□ 趙曉政 中國科學(xué)院納米科學(xué)卓越創(chuàng)新中心

牛初乳是母牛正常分娩后最初幾天內(nèi)所分泌的乳汁，其富含多種免疫因子和生長因子等生理功能性成分，具有常乳無法比擬的優(yōu)點(diǎn)。人類食用牛初乳的歷史可以追溯到幾千年前，古印度的文獻(xiàn)中就有民間將牛初乳果糖視為靈丹妙藥的記錄。20世紀(jì)90年代，我國也出現(xiàn)了一些強(qiáng)化牛初乳的乳品。人類長期攝人牛初乳從客觀上驗(yàn)證了其食用的安全性，但仍缺乏相關(guān)的系統(tǒng)性研究，其毒理學(xué)方面的研究也鮮有文獻(xiàn)報(bào)道。本研究依據(jù)《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》（2003版）的要求，通過對(duì)牛初乳粉產(chǎn)品進(jìn)行急性毒性試驗(yàn)、鼠傷寒沙門氏菌/哺乳動(dòng)物肝微粒體酶試驗(yàn)（Ames試驗(yàn)）、小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)、小鼠精子畸形試驗(yàn)和30天喂養(yǎng)試驗(yàn)，對(duì)牛初乳粉的安全性進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1 材料與方法

1.1 受試物

牛初乳粉，由黑龍江省康普生物科技有限公司提供，免疫球蛋白IgG的含量為26%，呈乳黃色粉末狀，感官檢查未見異常。該牛初乳粉樣品推薦用量為每日1次，每次1袋，每袋1g，因此每人每日用量為1g（含0.26g免疫球蛋白IgG）。如成人體重按60kg計(jì)，則推薦用量為0.017g/kg·BW。1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及實(shí)驗(yàn)室環(huán)境

SPF級(jí)ICR小白鼠和SPF級(jí)Wistar品系大白鼠（均由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供）在SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心（屏障環(huán)境）飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)期間實(shí)驗(yàn)室環(huán)境溫度為21～23℃，濕度為55%～58%。

1.3 試驗(yàn)方法

依據(jù)《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》（2003版）中毒理學(xué)評(píng)價(jià)程序進(jìn)行安全性毒理學(xué)評(píng)價(jià)試驗(yàn)，具體試驗(yàn)項(xiàng)目為急性毒性試驗(yàn)、鼠傷寒沙門氏菌/哺乳動(dòng)物肝微粒體酶試驗(yàn)（Ames試驗(yàn)）、小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)、小鼠精子畸形試驗(yàn)和30天喂養(yǎng)試驗(yàn)。

1.3.1 急性毒性實(shí)驗(yàn)

選用體重為18～22g的ICR小鼠20只，雌雄各半。采用最大耐受量法進(jìn)行試驗(yàn)，小鼠禁食16h后，在24h內(nèi)兩次經(jīng)口灌胃。稱取樣品25.0g加蒸餾水到100mL，達(dá)到最大可灌胃濃度，灌胃容量為20mL/kg·BW，一次最大灌胃劑量為5.0g/kg·BW，因此灌胃劑量累計(jì)為10.0g/kg·BW（相當(dāng)于推薦劑量的588倍）。灌胃后連續(xù)觀察14天，記錄小鼠的中毒表現(xiàn)及死亡情況。

1.3.2 Ames試驗(yàn)

采用平板摻入法進(jìn)行試驗(yàn)：選用符合要求的 TA97、TA98、TA100、TA102這4株菌株，采用多氯聯(lián)苯（PCB）誘導(dǎo)的大鼠肝勻漿作為體外代謝活化系統(tǒng)。樣品劑量設(shè)計(jì)為5000、1000、200、40、8μg/ 皿，設(shè)自發(fā)回變、溶劑對(duì)照（溶劑二甲基亞砜）和陽性對(duì)照[加S-9用2-AF(TA102用1,8-二羥蒽醌)，不加S-9用DEXON（TA100用疊氮鈉）]。每個(gè)劑量組做3皿，在相同試驗(yàn)條件下重復(fù)做2次。

