大鼠骨質(zhì)疏松性骨折愈合，增加骨質(zhì)的骨密度和生物力學(xué)強(qiáng)度[16]，主要通過抑制骨吸收及刺激骨形成發(fā)揮作用。同時(shí)阿司匹林是一種老藥，不但副作用較少、廉價(jià)，而且治療疾病的范圍廣，同時(shí)在治療骨質(zhì)疏松癥方面有著獨(dú)特的潛力。

在患有嚴(yán)重骨質(zhì)疏松癥的患者中，抗骨質(zhì)疏松癥的聯(lián)合療法比單獨(dú)的每種療法預(yù)期可以更好地改善骨礦物質(zhì)密度。阿司匹林和辛伐他汀在治療心血管疾病方面有著良好的表現(xiàn)，兩者都能通過促進(jìn)成骨抑制骨吸收來提高骨密度，這些結(jié)果似乎可以得到一個(gè)假設(shè)，阿司匹林聯(lián)合辛伐他汀使用可以影響成骨細(xì)胞的增殖分化來促進(jìn)成骨。本研究證實(shí)了這個(gè)假設(shè)，ASP聯(lián)合SIM能極大提高成骨細(xì)胞的增殖能力，增加成骨細(xì)胞的功能如礦化，同時(shí)明顯增加OCN及Runx2蛋白的表達(dá)，這些結(jié)果表明ASP聯(lián)合SIM來干預(yù)大鼠成骨細(xì)胞有一定潛力，從成骨細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)上證實(shí)其聯(lián)合治療骨質(zhì)疏松癥的可行性。