曾 貞，孫 恒*，陳駿飛，徐天才，王宇萍，李 坤，康平德**，胡 強(qiáng)

(1.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 高山經(jīng)濟(jì)植物研究所，云南 麗江 674199；2.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 熱區(qū)生態(tài)農(nóng)業(yè)研究所，云南 元謀 651300；3.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，云南 昆明 650000)

鐵皮石斛(DendrobiumofficinaleKimura et Migo)為蘭科(Orchidaceae)石斛屬(Dendrobium)多年生附生草本植物，主要分布在我國(guó)云貴、兩廣、浙江、湖南等地區(qū)[1]。有研究表明：鐵皮石斛含有豐富的多糖、芪類、黃酮、多酚等多種化學(xué)成分[2-5]?！吨袊?guó)藥典》記載：具有益胃生津，滋陰清熱之功效；用于熱病津傷，口干煩渴等癥[6]。現(xiàn)代藥理學(xué)認(rèn)為：鐵皮石斛多糖具有提高機(jī)體免疫能力[7]、抗氧化[8]、抗疲勞[9]、抗腫瘤[10]等藥理活性。多糖作為評(píng)價(jià)鐵皮石斛質(zhì)量的指標(biāo)性成分，對(duì)其含量預(yù)測(cè)具有重要意義。

傅里葉變換紅外光譜(FTIR)為分子振-轉(zhuǎn)光譜，能夠提供豐富的峰位、峰強(qiáng)和峰形信息，具有加合性，反映藥材整體質(zhì)量，克服單方面定性和定量研究的不足，有紅外光譜指紋圖譜和全息光譜之稱特征性強(qiáng)、快速、無損和簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，能夠反映樣品化學(xué)成分整體信息[11]，Luís M等[12]基于傅里葉變換近紅外光譜對(duì)廢棄咖啡中咖啡因、咖啡酸、兒茶酸、綠原酸和茶堿的定量分析，結(jié)果偏最小二乘回歸分析(PLSR)模型預(yù)測(cè)集相關(guān)系數(shù)Rp2分別為0.95、0.92、0.88、071、0.84，表明能良好預(yù)測(cè)廢棄咖啡中相關(guān)成分含量，Daniela等[13]用FTIR鑒別塑料、薄膜和泡沫，結(jié)果顯示：PCA分析能很好地區(qū)分3種樣品；楊天偉等[14]用FTIR建立馬氏距離分類模型及偏最小二乘判別分析快速鑒別不同種類牛肝菌，結(jié)果顯示：MSC+SD+ND(15∶5)和SNV+SD+ND(15∶5)2種預(yù)處理的驗(yàn)證集和預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率分別為90%和95%，此外，紅外光譜還廣泛運(yùn)用于食品[15-16]和中藥[17]的鑒定及預(yù)測(cè)分析中。紫外光譜為電子光譜，常用于水質(zhì)[18]、食用油[19]、飲料[20]、中藥[21]的定量測(cè)定及質(zhì)量控制分析，但其操作繁雜，存在化學(xué)污染。

本研究運(yùn)用紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定不同采收時(shí)間的樣品粗多糖吸光度，同時(shí)使用紅外光譜采集樣品光譜數(shù)據(jù)，擬合紫外、紅外數(shù)據(jù)，用FTIR結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)對(duì)鐵皮石斛多糖進(jìn)行了快速預(yù)測(cè)。建立快速的鐵皮石斛粗多糖預(yù)測(cè)模型，為企業(yè)采收鐵皮石斛和生產(chǎn)線石斛多糖質(zhì)量控制提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

選取種源相同的鐵皮石斛種苗，并經(jīng)筆者反復(fù)核實(shí)鑒定為鐵皮石斛(Dendrobiumofficinale)，2011年4月定植于玉溪市紅塔區(qū)祥馨農(nóng)產(chǎn)品種植基地，2014年1～12月的每月15日采收鮮條，60 ℃鼓風(fēng)干燥5 d，粉碎過60目篩備用。