1.3.3 骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)

選用體重為25～30g的ICR小鼠50只，按體重隨機(jī)分為5組，每組10只，雌雄各半。設(shè)低、中、高3個(gè)劑量組和陰性對(duì)照組及陽性對(duì)照組共5組，3個(gè)劑量組分別給予1.25、2.5和5.0g/kg·BW的受試物（分別相當(dāng)于人體推薦用量的74、147和294倍），陰性對(duì)照組經(jīng)口灌胃相同容積的蒸餾水；陽性對(duì)照組灌胃給予環(huán)磷酰胺，劑量為40.0mg/kg·BW，所有動(dòng)物按體重的20mL/kg·BW進(jìn)行灌胃。采用30h給受試物法，間隔24h兩次經(jīng)口灌胃進(jìn)行試驗(yàn)。

1.3.4 小鼠精子畸形試驗(yàn)

選用體重為25～30g的ICR雄性小白鼠25只，隨機(jī)分成5組，每組5只。設(shè)低、中、高3個(gè)劑量組和陰性對(duì)照組及陽性對(duì)照組共5組，3個(gè)劑量組分別給予1.25、2.5和5.0g/kg·BW的受試物（分別相當(dāng)于人體推薦劑量的74、147和 294倍），陰性對(duì)照組經(jīng)口灌胃相同容積的蒸餾水；陽性對(duì)照組灌胃給予環(huán)磷酰胺，劑量為40.0mg/kg·BW。所有動(dòng)物按體重的20mL/kg·BW進(jìn)行灌胃。每日一次，連續(xù)5天。制片后，每只小鼠鏡檢1000個(gè)完整精子，計(jì)算畸形率。

1.3.5 30天喂養(yǎng)試驗(yàn)

選用體重為60～90g剛斷乳Wistar大鼠80只，隨機(jī)分成4組，每組20只，雌雄各半。其中3組為試驗(yàn)組，在基礎(chǔ)飼料中加入不同劑量的樣品，劑量設(shè)計(jì)：低、中、高劑量分別為0.43、1.28、1.7g/kg·BW（相當(dāng)于人體推薦劑量的25、75和100倍），攝食量以體重的10%計(jì)算；一組為空白對(duì)照組，給予基礎(chǔ)飼料。各組動(dòng)物單籠喂養(yǎng)，自由攝食、飲水，連續(xù)喂養(yǎng)30天。每天觀察并記錄Wistar大鼠的一般表現(xiàn)、行為和生長情況，每周記錄一次體重和兩次進(jìn)食量，計(jì)算食物利用率。試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，采血檢測(cè)血液學(xué)指標(biāo)，包括血紅蛋白含量、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、血小板計(jì)數(shù)、白細(xì)胞計(jì)數(shù)及其分類；檢測(cè)生化指標(biāo)，包括谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、尿素氮（BUN）、肌酐（Cre）、血糖（Glu）、血清白蛋白（ALb）、總蛋白（TP）、總膽固醇（TCH）和甘油三酯（TG）；剖開大鼠腹部，取出肝、腎、脾、睪丸或卵巢并稱重，計(jì)算臟/體比，并對(duì)高劑量組和對(duì)照組動(dòng)物的肝、腎、脾、胃腸、睪丸及卵巢等臟器做組織病理學(xué)檢查。

1.4 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析

對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。先對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，若方差齊，采用單因素方差分析法進(jìn)行總體比較，若發(fā)現(xiàn)差異顯著，再對(duì)各劑量組與對(duì)照組進(jìn)行均數(shù)t檢驗(yàn)；若方差不齊，則對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行適當(dāng)?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換，滿足正態(tài)或方差齊的要求后，對(duì)轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，若變量轉(zhuǎn)換后仍未達(dá)到方差齊的目的，改用秩和檢驗(yàn)方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 急性毒性試驗(yàn)

