楊振立，李 旸，吳志明，蔣楚燕，董文琦*

（1.河北省農(nóng)林科學(xué)院，河北 石家莊 050031；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)，北京 100193）

蚜蟲是繁殖最快的昆蟲，在地球上為害作物廣泛，還是植物病原體的傳播介體（占已知傳播病毒昆蟲種類的45.8%[1]），其分泌物是人類呼吸道主要的過敏源，嚴重破壞城鄉(xiāng)生活環(huán)境。蚜蟲較難防治，主要原因在于其防御機制：有的種類能夠分泌植物激素，使植物形成癭瘤巢；有的分泌一層蠟質(zhì)覆蓋于體表，令藥物難以滲入；有的釋放強烈的芥末油氣味，嚇跑天敵[2]。

園林景觀和城鄉(xiāng)綠地是人群較為集中的地方，當前在防治蚜蟲過程中常使用化學(xué)藥劑噴霧法[3]。而化學(xué)噴霧法雖然見效快，但副作用明顯，尤其是污染環(huán)境后對人和動物身體健康都有不利影響。對于非食用的觀賞植物，我們可以選擇轉(zhuǎn)基因的抗蚜途徑。相關(guān)研究主要集中在抗蚜基因、抗蚜資源和抗蚜生物藥劑等方面。

1 植物抗蚜的研究現(xiàn)狀

1.1 抗蚜基因克隆

抗蚜資源多存在于野生種或近源種中[4]。國外研究顯示，在3 500個大豆種質(zhì)中僅篩選到11個抗源[5]，在1 200個萵苣種質(zhì)中篩選到2個抗源[6]，在4萬個小麥資源中僅300個表現(xiàn)抗性[7]。植物對昆蟲的抗性一般可分為驅(qū)避性、抗生性和耐害性3種類型，其中抗生性作用最明顯，又包括多基因控制和單顯（隱）基因控制，如小麥對麥雙尾蚜（Diuraphis noxia Mordvilko） 的抗性、大豆對大豆蚜（Aphis glycines Matsumura） 的抗性是單顯基因控制[8]；但在小麥和大麥中也發(fā)現(xiàn)了用于對付豌豆蚜（Acythosiphon pisum Harris）、玉米蚜 （Rhopalosiphum maidis Fitch） 的隱性抗蚜基因，數(shù)量性狀控制的抗性更多[9]。理論上只有單顯基因控制的抗性才有利于通過基因克隆和轉(zhuǎn)化應(yīng)用于其他物種上，而更多的資源適用于本作物的遠源雜交或常規(guī)育種。隨著植物基因組學(xué)和功能基因組學(xué)的發(fā)展，分離克隆抗蚜基因的能力日益增強[10]，一些抗蚜基因被克隆出來，如Mi-1可抗大戟長管蚜（Macrosiphum euphorbiae）[11]、Vat可抗甜瓜棉蚜（Aphis gossypii Glover）[12]，這類抗蚜基因一般與植物超敏反應(yīng)有關(guān)，即對應(yīng)植物能識別被蚜蟲入侵的信號，以合成酚類物質(zhì)、在細胞壁上沉積胼胝質(zhì)或木質(zhì)素等方式對抗蚜蟲。目前雖然已有抗蚜基因被克隆，但是蚜蟲種類很多，而一種基因可抗的蚜蟲種類過少，因此，遠遠不能滿足園藝上生物防治的需要。

1.2 高抗蚜資源挖掘

掌葉半夏是一種天然高抗蚜、無特殊味道的中草藥，從20世紀90年代起人們嘗試分離半夏的抗蟲活性物質(zhì)，初步研究后認為主要作用是由植物凝集素形成的，河北省農(nóng)林科學(xué)院研究團隊從中克隆出了PPA-1、PTA-1等多個基因[13]。凝集素的抗蟲活性依賴與糖結(jié)合，而糖鏈很難利用轉(zhuǎn)基因的方式進行正確表達[14]。2010年范漢東等[15]從半夏塊莖總蛋白中發(fā)現(xiàn)了新的抗蚜活性物質(zhì)，該物質(zhì)屬于植物胰蛋白酶抑制劑（Pinellia peatisecta trypsin inhibitor，以下稱PPTI蛋白或PPTI基因） 類型，濃度達到0.5%時5 d后蚜蟲的校正死亡率達到100%。更為重要的是經(jīng)SDSPAGE、反相高效液相色譜測算該物質(zhì)為不含糖的純蛋白，質(zhì)譜分析顯示其相對分子量為20 596.09。PPTI蛋白與其它種類抗蟲活性蛋白相比具有以下3個優(yōu)點[16，17]：（1） 其是純蛋白質(zhì)作用的結(jié)果，相較于依賴與糖結(jié)合的凝聚素家族，基因更容易構(gòu)建轉(zhuǎn)化載體，應(yīng)用植物范圍廣；（2）蛋白酶抑制劑一般具有更廣譜的抗蟲性，因此推測PPTI蛋白對多種蚜蟲會有抗性；（3）昆蟲不易產(chǎn)生對蛋白抑制劑的耐受性。人們進一步研究發(fā)現(xiàn)，在掌葉半夏葉片部位可由機械損傷和病蟲侵入誘導(dǎo)高濃度表達此類蛋白。