1.2 儀器與試劑

Perkin-Elmer Fronter型傅里葉紅外光譜儀，DTGS檢測(cè)器，光譜范圍4000～400 cm-1，分辨率4 cm-1，信號(hào)累加掃描16次。壓片機(jī)為YP-2(上海山岳科學(xué)儀器儀器公司)。UV─2550雙通道紫外可見分光光度計(jì)，配有UVprobe工作站使用說明書，由日本島津公司生產(chǎn)。KBr為分析純，購(gòu)于天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司。H2SO4為分析純，購(gòu)于成都市科龍化工試劑廠。CH3CH2OH(無水乙醇)，為分析純，購(gòu)于西隴化工股份有限公司。無水葡萄糖超純級(jí)CAS:50-99-7，購(gòu)于Sigma-Aldrich公司。C6H5OH(苯酚)為分析純，購(gòu)于西隴化工股份有限公司。

1.3 紅外光譜掃描

取樣品與KBr粉末(1∶100)混合研磨均勻，壓制均勻成透明薄片，放入紅外光譜儀中測(cè)定。紅外光譜采集過程中室溫保持在25 ℃，空氣相對(duì)濕度保持在40%～48%。

1.4 鐵皮石斛總多糖的測(cè)定方法

1.4.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液制備 取無水葡萄糖對(duì)照品18 mg，精密稱取，加水定容制成90 μg/mL的溶液。

1.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作 精密量取標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1～1.0 mL分別放置于試管中，用移液槍補(bǔ)超純水至1.0 mL，加5%苯酚1 mL，搖勻，加硫酸5 mL搖勻，沸水水浴20 min，取出，冷水浴5 min，以相應(yīng)試劑為空白，進(jìn)UV─2550紫外光度計(jì)，測(cè)量吸光度，對(duì)比樣品和標(biāo)準(zhǔn)品，確定最適吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4.3 樣品多糖溶液制備 取過60目篩的樣品粉末(0.0600±0.0001) g，加超純水30 mL水浴超聲2 h，過濾，取濾液2 mL，加無水乙醇至20 mL，冷卻過夜12 h，4000 r/min離心20 min，棄上清液，加80%乙醇溶液至20 mL洗滌除去單糖影響，4000 r/min離心10 min，棄上清液，水浴揮干乙醇，加水定容至40 mL，即得。

1.4.4 樣品多糖含量測(cè)量 用移液槍精密移取0.5 mL樣品溶液置于試管(50 mL具塞試管)中，精密加入5%苯酚溶液1 mL，搖勻，加入硫酸5 mL，依上述方法測(cè)定吸光度，計(jì)算得粗多糖含量。

1.4.5 方法學(xué)考察 (1)重復(fù)性試驗(yàn)精取5份某一樣品配制溶液取0.5 mL，按1.4.2操作，測(cè)定吸光度，計(jì)算吸收波長(zhǎng)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，考察其精密度。

(2)穩(wěn)定性試驗(yàn)精取某一樣品溶液0.5 mL，按1.4.2操作，分別在0、1、2、3、4 h測(cè)定吸光度，計(jì)算吸收波長(zhǎng)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，考察其穩(wěn)定性。

(3)精密度試驗(yàn)精取某一樣品溶液0.5 mL,按1.4.2操作，重復(fù)5次測(cè)量吸光度，計(jì)算吸收波長(zhǎng)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，考察其精密度。

1.5 數(shù)據(jù)預(yù)處理及建立預(yù)測(cè)模型

運(yùn)用UV-2550雙通道紫外可見分光光度計(jì)自帶的UVprobe工作站選擇數(shù)據(jù)，在Excel 2003軟件中做出標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=0.0079x+0.027，R2=0.9995；利用回歸方程結(jié)合樣品吸光度計(jì)算樣品中總多糖含量，進(jìn)行方法學(xué)考察。使用OMNIC軟件對(duì)紅外光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行基線校正，縱坐標(biāo)歸一化等預(yù)處理。導(dǎo)入SIMCA-P+11.5軟件進(jìn)行Savitsky-Golay平滑(SG)、一階導(dǎo)數(shù)(First Derivation，1D)、二階導(dǎo)數(shù)(Second Derivative，2D)、標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變量校正(Standard Normal Variable，SNV)、多元散射校正(Multiplicative Signal Correction，MSC)、正交信號(hào)校正(Orthogonal Signal Correction，OSC)等組合處理，進(jìn)行偏最小二乘回歸建模。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品紅外光譜分析