小鼠經(jīng)口灌胃后，在14天的觀察期內(nèi)，兩性別小鼠狀態(tài)良好，未出現(xiàn)任何中毒癥狀，無動(dòng)物死亡。根據(jù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)劑量所觀察到的結(jié)果及小鼠急性毒性判定標(biāo)準(zhǔn)，可以認(rèn)為牛初乳粉經(jīng)口最大耐受量大于10.0g/kg·BW（相對(duì)于人體推薦量的588倍），屬實(shí)際無毒物質(zhì)。

2.2 Ames試驗(yàn)

在相同實(shí)驗(yàn)條件下重復(fù)做2次實(shí)驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果表明，5000、1000、200、40、8μg/皿劑量的各試驗(yàn)組，不論是否加S-9活化系統(tǒng)，受試樣品各試驗(yàn)組回變菌落數(shù)均未超過溶劑對(duì)照組回變菌落數(shù)的2倍，而陽性對(duì)照組則呈明顯的強(qiáng)陽性，表示牛初乳粉對(duì)Ames試驗(yàn)菌株無致突變性。

2.3 骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)

低、中、高劑量組雌性小鼠的骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核率分別為1.6‰、1.6‰和1.4‰，雄性小鼠為1.6‰、1.8‰和1.6‰；陰性對(duì)照組微核率：雌性小鼠為1.6‰，雄性小鼠為1.4‰。經(jīng)卡方檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析，各劑量組小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核率與陰性對(duì)照組相比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；陽性對(duì)照組微核率雌性小鼠為19.4‰，雄性小鼠為21.0‰，明顯高于陰性對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。這表明受試物在受試劑量范圍內(nèi)對(duì)小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核率無影響，小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核試驗(yàn)結(jié)果為陰性。

2.4 小鼠精子畸形試驗(yàn)

結(jié)果顯示，各組小鼠均可見到一定數(shù)量的畸形精子，低、中、高劑量組雄性小鼠精子畸形率分別為22.2%、20.0%和20.6%，陰性對(duì)照組為21.2%，陽性對(duì)照組為61.2%。經(jīng)秩和檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)方法分析，低、中、高劑量組小鼠精子畸形率與陰性對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；而給予環(huán)磷酰胺的陽性對(duì)照組與陰性對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。這表明受試物在受試劑量范圍內(nèi)對(duì)小鼠精子畸形率無影響，小鼠精子畸形試驗(yàn)結(jié)果為陰性。

2.5 30天喂養(yǎng)試驗(yàn)

喂養(yǎng)期間各劑量組大鼠的狀況良好，行為正常，未見任何中毒表現(xiàn)，亦無死亡。各劑量組不同階段大鼠的體重、進(jìn)食、食物利用率及30天總增重、總進(jìn)食、總食物利用率與空白對(duì)照組相比較，均無顯著性差異（P＞0.05）；血液學(xué)指標(biāo)及生化指標(biāo)均在正常值范圍內(nèi)，各劑量組與空白對(duì)照組相比較，均無顯著性差異（P＞0.05）；各劑量組主要臟器重量、各臟體比與空白對(duì)照組相比較，均無顯著性差異（P＞0.05）；各劑量組大鼠解剖后通過肉眼檢查，各臟器均未見明顯異常；組織病理學(xué)檢查各劑量組大鼠的肝、脾、腎、胃、腸、睪丸、卵巢與空白對(duì)照組相比較，均未見與受試物作用有關(guān)的病理學(xué)改變。

3 小結(jié)

牛初乳粉對(duì)雌雄小鼠的經(jīng)口急性毒性最大耐受劑量均大于10g/kg·BW（相對(duì)于人體推薦量的588倍），屬實(shí)際無毒級(jí)；Ames試驗(yàn)、小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)、小鼠精子畸形試驗(yàn)結(jié)果均為陰性；30天喂養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果顯示，受試物對(duì)大鼠的各項(xiàng)觀察指標(biāo)均未產(chǎn)生明顯的毒性損害。綜上所述，受試物按本試驗(yàn)提供的劑量給予實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，對(duì)大、小鼠的各項(xiàng)觀察指標(biāo)均未產(chǎn)生明顯毒性作用，表明牛初乳粉對(duì)哺乳動(dòng)物無明顯的毒性作用，可放心食用。