1.3 蛋白酶抑制劑研究

前人對此已有很多研究，如達克東等[18]和周瑞蘇等[19]系統(tǒng)研究了用豇豆CpTI轉(zhuǎn)化蘋果，60個轉(zhuǎn)化株系中有2個對棉鈴蟲的抗性達到了100%；Yuan Ma等[20]研究了蟲害誘導(dǎo)楊樹胰蛋白酶KTI基因過量表達情況，明確了楊樹KTI基因家族的功能多樣性及其抗病抗蟲作用。徐平麗等[21]從小麥中克隆到一個BBI型蛋白酶抑制劑TaUES基因，并證明其參與了鹽和干旱脅迫應(yīng)答。目前在植物中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有三大類蛋白酶抑制劑——絲氨酸蛋白酶抑制劑、琉基蛋白酶抑制劑和金屬蛋白酶抑制劑，PPTI蛋白屬于第一類。絲氨酸蛋白酶抑制劑也已至少發(fā)現(xiàn)有6個家族，但只有部分成員具有較強抗性功能，除了以上幾個以外，還有弧豆、馬鈴薯的蛋白酶抑制劑等，但已發(fā)現(xiàn)的蛋白酶抑制劑對抗逆境種類和作用效果千差萬別?，F(xiàn)有毒性的蛋白酶抑制劑基因搭配組成型啟動子的轉(zhuǎn)基因植物，其蛋白酶抑制劑表達量仍然較低，一般達不到蚜蟲的致死劑量。

綜上所述，從國內(nèi)外抗蚜基礎(chǔ)研究現(xiàn)狀來看，存在以下4個問題：（1）植物對蚜蟲的抗性機制很復(fù)雜，可用的單顯抗生性基因很少；（2） 蚜蟲種類很多，現(xiàn)有基因抗蚜種類過于單一；（3） 廣譜的植物凝集素因大多含有糖鏈，而用基因工程的方法很難表達正確的糖鏈；（4）現(xiàn)有毒性的蛋白酶抑制劑基因搭配組成型啟動子的轉(zhuǎn)基因植物，一般達不到致死劑量。目前，真正有效的無公害防治蚜蟲機制還未建成。

2 植物抗蚜的發(fā)展趨勢

植物在遭受到昆蟲取食時，就會產(chǎn)生防御反應(yīng)，合成對攻擊者有毒的防御物質(zhì)，這是生物害蟲無公害防治的基本原理[22，23]，也是抗蚜研究的主要趨勢。掌葉半夏本身沒有特殊氣味，卻一直都保持很強的對各類蚜蟲的抗性，是掌葉半夏PPTI具有更強的抗性，還是有更多的物質(zhì)參與其中？目前，蛋白酶抑制劑基因抑制昆蟲生長發(fā)育的機制尚未達成共識[22，24]，但大多數(shù)研究者認為抑制機制主要表現(xiàn)在2個方面。一方面，蛋白酶抑制劑被攝入昆蟲體內(nèi)后與昆蟲腸道內(nèi)蛋白酶的活性部位或變構(gòu)部位結(jié)合，使昆蟲腸道內(nèi)蛋白酶失去原有活性，昆蟲不能得到足夠的營養(yǎng)。趙飛等[25]研究了9種絲氨酸蛋白酶抑制劑的三維結(jié)構(gòu)，從活性區(qū)拉式角（二面角）取向與對應(yīng)物二面角取向的角度演示了二者相互作用的機制，提出為抑制劑分類的“標準機制”。但對于造成不同植物胰蛋白酶抑制劑間抗蟲性能差異的原因，我們知之不多。另一方面，蛋白酶抑制劑刺激昆蟲過量分泌消化酶，通過神經(jīng)反饋，使昆蟲產(chǎn)生厭食反應(yīng)，昆蟲不能攝取足夠的營養(yǎng)。對此方面研究能夠支撐的實證更少，很有必要進一步研究明確或補充其機理，用于提高蛋白酶抑制劑的抗蚜效果、指導(dǎo)觀賞植物的治蚜實踐。因此，研究掌葉半夏PPTI在觀賞植物上的抗蚜功能、完善其抗蚜機制成為該趨勢的關(guān)鍵所在。

3 PPTI的應(yīng)用分析

3.1 觀賞植物選擇

月季（Rosa Chinenses） 是觀賞植物的代表，為全球重要的觀賞植物之一，被廣泛應(yīng)用于城鄉(xiāng)綠化。在我國包括北京、天津和石家莊等在內(nèi)的近50個城市將月季定為“市花”，而月季在生長季節(jié)中遭受蚜蟲為害很嚴重，雖然月季的組織培養(yǎng)和再生系統(tǒng)較為成熟[26]，但是其抗蚜蟲基因轉(zhuǎn)化尚未見報道?？梢钥闯?，PPTI率先在月季上應(yīng)用的條件已經(jīng)具備。從克隆掌葉半夏高性能基因開始，探究其抗蚜機理，進行體內(nèi)、外抗蚜蟲功能分析和轉(zhuǎn)化應(yīng)用途徑研究，就可以用基因改造的方法解決蚜蟲在觀賞植物上較難防治的問題。

3.2 重點研究內(nèi)容

開展PPTI相關(guān)的功能及其抗性機制研究，利用PPTI蛋白進行酵母表達和抗蟲范圍測定，將PPTI與綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP） 進行融合表達，進行蚜蟲腸道內(nèi)定位和功能分析，同時采用酵母雙雜交技術(shù)篩選出與PPTI互作的所有蚜蟲蛋白，通過分析互作蛋白與PPTI結(jié)合后引起的反應(yīng)，進一步完善抗蚜蟲機制；通過轉(zhuǎn)化月季獲得高抗蚜蟲的新種質(zhì)，并利用基因改造、同源基因沉默等方法探究提升轉(zhuǎn)基因植株內(nèi)PPTI含量的方法。本研究的意義一方面可用于指導(dǎo)觀賞園藝植物創(chuàng)制抗蚜新種質(zhì)、新品種，另一方面也為高效、低毒、抗蚜生物殺蚜劑的研發(fā)奠定基礎(chǔ)，PPTI后續(xù)研究進展對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和環(huán)境改善具有重要的理論和現(xiàn)實意義。