根據(jù)1.3中的試驗(yàn)方法，掃描樣品的傅里葉紅外光譜，從圖1可以看出：1～12月，鐵皮石斛在不同采收月份的原始圖譜特征峰相似，采收的鐵皮石斛的峰位置一致，峰高存在差異，意味著化學(xué)成分一致，但含量有所不同。其中3400 cm-1附近主要為O-H伸縮振動(dòng)；2924 cm-1附近主要為烷烴C-H的伸縮振動(dòng)；1800～1500 cm-1波段主要包括C=C、C=O、C=N等伸縮振動(dòng)以及苯環(huán)的碳骨架環(huán)內(nèi)振動(dòng)；1500～1300 cm-1波段信息主要代表了C-H的彎曲振動(dòng)；1300～910 cm-1波段是單鍵的伸縮震動(dòng)區(qū)以及部分含氫基團(tuán)的彎曲振動(dòng)；910 cm-1以下波段主要包括苯環(huán)面外彎曲振動(dòng)與環(huán)彎曲振動(dòng)，烯的碳?xì)鋸澢駝?dòng)等。紅外光譜記錄了樣品中多糖類化合物O-H、C=O、C=C、苯環(huán)等多種鍵位的化學(xué)信息，這為利用紅外光譜對(duì)鐵皮石斛中總多糖進(jìn)行快速預(yù)測(cè)提供了理論基礎(chǔ)[11,22]。

圖1 鐵皮石斛樣品的紅外光譜

2.2 多糖含量計(jì)算

按1.4條件下采集鐵皮石斛樣品、樣品+葡萄糖、葡萄糖的紫外光譜，比對(duì)可以發(fā)現(xiàn)，3者在488 nm附近有共有吸收峰，且樣品中加入葡萄糖后吸收光度變化明顯。因此，本試驗(yàn)采用488 nm為總多糖定量波長(zhǎng)。葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品吸光度與濃度的回歸方程為y=0.0079x+0.027，相關(guān)系數(shù)R2=0.9995，線性關(guān)系良好。方法學(xué)考察精密度、重現(xiàn)性和穩(wěn)定性，結(jié)果表明，RSD分別為0.2%、0.31%和1.3%，表明該方法穩(wěn)定、可靠。采集樣品紫外光譜，記錄488 nm處吸光度值，結(jié)合葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品回歸方程計(jì)算12個(gè)月份鐵皮石斛中總多糖含量見表1。結(jié)果顯示所有樣品中，1～5月和12月樣品含量較高，平均含量均大于0.28 g/g，含量值高的月份正好與傳統(tǒng)采收期吻合，這與李彩霞等[23]對(duì)鐵皮石斛中多糖含量的積累研究結(jié)論相符。5月份以后多糖含量逐漸下降，可能是因?yàn)殍F皮石斛屬于有性繁殖，其開花結(jié)實(shí)過程消耗了多糖[24]，筆者從前期所做工作中推測(cè)可能存在多糖消耗轉(zhuǎn)化為黃酮的代謝途徑?？偠嗵呛孔兓厔?shì)為先升高后降低；同時(shí)，5月份多糖含量的標(biāo)準(zhǔn)差數(shù)值最大，亦表示此時(shí)期為鐵皮石斛生長(zhǎng)周期中的劇烈時(shí)期，個(gè)體差異最大；6～8月含量最低。與鐵皮石斛開花結(jié)籽時(shí)間相符。

2.3 偏最小二乘回歸對(duì)總多糖含量預(yù)測(cè)與結(jié)果分析

預(yù)處理鐵皮石斛紅外光譜數(shù)據(jù)設(shè)為X變量，總多糖含量數(shù)據(jù)設(shè)為Y變量，利用偏最小二乘回歸算法建立總多糖含量的回歸預(yù)測(cè)模型。隨機(jī)選取訓(xùn)練集∶預(yù)測(cè)集=2∶1訓(xùn)練集數(shù)據(jù)用于總多糖含量預(yù)測(cè)模型的建立，預(yù)測(cè)集數(shù)據(jù)對(duì)模型預(yù)測(cè)能力進(jìn)行驗(yàn)證。

在預(yù)處理的基礎(chǔ)上，對(duì)光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行一階與二階導(dǎo)數(shù)處理，Savitsky-Golay平滑5點(diǎn)(SG5)、9點(diǎn)(SG9)、15點(diǎn)(SG15)。紅外光譜數(shù)據(jù)作為X變量，鐵皮石斛中總粗多糖含量作為Y變量，正交信號(hào)校正(OSC)去除X變量中與Y變量相關(guān)性較低的數(shù)據(jù)，SG平滑可以有效平滑高頻噪音，提高信噪比；一階導(dǎo)數(shù)和二階導(dǎo)數(shù)分別用于消除光譜中基線的平移和漂移(散射)可有效消除其他背景的干擾，分辨重疊峰提高分辨率和靈敏度；SNV和MSC用于消除由樣品顆粒分布不均勻、顆粒大小不同產(chǎn)生的散射對(duì)其光譜的影響[11,25-26]。不同處理模型，訓(xùn)練集模型內(nèi)部預(yù)測(cè)能力以參數(shù)Rcal2、RMSEE衡量，Rcal2越接近1，RMSEE越小表示模型擬合能力越佳。預(yù)測(cè)集數(shù)據(jù)用于對(duì)模型預(yù)測(cè)能力進(jìn)行外部驗(yàn)證，以參數(shù)Rpre2、預(yù)測(cè)均方根誤差(Root mean square error of prediction,RMSEP)衡量，Rpre2越接近1，RMSEP越小表示模型預(yù)測(cè)效果越佳；15種模型結(jié)果見表2。結(jié)果顯示，15種模型中2D+OSC+MSC+SNV+SG5(圖3)模型預(yù)測(cè)效果較好，RMSEP均小于3.6，預(yù)測(cè)值與檢測(cè)值接近。

表1 鐵皮石斛1～12月總多糖含量

表2 不同模型的參數(shù)和結(jié)果

圖2 2D+OSC+MSC+SNV+SG5-PLSR模型的訓(xùn)練集擬合結(jié)果

圖3 2D+OSC+MSC+SNV+SG5-PLSR模型的預(yù)測(cè)集擬合結(jié)果

3 結(jié)論

傅里葉變換紅外光譜結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)能快速預(yù)測(cè)鐵皮石斛中總多糖，為市售鐵皮石斛質(zhì)量控制提供了一種快速方法。樣品原始光譜經(jīng)自動(dòng)基線校正、平滑、縱坐標(biāo)歸一化后用2D+OSC+MSC+SNV+SG5建立的偏最小二乘模型的Rpre2大于0.782，RMSEP小于3.56能夠較好地預(yù)測(cè)鐵皮石斛中總多糖的含量?？偠嗵菧y(cè)量值反映總多糖含量隨時(shí)間的累積先上升后降低，最高值與鐵皮石斛采收時(shí)間相吻合。從圖2和圖3中可以看出：偏離的擬合曲線方程的38、40、41號(hào)樣品分別隸屬4和5月份，排除人為和儀器誤差外，測(cè)量值偏離預(yù)測(cè)值，表示該月份樣品差異較大，生長(zhǎng)波動(dòng)激烈，從側(cè)面表現(xiàn)了該組樣品的標(biāo)準(zhǔn)差較大。由于試驗(yàn)材料的限制，僅采集了云南省玉溪市的鐵皮石斛樣品，不同生長(zhǎng)環(huán)境條件下鐵皮石斛中總多糖的變化趨勢(shì)是否能與之相同有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

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